АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол предлагает систематическую основу для создания органоидов рака яичников на разных стадиях заболевания и решает проблемы вариабельности для конкретного пациента для увеличения выхода и обеспечения надежного долгосрочного расширения для последующего применения. Он включает в себя подробные этапы обработки тканей, посева, корректировки требований к среде и иммунофлуоресцентного окрашивания.

Аннотация

В то время как создание биобанка по раку яичников из органоидов, полученных от пациентов, вместе с их клинической информацией обещает прогресс в исследованиях и уходе за пациентами, стандартизация остается проблемой из-за гетерогенности этого смертельного злокачественного новообразования в сочетании со сложностью, присущей органоидной технологии. Этот адаптируемый протокол обеспечивает систематическую основу для реализации всего потенциала органоидов рака яичников с учетом специфической для пациента вариабельности предшественников. Реализуя структурированный экспериментальный рабочий процесс для выбора оптимальных условий культивирования и методов посева, с параллельным тестированием прямого 3D-посева по сравнению с 2D/3D-маршрутом, мы получаем, в большинстве случаев, надежные длительные расширяющиеся линии, подходящие для широкого спектра последующих применений.

Следует отметить, что протокол был протестирован и доказал свою эффективность в большом количестве случаев (N = 120) высокогетерогенного исходного материала, включая высокодифференцированный и низкодифференцированный рак яичников и стадии заболевания с первичным дефолдингом, рецидивирующим заболеванием и постнеоадъювантными хирургическими препаратами. В экзогенной сигнальной среде с низким Wnt и высоким BMP мы наблюдали, что предшественники по-разному восприимчивы к активации Heregulin 1ß (HERß-1)-пути, при этом HERß-1 способствовал образованию органоидов в одних и ингибировал его в других. Для подмножества образцов пациента оптимальное формирование органоидов и долгосрочный рост требуют добавления в среду фактора роста фибробластов 10 и R-спондина 1.

Кроме того, мы выделяем важнейшие этапы расщепления тканей и выделения предшественников, а также указываем на примеры, когда кратковременное культивирование в 2D на пластике полезно для последующего формирования органоидов в матрице Basement Membrane Extract типа 2. В целом, оптимальный биобанкинг требует систематического тестирования всех основных условий параллельно, чтобы определить адекватную среду роста для отдельных линий. Протокол также описывает процедуру обработки для эффективного встраивания, секционирования и окрашивания для получения изображений органоидов с высоким разрешением, что необходимо для комплексного фенотипирования.

Введение

Клиническое ведение пациенток с эпителиальным раком яичников остается сложной задачей из-за его гетерогенной клинической картины на поздних стадиях ивысокой частоты рецидивов1. Для улучшения нашего понимания развития рака яичников и его биологического поведения необходимы исследовательские подходы, учитывающие специфическую для пациента вариабельность течения заболевания, ответ на лечение, а также гистопатологические и молекулярныеособенности.

Биобанкинг, характеризующийся систематическим сбором и долгосрочным сохранением образцов опухолей, полученных от пациенток с раком яичников, вместе с их клинической информацией, позволяет сохранить большую когорту пациентов на разных стадиях заболевания, включая образцы опухолей после первичных операций по удалению объема, после неоадъювантной химиотерапии и от рецидивирующего заболевания. Она обладает ценным потенциалом для продвижения исследований рака, выступая в качестве ресурса перспективных прогностических биомаркеров и терапевтических мишеней3. Однако традиционные методы биобанкинга, такие как фиксация формалина и замораживание, не поддаются проведению функциональных исследований на исходных образцах опухоли из-за потери жизнеспособности и нарушения нативной трехмерной архитектуры ткани 4,5.

Исследования молекулярных механизмов, как в онкологии, так и за ее пределами, в решающей степени зависят от использования соответствующих экспериментальных моделей, которые точно отражают биологию заболевания и сохраняют свойства in vitro ткани, наблюдаемые in vivo. Органоиды, полученные от пациентов, основанные на сохранении потенциала обновления, воспроизводят в лаборатории первоначальную структуру и функцию эпителия и позволяют проводить тестирование в индивидуальном для пациента контексте. Таким образом, они стали весьма перспективными инструментами для исследования рака и персонализированной медицины, преодолевая разрыв между клиническим разнообразием и лабораторными исследованиями 6,7,8,9. Индивидуальные терапевтические стратегии, основанные на индивидуальных лекарственных реакциях органоидных линий и тестировании функциональной значимости молекулярных профилей, потенциально могут быть непосредственно применены к уходу за пациентами10,11. Возможность долгосрочного культивирования, включая специфические характеристики пациента и сбор соответствующих проспективных клинических данных с течением времени, открывает большие перспективы для выявления новых прогностических и прогностических факторов, участвующих в прогрессировании заболевания и механизмах резистентности 3,9.

