Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, farklı hastalık evrelerinden yumurtalık kanseri organoidlerinin oluşturulması için sistematik bir çerçeve sunar ve verimi artırmak ve sonraki uygulamalar için sağlam uzun vadeli genişleme sağlamak için hastaya özgü değişkenliğin zorluklarını ele alır. Doku işleme, tohumlama, ortam gereksinimlerini ayarlama ve immünofloresan boyama için ayrıntılı adımlar içerir.

Özet

Klinik arka plan bilgileriyle birlikte hasta kaynaklı organoidlerden bir yumurtalık kanseri biyobankasının kurulması, araştırma ve hasta bakımında ilerlemeler vaat ederken, organoid teknolojisinin doğal karmaşıklığı ile birlikte bu ölümcül malignitenin heterojenliği nedeniyle standardizasyon bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu uyarlanabilir protokol, progenitörlerin hastaya özgü değişkenliğini göz önünde bulundurarak yumurtalık kanseri organoidlerinin tam potansiyelini gerçekleştirmek için sistematik bir çerçeve sağlar. Optimum kültür koşullarını ve tohumlama yöntemlerini seçmek için yapılandırılmış bir deneysel iş akışı uygulayarak, 2D/3D rotaya karşı doğrudan 3D tohumlamanın paralel testini yaparak, çoğu durumda, çok çeşitli aşağı akış uygulamaları için uygun, sağlam, uzun vadeli genişleyen hatlar elde ediyoruz.

Özellikle, protokol, yüksek dereceli ve düşük dereceli yumurtalık kanseri ve primer debulking, tekrarlayan hastalık ve neoadjuvan sonrası cerrahi örnekler ile hastalığın evreleri dahil olmak üzere çok sayıda heterojen başlangıç materyali vakasında (N = 120) test edilmiş ve etkili olduğu kanıtlanmıştır. Düşük Wnt, yüksek BMP'li ekzojen sinyal ortamında, progenitörlerin Heregulin 1 ß (HERß-1) yolunun aktivasyonuna farklı şekilde duyarlı olduklarını, HERß-1'in bazılarında organoid oluşumunu teşvik ederken diğerlerinde inhibe ettiğini gözlemledik. Hastanın örneklerinin bir alt kümesi için, optimal organoid oluşumu ve uzun süreli büyüme, ortama fibroblast büyüme faktörü 10 ve R-Spondin 1'in eklenmesini gerektirir.

Ayrıca, doku sindirimi ve progenitör izolasyonunun kritik adımlarını vurguluyoruz ve plastik üzerinde 2D'de kısa ekilimin Bazal Membran Ekstraktı tip 2 matrisinde sonraki organoid oluşumu için faydalı olduğu örneklere işaret ediyoruz. Genel olarak, optimal biyobankacılık, bireysel hatlar için yeterli bir büyüme ortamını belirlemek için tüm ana koşulların paralel olarak sistematik olarak test edilmesini gerektirir. Protokol ayrıca, kapsamlı fenotipleme için gerekli olan organoidlerin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etmek için verimli gömme, kesitleme ve boyama için işleme prosedürünü de açıklar.

Giriş

Epitelyal over kanserli hastaların ileri evrelerde heterojen klinik prezentasyonu ve yüksek nüks oranları nedeniyle klinik yönetimi zor olmaya devam etmektedir1. Yumurtalık kanseri gelişimi ve biyolojik davranışı hakkındaki anlayışımızı geliştirmek, hastalığın seyri sırasında hastaya özgü değişkenliği, tedavi yanıtını ve histopatolojik ve moleküler özellikleri ele alan araştırma yaklaşımlarını gerektirir2.