Тем не менее, создание биобанка, включающего органоиды из различных образцов опухолей, требует сочетания строгого соблюдения сложной методологии и создания протоколов для легкого обслуживания12. Стандартизация процессов гарантирует, что обученный персонал может эффективно создавать и поддерживать биобанк даже при высокой текучести кадров, в то же время придерживаясь самых высоких стандартов качества13. В нескольких исследованиях сообщалось об успешном создании стабильных органоидных линий рака яичников, соответствующих мутационному и фенотипическому профилю исходной опухоли с различными показателями эффективности. Тем не менее, рутинный биобанкинг остается сложной задачей на практике, особенно для долгосрочного стабильного роста линий, что является предпосылкой для крупномасштабного расширения или успешного редактирования генома.

В частности, вопрос о расширяемости остается расплывчатым в этой области, поскольку органоиды, демонстрирующие медленный и ограниченный потенциал роста, иногда считаются устоявшимися линиями. Как было первоначально продемонстрировано Hoffmann et al., исследованием, основные результаты которого легли в основу этого дальнейшего разработанного протокола, оптимальное обращение с тканью рака яичников требует уникальной стратегии для учета гетерогенности14. Фенотипическая характеристика органоидов, полученных этим методом, и близкое сходство с родительской опухолевой тканью были подтверждены панельным секвенированием ДНК и транскриптомным анализом зрелых культур (4-10 месяцев культивирования), демонстрирующими стабильность модели 8,9,12,14.

В отличие от паракринной среды, которая регулирует гомеостаз в здоровых фаллопиевых трубах, эпителиальный слой, который, вероятно, приводит к высокодифференцированному серозному раку яичников (HGSOC), потенциалу регенерации рака и способности к образованию органоидов, меньше зависит от экзогенных добавок Wnt. Кроме того, активная передача сигналов костного морфогенетического белка (BMP), характеризующаяся отсутствием ноггина в органоидной среде, оказалась полезной для установления долгосрочных культур из отложений твердых тканей рака яичников14,15. В ходе систематического биобанкирования солидных отложений рака яичников мы подтвердили эти результаты и создали конвейер с деталями, изложенными в этом протоколе, который обеспечивает устойчивое долгосрочное расширение в большинстве случаев. Мы обнаружили, что параллельное тестирование различных составов сред и способов посева при работе с первичными изолятами имеет важное значение для улучшения установления долгосрочных стабильных органоидных линий и повышения урожайности, обеспечивая надежное распространение и расширение до многолуночных форматов, необходимых для последующих экспериментов16.

Кроме того, чистота и качество образцов, собранных во время операции, имеют решающее значение для трансляционного потенциала органоидов рака яичников в фундаментальных исследованиях и молекулярной диагностике. Сложность клинической картины HGSOC требует тесного сотрудничества между хирургами, онкологами и учеными в лаборатории, чтобы гарантировать, что соответствующий материал правильно идентифицирован, условия транспортировки поддерживаются постоянными, а органоидные линии генерируются с высокой эффективностью, представляя наиболее важные характеристики заболевания каждого пациента. Этот протокол обеспечивает стандартизированную, но адаптируемую структуру для охвата всего потенциала органоидов рака яичников, учитывая гетерогенность, характерную для рака яичников 16,17. Примечательно, что этот протокол обеспечивает надежное биобанкирование широкого спектра клинической картины рака яичников, включая различные гистологические типы (высокодифференцированный и низкодифференцированный рак яичников, LGSOC), различные отложения от одних и тех же пациенток, которые демонстрируют различия в регуляции стволовой ткани, ткани от операций в пост-неоадъювантных условиях, биопсийный материал и образцы от операций в рецидивирующей фазе прогрессирования заболевания.

протокол

Образцы опухолевых тканей после операций по поводу рака яичников были собраны и получены органоиды, полученные от пациентов, в соответствии с Комитетом по этике Университета LMU (17-471), в соответствии с существующими применимыми нормами ЕС, национальными и местными правилами. Каждый пациент, участвовавший в исследовании, дал согласие в письменной форме. При работе со свежими образцами тканей требуется разрешение на безопасность уровня биобезопасности 2 и шкафы Laminar Flow. Учитывая потенциально инфекционную природу образцов тканей, которую нельзя исключать из-за отсутствия регулярного тестирования на соответствующие инфекционные заболевания, необходимо обеспечить строгое соблюдение институциональных правил биобезопасности и наличие соответствующих средств индивидуальной защиты для персонала, проводящего эксперименты.

1. Подготовка

  1. Подготовка среды
    1. Раз в неделю подготавливайте 2D- и 3D-носители свежими и храните их при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точный состав ингредиентов для каждой среды указан в таблице 1. Как среда рака яичников 1 (OCM1), так и OCM2 могут быть дополнительно дополнены HER1ß (конечная концентрация: 50 нг/мл), что приводит к четырем различным состояниям: OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß.
    2. Создают исходные растворы реагентов фактора роста и выдерживают их при температуре 20 °С, а также А83-01 и никотинамида (хранение при +4 °С). Из-за температурной чувствительности факторов роста следует немедленно использовать растворы талой массы для приготовления среды и избегать повторных циклов размораживания путем создания аликвот.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка материала является критически важным этапом, который необходимо строго контролировать.
    3. Приготовление кондиционированной среды РСПО-1
      1. Быстро размораживайте Т-клетки HA-R-Spondin1-Fc 293 (хранение при -80 °C) при 37 °C. Промывают их 10 мл базальной питательной среды с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS), далее именуемой базальной питательной средой++.
      2. Ресуспендант клеточной гранулы в 12 мл базальной питательной среды ++ и высевают ее в колбу Т75.
      3. Расщепить клетки в соотношении 1:6 с реагентом для диссоциации, содержащим трипсин (4 мин при 37 °C), когда клетки достигнут слияния. Посейте их в новую колбу T75.
      4. На следующий день добавьте в среду флеомицин D1 (1,25 мкл/мл).
      5. Расщепить клетки в соотношении 1:20 с трипсином (4 мин при 37 °C), когда клетки достигнут слияния. Высевают клетки в несколько колб Т75 (количество колб в соответствии с целевым конечным объемом) в 30 мл базальной питательной среды++ (содержащей 10 % FCS) с добавлением флеомицина D1.
      6. Начните производство кондиционированной среды, когда клетки достигнут примерно 50% слияния: замените среду 40 мл базальной питательной среды с добавлением 5% FCS без фломицина D1.
      7. Соберите первую надосадочную жидкость через 3 дня. Для удаления мусора центрифугу в течение 10 мин при 1 200 × г. Храните надосадочную жидкость в стерильном контейнере при температуре 4 °C.
      8. Добавьте в клетки новую базальную питательную среду, дополненную 5% FCS. Собирают вторую надосадочную жидкость через 3-4 дня. Центрифуга в течение 10 мин при 1 200 × г. Добавьте вторую надосадочную жидкость к первой.
      9. Процедите кондиционированную среду с помощью фильтра 0,2 мкм.
      10. Для контроля качества и количественного определения RSPO1 полученную среду добавляют к клеточной линии 293T (293T WntR, 7xTcf-eGFP)14, стабильно трансдуцируемой GFP-плазмидой, несущей Wnt-репортер18.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от количества и интенсивности сигнала GFP активность RSPO1 в качестве агониста пути Wnt проверяется путем количественного определения репортерной клеточной линии Wnt.
      11. Хранить аликвоты по 15 мл для немедленного использования (в течение 1 недели) при температуре 4 °C. Для более длительного хранения (6 месяцев) поддерживайте кондиционированную среду при температуре -20 °C.