Yumurtalık kanseri hastalarından elde edilen tümör örneklerinin klinik bilgileriyle birlikte sistematik olarak toplanması ve uzun süreli korunması ile karakterize edilen biyobankacılık, primer debulking ameliyatlarından elde edilen tümör örnekleri, neoadjuvan kemoterapi sonrası ve tekrarlayan hastalıktan elde edilen tümör örnekleri de dahil olmak üzere farklı hastalık evrelerinde geniş bir hasta kohortunun korunmasını sağlar. Umut verici prognostik biyobelirteçler ve terapötik hedefler için bir kaynak olarak hizmet veren kanser araştırmalarını ilerletmek için değerli bir potansiyele sahiptir3. Bununla birlikte, formalin fiksasyonu ve dondurma gibi geleneksel biyobankacılık yöntemleri, canlılık kaybı ve doğal üç boyutlu doku mimarisinin bozulması nedeniyle orijinal tümör örnekleri üzerinde fonksiyonel çalışmalar yapmaya uygun değildir 4,5.

Onkoloji ve ötesinde moleküler mekanizmaların incelenmesi, hastalığın biyolojisini aslına uygun olarak yansıtan ve in vivo olarak gözlemlenen dokunun in vitro özelliklerini koruyan uygun deneysel modellerin kullanımına bağlıdır. Yenilenme potansiyelinin korunmasına dayanan hasta kaynaklı organoidler, laboratuvarda epitelin orijinal yapısını ve işlevini yeniden üretir ve hastaya özgü bir bağlamda test yapılmasına izin verir. Bu nedenle, kanser araştırmaları ve kişiselleştirilmiş tıp için son derece umut verici araçlar olarak ortaya çıkmışlar ve klinik çeşitlilik ile laboratuvar araştırmaları arasındaki boşluğu doldurmuşlardır 6,7,8,9. Organoid hatların bireysel ilaç yanıtlarına ve moleküler profillerin fonksiyonel uygunluğunun test edilmesine dayanan özel terapötik stratejiler, potansiyel olarak doğrudan hasta bakımına uygulanabilir10,11. Hastaya özgü özellikler de dahil olmak üzere uzun vadeli yetiştirme olasılığı ve zaman içinde ilgili prospektif klinik verilerin toplanması, hastalığın ilerlemesi ve direnç mekanizmalarında rol oynayan yeni prognostik ve öngörücü faktörlerin tanımlanması için büyük umut vaat etmektedir 3,9.

Bununla birlikte, farklı tümör örneklerinden organoidleri içeren bir biyobanka oluşturmak, karmaşık metodolojiye sıkı sıkıya bağlı kalmanın ve kolay bakım için protokoller oluşturmanın bir kombinasyonunu gerektirir12. Proses standardizasyonu, biyobankanın yüksek ciroda bile eğitimli personel tarafından verimli bir şekilde kurulmasını ve sürdürülebilmesini sağlarken aynı zamanda en yüksek kalite standartlarına bağlı kalınmasını sağlar13. Birkaç çalışma, orijinal tümörün mutasyonel ve fenotipik profiline karşılık gelen stabil yumurtalık kanseri organoid hatlarının değişen verimlilik oranlarıyla başarılı bir şekilde oluşturulduğunu bildirmiştir. Yine de, rutin biyo bankacılık, özellikle büyük ölçekli genişleme veya başarılı genomik düzenleme için bir ön koşul olan hatların uzun vadeli istikrarlı büyümesi için pratikte zorlu olmaya devam etmektedir.

Özellikle, yavaş ve sınırlı büyüme potansiyeli gösteren organoidler zaman zaman yerleşik hatlar olarak sayıldığından, genişletilebilirlik konusu sahada belirsiz bir şekilde tanımlanmaktadır. Başlangıçta Hoffmann ve ark. tarafından gösterildiği gibi, temel bulguları bu daha da geliştirilmiş protokolün temelini oluşturan bir çalışma, yumurtalık kanseri dokusunun optimal kullanımı, heterojenliği barındırmak için benzersiz bir strateji gerektirir14. Bu yöntemle elde edilen organoidlerin fenotipik karakterizasyonu ve ebeveyn tümör dokusu ile yakın benzerliği, panel DNA dizilemesi ve olgun kültürlerin transkriptomik analizi (4-10 aylık kültivasyon) ile doğrulandı ve model 8,9,12,14'ün stabilitesini gösterdi.