2. Инициация органоидного посева рака яичников

  1. Первичная изоляция тканей
    1. Транспортировать свежую и жизнеспособную ткань желательно сразу после операции и проводить изоляцию в течение максимум 20 часов после забора. Обеспечьте надлежащие условия транспортировки в среде для сбора тканей с помощью транспортировочного ящика, оснащенного холодными компрессами при температуре около 4 °C.
    2. В лаборатории подготовьте необходимые реактивы и оборудование, чтобы облегчить своевременную обработку проб:
      1. Разморозьте матрицу Basement Membrane Extract Type II (матрица BME 2) на льду (примерно 2 часа).
      2. Подготовьте одноразовые скальпели, стерилизованные инструменты для вскрытия (ножницы и пинцет) и фильтрующие вкладыши размером 400 мкм для пробирок объемом 50 мл.
      3. Подготовьте емкость с небольшим количеством жидкого азота для мгновенной заморозки и предварительно подогретую водяную баню при 37 °С.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте в ламинарном колпаке для клеточных культур.
    3. Тщательно вымойте свежую ткань в чашке Петри в фосфатно-солевом буфере (PBS) (без Ca++ и Mg++). Внутри чашки Петри фрагментируйте ткань с помощью одноразовых скальпелей и/или ножниц на небольшие кусочки размером 3-5 мм.
    4. Полученную ткань разделяют на три участка для следующих целей:
      1. Соберите ткани в криогенные пробирки. Переложите криогенные пробирки в подготовленную емкость, наполненную жидким азотом для шоковой заморозки.
      2. Собирают ткани (2-3 мм) в контейнер для гистологического образца, заполненный формалином для фиксации (24 ч), и помещают их в парафин с целью окрашивания19,20.
      3. Далее гомогенизируют ткани перед ферментативным расщеплением. Максимизируйте механическую диссоциацию с помощью скальпеля и перенесите его в тканевую пробирку объемом 50 мл.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ткань всегда пропитана PBS во время гомогенизации, чтобы избежать высыхания ткани.
    5. Смешайте гомогенизированную ткань со смесью для пищеварения, содержащей PBS (без Ca++ и Mg++), коллагеназу I (исходный раствор 5 ед/мкл, конечная концентрация 1 ед/мкл) и селективный ингибитор ROCK1 и 2 (конечная концентрация 3 мкМ) (компоненты, перечисленные в таблице 1). Используйте 15 мл смеси для пищеварения в пробирке объемом 50 мл на каждые 2 см3 опухоли.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ограниченный материал (например, образцы биопсии) требует только небольшого количества (примерно 2-3 мл) смеси для переваривания для обеспечения ферментативной диссоциации.
    6. Для ферментативной диссоциации инкубируют пробирку в течение 1,5 ч на водяной бане при 37 °C. Проводят спорадические и энергичные вихри (примерно каждые 20 мин в течение 10-15 с) для поддержания механической диссоциации.
    7. После инкубации добавьте в пробирку 15 мл холодной базальной культуры medium++. Центрифуга 5 мин при 300 × г.
    8. После удаления надосадочной жидкости добавляют 5 мл новой базальной культуры medium++. Процедите клеточную суспензию с помощью фильтра 400 мкм в свежую пробирку объемом 50 мл.
    9. Центрифугу в течение 5 мин при 300 × г. Удалите надосадочную жидкость и сохраните клеточную гранулу.
    10. Для удаления эритроцитов добавьте 5 мл буфера для лизирования эритроцитов (RBC) в клеточную гранулу. Выдерживают на водяной бане 5 мин при температуре 37 °С.
    11. Добавьте 5 мл базальной питательной среды++ для инактивации лизиса. Центрифугу в течение 5 мин при 300 × г. Добавьте 3 мл базальной питательной среды++ к клеточной грануле.
    12. Подсчитывают жизнеспособные клетки после разведения 1:1 раствором красителя трипанового синего (например, 10 мкл образца + 10 мкл раствора красителя трипанового синего) в автоматическом счетчике клеток или вручную в камере Нойбауэра.
    13. Рассчитайте количество ячеек, необходимых для прямого 3D-посева. Для каждого опухолевого отложения посев в 48-луночную пластину формата не менее 2-3 лунок на среду для рака яичников, что соответствует в общей сложности 8-12 лункам в затравочной матрице (OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß). Рассчитайте 30 000 ячеек для каждой лунки в капле объемом 25 мкл матрицы BME Type 2. Опционально можно выбрать 24-луночный формат с 50 мкл матрицы BME 2 и 50 000 засеянных ячеек на лунку.
    14. Заполните оставшиеся ячейки в 2D (см. шаг 2.1.13).
    15. Пипетку, количество суспензии базальной культуры medium++, содержащей общее количество необходимых клеток, помещают в новую пробирку и центрифугируют в течение 5 мин при 300 × г. Удалите надосадочную жидкость и сохраните клеточную гранулу.
    16. На льду добавьте к грануле общее количество холодной матрицы BME 2 (25 мкл на каждую лунку в 48-луночном формате; следовательно, 100 мкл на 4 лунки) и хорошо перемешайте, чтобы добиться равномерного распределения ячеек на лунку, осторожно пипетируя гранулу вверх и вниз без образования пузырьков.
    17. Высевают клетки в капли матрицы BME 2 (25 мкл) в предварительно нагретую пустую 48-луночную пластину. Чтобы добиться равномерного распределения между лунками, осторожно и медленно перемещайте пипетку вверх и вниз (3-4 раза) внутри пробирки перед переносом матричной капли BME 2 в каждую лунку, чтобы предотвратить осаждение клеток во время распределения.
    18. После инкубации планшета при 37 °C в течение не менее 30 мин для консолидации капель матрицы BME 2 пипетку по 250 мкл каждой из четырех сред для рака яичников (OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß) в соответствующие лунки.
    19. Параллельно с процедурой прямого 3D-посева сохраняйте оставшиеся изолированные клетки, запуская 2D-культуру.
      1. После центрифугирования в течение 5 мин при 300 × г добавьте гранулу в 2D-среду. Выберите формат (колба Т75 или колба Т25) в зависимости от количества ячеек, доступных после 3D-посева.
      2. Инкубируйте колбу в течение 3-5 дней при 37 °C для адгезии клеток. Держите ту же среду в течение первых 72 ч.
      3. Когда клетки достигнут слияния, переносят культуру в матрицу BME 2. Не расширяйте первичные изоляты в 2D-культуре путем расщепления, так как длительное распространение в 2D наносит ущерб потенциалу стволовидности.
  2. Переход от 2D-культуры к 3D-культуре
    1. В колбе T75 или T25 промойте монослой 2 раза 5 мл PBS, чтобы отделить клетки от нижней поверхности. Инкубируют с 1 мл трипсина в течение 10 мин при 37 °C.
    2. Добавьте 5 мл холодной базальной питательной среды++ для инактивации диссоциационного реагента. Центрифугу в течение 5 мин при 300 × г.
    3. Добавьте к грануле 3 мл базальной культуры medium++. Подсчитайте количество клеток, как описано в шагах 2.1.12-2.1.13. Начальное значение для различных композиций сред (см. рис. 1), как описано в шагах 2.1.16-2.1.18.
  3. Оценка роста органоидов
    1. Фотографируйте лунки не реже одного раза в неделю, чтобы документировать рост органоидов. Получение высококачественных сопоставимых изображений 2D/3D культур и планшетов прямого посева с помощью фазово-контрастного микроскопа. Позаботьтесь о постоянстве увеличения и используйте 4x для обзора лунок (количественная оценка) и 10x и 20x для документирования морфологии органоидов.
    2. Организуйте хранение картинок в папках, предназначенных для отдельных строк.
    3. Выберите наилучшую органоидную линию для долгосрочного культивирования путем сравнительной оценки образования органоидов при различных способах посева (2D с последующим 3D-посевом и прямым 3D-посевом) и различных составах сред (OCM1, OCM1+ HER1ß, OCM2 и OCM2+ HER1ß).
      1. В среднем, через 14-21 день после выделения оценивают органоидообразующий потенциал (количество), а также размер и клеточный фенотип органоидов, выращенных в различных условиях. Обратите внимание на следующие признаки: отсутствие вакуолей, блеблевание мембраны или потеря адгезии, округление клеток.

3. Длительное выращивание органоидов

  1. Органоидный пассаж
    1. Избегайте слишком частого расщепления органоидов и во время фазы пролиферации. Проводят процедуры механического и ферментативного сбраживания с интервалом более 10 дней.
    2. Чтобы разрушить каждую матричную каплю BME 2, добавьте 250 мкл (48-луночный формат) или 500 мкл (24-луночный формат) ледяной базальной питательной среды++. Обеспечьте полное растворение капли и пипетки периодически вверх и вниз и соскребите дно пластины. Переложите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл и поместите ее на лед. Добавьте 1 мл ледяной базальной культуры medium++.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность удаления матрицы BME 2 сильно зависит от температуры среды, так как наилучшее растворение достигается при температуре ниже 4 °C.
    3. Пул 2-3 скважины-копии для равномерного расширения. Центрифугу в течение 5 мин при 300 × г. Проверьте содержимое суспензии напротив источника света, чтобы убедиться, что гель BME 2 все еще виден. Удалите надосадочную жидкость и повторите промывку ледяной средой, если матрица BME 2 все еще видна.
    4. Инкубируют с 1 мл трипсина (хранят при 20-25 °С) на водяной бане при 37 °С в течение 7-10 мин. Вихрь спорадически в течение 10 с для усиления диссоциации. Периодически визуально осматривайте пробирку, чтобы увидеть, не прогрессирует ли диссоциация.
    5. Протяните клеточную суспензию вверх и вниз с помощью шприца через иглу размером от 23 G до 27 G. Проверьте, присутствуют ли еще крупные клеточные сгустки, и при необходимости повторите процедуру.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фрагментация через шприц не является обязательной, а размер иглы зависит от требуемой эффективности диссоциации. Однородная клеточная суспензия приводит к равномерному распределению по лункам.
    6. Добавьте 1 мл холодной базальной культуры medium++, чтобы инактивировать реакцию.
    7. НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Подсчитайте ячейки, как описано в шагах 2.1.12-2.1.13, и определите коэффициент расщепления к родительскому проходу (например, лунки 1:3).
    8. Центрифугу в течение 5 мин при 300 × г. Удалите надосадочную жидкость.
    9. Проводят посев, как описано в шагах 2.1.16-2.1.18, и применяют соответствующую оптимальную органоидную среду для рака яичников в соответствии с уже созданной многолетней культурой. Меняйте среду при раке яичников каждые 3-4 дня.
    10. В случае разрушения матричной капли BME 2 при смене среды рассмотрите возможность повторного посева без ферментативного сбраживания. Чтобы избежать разрушения капли, осторожно проводите процедуру смены среды без прямого пипетирования на матричную каплю BME 2. Кроме того, не оставляйте чрезмерное количество остаточной базальной питательной среды++ на грануле перед разбавлением матрицей BME 2 на этапе 2.1.16, так как это может повлиять на хрупкость капель.
  2. Криоконсервация органоидов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите криоконсервацию органоидов во время фазы пролиферации в первую неделю после пассажа.
    1. Разрушьте матричную каплю BME 2 ледяной базальной питательной средой++ в соответствии с этапом 3.1.2. После центрифугирования и выброса надосадочной жидкости, как описано на этапе 3.1.3., обработайте со льдом и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл ледяной среды для криоконсервации. Переложите клеточную суспензию в предварительно размеченные криогенные пробирки объемом 1,8 мл.
    2. Храните пробирки в предварительно охлажденной емкости для заморозки, содержащей изопропиловый спирт, и поместите их при температуре -80 °C на ночь.
    3. Храните пробирки при температуре -80 °C не более 2 месяцев. Переведите в жидкий азот для длительного стабильного хранения.
  3. Размораживание запасов органоидов
    1. Разогрейте 9 мл базальной питательной среды++ на водяной бане с температурой 37 °C в маркированной пробирке объемом 15 мл.
    2. Переложите нужный флакон со склада при температуре -80 °C или в жидкий азот в транспортировочный контейнер, наполненный жидким азотом.
    3. Перенесите криопробирку на водяную баню при температуре 37 °C и осторожно перемешайте ее до тех пор, пока замороженный материал у стенок пробирки не начнет оттаивать.