Sağlıklı fallop tüplerinde homeostazı düzenleyen parakrin ortamın aksine, muhtemelen yüksek dereceli seröz yumurtalık kanseri (HGSOC), kanser rejenerasyon potansiyeli ve organoid oluşum kapasitesi veren epitel tabakası, eksojen Wnt takviyesine daha az bağımlıdır. Ayrıca, organoid ortamda Noggin yokluğu ile karakterize edilen aktif Kemik Morfogenetik Proteini (BMP) sinyalinin, yumurtalık kanseri katı doku birikintilerinden uzun süreli kültürlerin kurulması için faydalı olduğu kanıtlanmıştır14,15. Yumurtalık kanserinin katı birikintilerinin sistematik biyobankacılığı sırasında, bu bulguları doğruladık ve vakaların çoğunda sürekli uzun vadeli genişleme sağlayan bu protokolde özetlenen ayrıntılarla boru hattını kurduk. Birincil izolatlarla çalışırken farklı ortam bileşimlerinin ve tohumlama modalitelerinin paralel testinin, uzun vadeli kararlı organoid hatlarının kurulmasını iyileştirmek ve verimi artırmak, aşağı akış deneyleri için gerekli olan çok kuyulu formatlara sağlam yayılma ve genişleme sağlamak için gerekli olduğunu bulduk16.

Ayrıca, ameliyat sırasında toplanan örneklerin saflığı ve kalitesi, temel araştırma ve moleküler tanıda yumurtalık kanseri organoidlerinin translasyon potansiyeli için çok önemlidir. HGSOC'nin klinik sunumunun karmaşıklığı, ilgili materyalin doğru bir şekilde tanımlanmasını, taşıma koşullarının sabit tutulmasını ve organoid hatlarının yüksek verimlilikle üretilmesini sağlamak için cerrahlar, onkologlar ve laboratuvardaki bilim adamları arasında yakın işbirliği gerektirir. Bu protokol, yumurtalık kanserini karakterize eden heterojenliği göz önünde bulundurarak, yumurtalık kanseri organoidlerinin tam potansiyelini yakalamak için standartlaştırılmış ancak uyarlanabilir bir çerçeve sağlar16,17. Özellikle, bu protokol, farklı histolojik tipler (yüksek dereceli ve düşük dereceli yumurtalık kanseri, LGSOC), kök regülasyonunda farklılıklar sergileyen aynı hastalardan farklı tortular, neoadjuvan sonrası ortamda ameliyatlardan alınan dokular, biyopsi materyali ve hastalık ilerlemesinin tekrarlayan fazındaki ameliyatlardan alınan örnekler dahil olmak üzere geniş yumurtalık kanseri klinik sunumunun geniş spektrumunun güvenilir biyobankacılığını sağlar.

Protokol

Yumurtalık kanseri ameliyatlarından tümör dokusu örnekleri toplandı ve LMU Üniversitesi Etik Kurulu'na (17-471) uygun olarak, mevcut geçerli AB, ulusal ve yerel düzenlemelere bağlı kalarak hasta kaynaklı organoidler üretildi. Çalışmaya katılan her hasta yazılı olarak onay vermiştir. Taze doku numuneleri ile çalışırken, Biyogüvenlik Seviye 2 güvenlik izni ve Laminar Flow kabinleri gereklidir. İlgili bulaşıcı hastalıkların rutin testlerinin yapılmaması nedeniyle göz ardı edilemeyecek olan doku örneklerinin potansiyel olarak bulaşıcı doğası göz önüne alındığında, kurumsal biyo-güvenlik düzenlemelerine sıkı sıkıya bağlı kalındığından ve deneyleri yürüten personel için yeterli kişisel koruyucu ekipmanın mevcut olduğundan emin olmak gerekir.