    4. Медленно распределите органоидную суспензию в маркированную пробирку, наполненную 9 мл среды. Аккуратно встряхните тюбик. Центрифугу в течение 5 мин при 300 × г и удалить надосадочную жидкость.
    5. Проводят посев, как описано в шагах 2.1.16-2.1.18, и применяют соответствующую оптимальную органоидную среду для рака яичников в соответствии с уже определенными долгосрочными условиями культивирования для отдельной линии.
  4. Фиксация органоидов
    1. Выполните сбор органоидов, как описано в шагах 3.1.2-3.1.3.
    2. Добавьте 3 мл 4% параформальдегида (PFA) в PBS (pH 7,4) и инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре.
    3. Промыть 2 раза 5 мл PBS, центрифугировать в течение 3 мин при 300 × г и удалить надосадочную жидкость. Добавьте 4 мл свежего PBS в гранулы и держите их при температуре 4 °C до заделки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксированные органоиды стабильны, и хранение при температуре 4 °C возможно в течение 1 месяца перед заделкой.
    4. Нагрейте гистологический гель (хранящийся при -20 °C) при 65 °C до разжижения.
    5. Обнаружите неподвижные органоиды, осевшие и видимые на дне пробирки. Удалите надосадочную жидкость. В случае разрушения клеточной гранулы проводят центрифугирование в течение 3 мин при 300 × г и выбрасывают надосадочную жидкость PBS.
    6. Суспендируйте гранулу в 100 мкл теплого геля, осторожно пипетируя вверх и вниз. Перенесите каплю на кусок герметизирующей пленки и дайте ей затвердеть через ~15 минут при комнатной температуре.
    7. Переместите фиксированную каплю геля в тканевую парафиновую кассету. Проведение стандартных протоколов внедрения тканей19,20.
    8. Нарежьте ломтики толщиной 5-10 мкм режущим инструментом для микросрезов. Перенесите срезы на гистологические препараты. Сушите предметные стекла в течение 1 ч при 65 °C; Храните их в сухом месте.
  5. Иммунофлуоресцентное окрашивание срезов органоидов
    1. Подготовленные предметные стекла перемещают через стеклянные лотки со следующей серией разведения: 2 x 15 мин осветляющего агента для гистологии; 15 мин 100% этанол; 1 мин 100% этанол; 10 мин 96% этанол; 5 мин 70% этилового спирта; 5 мин 50% этанол.
    2. Добавьте PBS и держите 5 минут на шейкере при 100 оборотах в минуту. Повторите стирку 2 раза.
    3. Добавьте раствор для извлечения антигена (трис(гидроксиметил)аминометан-этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)-буфер [рН 9,0] или цитрат [рН 6,0]) к предметным стеклам, помещенным в термостабильную камеру. В пароварке выдержать емкость с горками 30 мин, после чего остудить до комнатной температуры.
    4. Повторите шаг 3.5.2.
    5. Камеру, содержащую предметные стекла, на 15 мин переложить в 1%-ный раствор пермеабилизации моющего средства (в ПБС).
    6. Повторите шаг 3.5.2.
    7. Очертите расположение органоидов на предметных стеклах с помощью восковой ручки для иммуноокрашивания, чтобы сохранить каплю во время следующих шагов.
    8. Добавьте на каждый предметный камень 100 мкл 10% сыворотки в разбавляющей среде, в зависимости от вида вторичного антитела.
    9. Повторите шаг 3.5.2.
    10. Разбавьте первичные антитела в среде, чтобы получить окончательный объем 100 мкл. Хранить при температуре 4 °C не менее 16 ч в инкубационном лотке / влажной камере.
    11. Повторите шаг 3.5.2.
    12. Вторичные антитела развести в среде, доведя до 100 мкл капель, и выдержать в течение 2 ч при комнатной температуре в инкубационном лотке.
    13. Повторите шаг 3.5.2.
    14. Добавляют раствор ядерного противокрасителя DAPI (4',6-Диамидин-2-фенилиндол, Дигидрохлорид), разведенный в среде разведения 1:1,000. Держать 10 мин при комнатной температуре для инкубации.
    15. Повторите шаг 3.5.2.
    16. Добавьте монтажный материал и накройте покровным стеклом. После высыхания (примерно через 8-12 ч) закрепите предметные стекла прозрачным лаком.
    17. Изображение с помощью конфокального микроскопа или другого флуоресцентного микроскопа. Сделайте обзорные снимки, а также детальные изображения субклеточных структур, которые отражают основные характеристики морфологии органоидов.

Результаты

После первичной диссоциации тканей, фильтрации и подсчета клеток клетки высеваются параллельно непосредственно в 3D-формате, как описано выше, а также суспензия в колбе для кратковременного 2D-расширения. В некоторых случаях переходное 2D-расширение положительно влияет на формирование ?...

Обсуждение

Разработанный протокол решает ранее поставленные задачи биобанкинга органоидов при раке яичников в отношении органоидообразования и долгосрочного пассажного потенциала, а также обеспечивает генерацию полностью расширяемых линий из большинства солидных опухолевых отложений. Хирур...

Раскрытие информации

М.К. указан в качестве изобретателя в патенте, относящемся к среде для органоидов рака яичников. Ф.Т. получил финансирование исследований, консультативный совет, гонорары и командировочные расходы от компаний AstraZeneca, Clovis, Eisai, ImmunoGen, Medac, MSD, PharmaMar, Roche, SAGA diagnostics и Tesaro/GSK. S.M. получила финансирование исследований, консультативный совет, почетные или командировочные расходы: AbbVie, AstraZeneca, Clovis, Eisai, GlaxoSmithKline, Hubro, Medac, MSD, Novartis, Nykode, Olympus, PharmaMar, Pfizer, Roche, Sensor Kinesis, Teva, Tesaro.