1. Hazırlıklar

  1. Orta hazırlık
    1. 2D ve 3D medyayı haftada bir kez taze olarak hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
      NOT: Her ortam için bileşenlerin tam bileşimi Tablo 1'de listelenmiştir. Hem yumurtalık kanseri ortamı 1 (OCM1) hem de OCM2 ek olarak HER1ß (son konsantrasyon: 50 ng/mL) ile desteklenebilir, bu da dört farklı durumla sonuçlanır: OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß.
    2. Büyüme faktörü reaktiflerinin stok çözeltilerini oluşturun ve bunları 20 °C'de ve A83-01 ve nikotinamidde (+4 °C'de saklayın) saklayın. Büyüme faktörlerinin sıcaklığa duyarlılığı nedeniyle, orta hazırlık için hemen çözülmüş stok çözeltileri kullanın ve alikotlar oluşturarak tekrarlanan çözülme döngülerinden kaçının.
      NOT: Medya hazırlığı, sıkı bir şekilde kontrol edilmesi gereken kritik bir adımdır.
    3. RSPO-1 şartlandırılmış ortamın hazırlanması
      1. HA-R-Spondin1-Fc 293 T hücrelerini (-80 °C'de depolama) 37 °C'de hızlı bir şekilde çözdürün. Bunları, bundan böyle bazal kültür ortamı++ olarak anılacak olan %10 fetal buzağı serumu (FCS) ile desteklenmiş 10 mL bazal kültür ortamı ile yıkayın.
      2. Hücre peletini 12 mL bazal kültür ortamı ++ içinde yeniden süspanse edin ve bir T75 şişesinde tohumlayın.
      3. Hücreler birleştiğinde tripsin içeren bir ayrışma reaktifi (37 ° C'de 4 dakika) ile hücreleri 1: 6 oranında bölün. Onları yeni bir T75 şişesine ekin.
      4. Ertesi gün, ortama fleomisin D1 (1,25 μL / mL) ekleyin.
      5. Hücreler birleştiğinde hücreleri tripsin ile 1:20 oranında bölün (37 ° C'de 4 dakika). Hücreleri, fleomisin D1 ile takviye edilmiş 30 mL bazal kültür ortamı ++ (% 10 FCS içeren) içinde birden fazla T75 şişesine (hedeflenen nihai hacme göre şişe sayısı) tohumlayın.
      6. Hücreler birleşmenin yaklaşık% 50'sine ulaştığında şartlandırılmış ortam üretimini başlatın: ortamı, fleomisin D1 içermeyen% 5 FCS ile desteklenmiş 40 mL bazal kültür ortamı ile değiştirin.
      7. İlk süpernatanı 3 gün sonra toplayın. Kalıntıları temizlemek için 1.200 × g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı steril bir kapta 4 °C'de saklayın.
      8. Hücrelere% 5 FCS ile desteklenmiş yeni bazal kültür ortamı ekleyin. İkinci süpernatanı 3-4 gün sonra toplayın. 1.200 × g'da 10 dakika santrifüjleyin. İkinci süpernatanı ilk süpernata ekleyin.
      9. Şartlandırılmış ortamı 0.2 μm'lik bir şişe üstü filtre kullanarak süzün.
      10. Kalite kontrol ve RSPO1 kantitasyonu için, üretilen ortamı, GFP-plazmid taşıyan Wnt raportörü 18 ile stabil bir şekilde dönüştürülen bir 293T hücre hattına (293T WntR, 7xTcf-eGFP)14 ekleyin.
        NOT: GFP sinyalinin miktarına ve yoğunluğuna bağlı olarak, Wnt yolunun bir agonisti olarak RSPO1'in aktivitesi, Wnt raportör hücre hattının miktar tayini ile test edilir.
      11. 15 mL'lik alikotları hemen kullanım için (1 hafta içinde) 4 °C'de saklayın. Daha uzun süreli saklama için (6 ay) şartlandırılmış ortamı -20 °C'de tutun.

2. Yumurtalık kanseri organoid kültürünün başlatılması

  1. Primer doku izolasyonu
    1. Taze ve canlı dokuyu tercihen ameliyattan hemen sonra taşıyın ve toplandıktan sonra en fazla 20 saat içinde izolasyon gerçekleştirin. Yaklaşık 4 °C'de soğuk paketlerle donatılmış bir taşıma kutusu ile doku toplama ortamında uygun taşıma koşullarını sağlayın.
    2. Laboratuvarda, numunenin zamanında işlenmesini kolaylaştırmak için gerekli reaktifleri ve ekipmanı hazırlayın:
      1. Buzda (yaklaşık 2 saat) Bazal Membran Ekstraktı Tip II matrisini (BME 2 matrisi) çözdürün.
      2. 50 mL'lik tüpler için tek kullanımlık neşterler, sterilize diseksiyon aletleri (makas ve cımbız) ve 400 μm boyutunda filtre ekleri hazırlayın.
      3. Ani dondurma için az miktarda sıvı nitrojen içeren bir kap ve 37 °C'de önceden ısıtılmış bir su banyosu hazırlayın.
        NOT: Bir hücre kültürü laminer akış başlığı içinde çalışın.
    3. Taze dokuyu bir Petri kabında Fosfat Tamponlu Salin (PBS) (Ca++ ve Mg++ olmadan) içinde iyice yıkayın. Petri kabının içinde, tek kullanımlık neşter ve/veya makas kullanarak dokuyu 3-5 mm boyutunda küçük parçalara ayırın.
    4. Elde edilen dokuyu aşağıdaki amaçlar için üç bölüme ayırın:
      1. Kriyojenik tüplerde doku toplayın. Kriyojenik tüpleri, şok dondurma için sıvı nitrojenle dolu hazırlanmış kaba aktarın.
      2. Dokuyu (2-3 mm) fiksasyon için formalin ile doldurulmuş histolojik bir numune kabına toplayın (24 saat) ve boyama amacıyla parafine gömün19,20.
      3. Ayrıca, enzimatik sindirimden önce dokuyu homojenize edin. Bir neşter ile mekanik ayrışmayı en üst düzeye çıkarın ve 50 mL'lik bir doku tüpüne aktarın.
        NOT: Dokudan kurumasını önlemek için homojenizasyon sırasında dokunun her zaman PBS'ye batırıldığından emin olun.
    5. Homojenize dokuyu PBS (Ca++ ve Mg++ olmadan), Kollajenaz I (stok çözeltisi 5 U/μL, nihai konsantrasyon 1 U/μL) ve seçici bir ROCK1 ve 2 inhibitörü (3 μM nihai konsantrasyon) içeren bir sindirim karışımı ile birleştirin (bileşenler Tablo 1'de listelenmiştir). Tümörün her 2cm3'ü için 50 mL'lik bir tüpte 15 mL sindirim karışımı kullanın.
      NOT: Sınırlı materyal (örneğin, biyopsi örnekleri), enzimatik ayrışmayı sağlamak için sadece küçük miktarlarda (yaklaşık 2-3 mL) sindirim karışımı gerektirir.
    6. Enzimatik ayrışma için, tüpü 37 ° C'de bir su banyosunda 1,5 saat inkübe edin. Mekanik ayrışmayı desteklemek için düzensiz ve kuvvetli girdap (10-15 saniye boyunca yaklaşık her 20 dakikada bir) yapın.
    7. İnkübasyondan sonra, tüpe 15 mL soğuk bazal kültür ortamı++ ekleyin. 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
    8. Süpernatanı çıkardıktan sonra, 5 mL yeni bazal kültür ortamı ++ ekleyin. 400 μm'lik bir filtre kullanarak hücre süspansiyonunu 50 mL'lik yeni bir tüpe süzün.
    9. 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini saklayın.
    10. Eritrositlerin çıkarılması için, hücre peletine 5 mL Kırmızı Kan Hücresi Parçalama (RBC) Tamponu ekleyin. 37 °C'de 5 dakika su banyosunda inkübe edin.
    11. Lizis inaktivasyonu için 5 mL bazal kültür ortamı++ ekleyin. 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Hücre peletine 3 mL bazal kültür ortamı++ ekleyin.
    12. Tripan mavisi leke çözeltisi (örneğin, 10 μL numune + 10 μL tripan mavisi leke çözeltisi) ile 1:1 seyreltmeden sonra canlı hücreleri otomatik bir hücre sayacında veya manuel olarak bir Neubauer Odasında sayın.
    13. Doğrudan 3D tohumlama için gereken hücre sayısını hesaplayın. Her tümör birikintisi için, yumurtalık kanseri ortamı başına en az 2-3 oyuk, bu da bir tohumlama matrisinde (OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß) toplam 8-12 oyuğa karşılık gelen 48 oyuklu formatlı bir plakaya tohumlayın. 25 μL BME Tip 2 matris damlacığındaki her kuyucuk için 30.000 hücre hesaplayın. İsteğe bağlı olarak, 50 μL BME 2 matrisi ve oyuk başına 50.000 tohumlanmış hücre içeren 24 oyuklu bir format seçin.
    14. Kalan hücreleri 2B olarak tohumlayın (bkz. adım 2.1.13).
    15. İhtiyaç duyulan toplam hücre sayısını içeren bazal kültür ortamı++ süspansiyon miktarını yeni bir tüpe pipetleyin ve 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini saklayın.
    16. Buz üzerinde, toplam soğuk BME 2 matris miktarını (48 oyuklu bir format plakasında her kuyucuk için 25 μL; dolayısıyla 4 kuyucuk için 100 μL) pelete ekleyin ve peleti kabarcıklar oluşturmadan hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek kuyucuk başına eşit bir hücre dağılımı elde etmek için iyice karıştırın.
    17. Hücreleri BME 2 matrisinin (25 μL) damlacıklarındaki önceden ısıtılmış, boş 48 oyuklu plakaya tohumlayın. Kuyucuklar arasında eşit dağılım elde etmek için, dağıtım sırasında hücre çökelmesini önlemek için BME 2 matris damlacığını her bir oyuğa aktarmadan önce pipeti tüpün içinde yavaşça ve yavaşça yukarı ve aşağı (3-4x) hareket ettirin.
    18. BME 2 matrisinin damlacıklarını birleştirmek için plakayı en az 30 dakika 37 °C'de inkübe ettikten sonra, dört yumurtalık kanseri ortamının (OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß) her birinden 250 μL'yi pipetleyin.
    19. Doğrudan 3D tohumlama prosedürüne paralel olarak, bir 2D kültür başlatarak kalan izole hücreleri koruyun.
      1. 300 × g'da 5 dakika santrifüjledikten sonra peleti 2D ortama ekleyin. 3D tohumlamadan sonra mevcut hücre sayısına bağlı olarak formatı (T75 şişesi veya T25 şişesi) seçin.
      2. Hücre yapışması için şişeyi 37 °C'de 3-5 gün inkübe edin. İlk 72 saat boyunca aynı ortamı koruyun.
      3. Hücreler birleştiğinde, kültürü BME 2 matrisine aktarın. 2B kültürdeki birincil izolatları bölerek genişletmeyin, çünkü 2B üzerinde uzun vadeli yayılma kök potansiyeli için zararlıdır.
  2. 2B kültürden 3B kültüre aktarma
    1. T75 veya T25 şişesinde, hücreleri alt yüzeyden ayırmak için tek tabakayı 2x 5 mL PBS ile yıkayın. 1 mL tripsin ile 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
    2. Ayrışma reaktifinin inaktivasyonu için 5 mL soğuk bazal kültür ortamı++ ekleyin. 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
    3. Pelete 3 mL bazal kültür ortamı++ ekleyin. Hücreleri 2.1.12-2.1.13 adımlarında açıklandığı gibi sayın. 2.1.16-2.1.18 adımlarında açıklandığı gibi farklı ortam bileşimleri için tohum (bkz. Şekil 1).
  3. Organoid büyümenin değerlendirilmesi
    1. Organoid büyümesini belgelemek için kuyucukları haftada en az bir kez görüntüleyin. Faz kontrast mikroskobu ile 2D/3D kültürün yüksek kaliteli karşılaştırılabilir görüntülerini ve doğrudan tohumlama plakalarını yapın. Büyütmede tutarlılığa dikkat edin ve kuyulara genel bir bakış (niceleme) için 4x ve