Благодарности

Исследование финансируется Немецким центром исследования рака DKTK, партнерским сайтом в Мюнхене, партнерством между DKFZ и университетской клиникой LMU Мюнхена. Исследование также поддержано грантом German Cancer Aid (#70113426 и #70113433). Парафиновое встраивание тканей и органоидов было выполнено на основной установке Института анатомии медицинского факультета Университета Людвига-Максимилиана, Мюнхен. Конфокальная визуализация была проведена в центре Core Bioimaging в Биомедицинском центре (BMC). Авторы выражают благодарность за техническую помощь Симоне Хофманн, Марии Фишер, Корнелии Хербст, Сабине Финк и Мартине Рахме.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
100 Sterican 26 GBraun, Melsungen, Germany4657683
100 Sterican 27 GBraun, Melsungen, Germany4657705
293T HA Rspo1-FcR&D systems, Minneapolis, USA3710-001-01Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111
A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV)Merck, Darmstadt, Germany616454
Advanced DMEM/F-12 Medium Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA12634028
Anti-p53 antibody (DO1)Santa Cruz Biotechnology, Texas, USAsc-126
Anti-PAX8 antibodyProteintech, Manchester, UK 10336-1-AP
B-27 Supplement (50x)Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA17504-044
Bottle-top vacuum filter 0.2 µmCorning, Berlin, Germany 430049
CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria661175
CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria690160
CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria658175
Collagenase IThermo Scientific, Waltham, USA17018029
Costar 48-well Clear TC-treated Corning, Berlin, Germany 3548
Cryo SFMPromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, GermanyC-29912
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, PathclearR&D systems, Minneapolis, USA3533-005-02Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix  Corning, 356231 
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgGJackson Immuno715-175-151
DAKO  Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen RetrieverSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyC9999-1000ML
DAPIThermo Scientific, Waltham, USA62248
Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555Thermo Scientific, Waltham, USAA32794
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Scientific, Waltham, USAA32814
Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA14190-094
Epredia Richard-Allan Scientific HistoGelThermo Scientific, Waltham, USAEpredia HG-4000-012
Falcon 24-well Polystyrene Corning, Berlin, Germany 351447
Feather scalpel Pfm medical, Cologne, Germany200130010
Fetal Bovine SerumGibco, Thermo Scientific, Waltham, USA10270106
Formalin 37% acid free, stabilizedMorphisto, Offenbach am Main, Germany1019205000
GlutaMAXGibco, Thermo Scientific, Waltham, USA35050038
HEPES (1 M)Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA156630080
Human EpCAM/TROP-1 AntibodyR&D systems, Minneapolis, USAAF960
Human FGF10Peprotech, NJ, USA100-26
Human recombinant BMP2Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USAPHC7146
Human recombinant EGFGibco, Thermo Scientific, Waltham, USAPHG0311L
Human recombinant Heregulin beta-1Peprotech, NJ, USA100-03
LAS X core SoftwareLeica Microsystemshttps://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/
Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal MicroscopeLeica Microsystems
N-2 Supplement (100x)Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA17502-048
NicotinamideSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyN0636
Omnifix 1 mLBraun, Melsungen, Germany3570519
Paraffin
ParafilmOmnilab, Munich, Germany5170002
Paraformaldehyd Morphisto, Offenbach am Main, Germany1176201000
Pen StrepGibco, Thermo Scientific, Waltham, USA15140-122
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyP4333-100
PluriStrainer 400 µmPluriSelect, Leipzig, Germany43-50400-01
PrimocinInvivoGen, Toulouse, Franceant-pm-05
Red Blood Cell Lysing BufferSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany11814389001
RoticlearCarl Roth, Karlsruhe, GermanyA538.5
Surgipath ParaplastLeica, Wetzlar, Germany39602012
Thermo Scientific Nunc CryovialsThermo Scientific, Waltham, USA375418PK
Triton X-100Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyT8787
Trypan Blue StainSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyT8154
TrypLE Express Enzyme Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA12604-013
Tween-20PanReac AppliChem, Darmstadt, GermanyA4974-0100
Y-27632TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany1254
ZeocinInvitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USAR25001

Ссылки

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 72 (1), 7-33 (2022).
  2. Berger, A. C., et al. A comprehensive pan-cancer molecular study of gynecologic and breast cancers. Cancer Cell. 33 (4), 690-705 (2018).
  3. Watson, R. W. G., Kay, E. W., Smith, D. Integrating biobanks: addressing the practical and ethical issues to deliver a valuable tool for cancer research. Nat Rev Cancer. 10 (9), 646-651 (2010).
  4. Coppola, L., et al. Biobanking in health care: evolution and future directions. J Transl Med. 17 (1), 172 (2019).
  5. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
  6. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  7. Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discov. 8 (11), 1404-1421 (2018).
  8. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
  9. Larsen, B. M., et al. A pan-cancer organoid platform for precision medicine. Cell Rep. 36 (4), 109429 (2021).
  10. Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. J Mol Med (Berl). 95 (7), 729-738 (2017).
  11. Larsen, B. M., Cancino, A., Shaxted, J. M., Salahudeen, A. A. Protocol for drug screening of patient-derived tumor organoids using high-content fluorescent imaging. STAR Protoc. 3 (2), 101407 (2022).
  12. Senkowski, W., et al. A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids. Dev Cell. 58 (12), 1106-1121 (2023).
  13. LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. Next-generation cancer organoids. Nat Mater. 21 (2), 143-159 (2022).
  14. Hoffmann, K., et al. Stable expansion of high-grade serous ovarian cancer organoids requires a low-Wnt environment. EMBO J. 39 (6), e104013 (2020).
  15. Kessler, M., et al. The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids. Nat Commun. 6, 8989 (2015).
  16. Trillsch, F., et al. Protocol to optimize the biobanking of ovarian cancer organoids by accommodating patient-specific differences in stemness potential. STAR Protoc. 4 (3), 102484 (2023).
  17. Maenhoudt, N., et al. Developing organoids from ovarian cancer as experimental and preclinical models. Stem Cell Reports. 14 (4), 717-729 (2020).
  18. Fuerer, C., Nusse, R. Lentiviral vectors to probe and manipulate the Wnt signaling pathway. PLoS One. 5 (2), e9370 (2010).
  19. . Leica ASP300S - Advanced smart processor vacuum tissue processor, instructions for use, V 2.1 Available from: https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/media_product-download/2022-01/Leica_ASP300S_IFU_2v1N_en.pdf (2021)
  20. Thermo Scientific. . Microm EC350 Modular tissue embedding center Instruction manual. , (2009).
  21. Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Sci Rep. 10 (1), 12581 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены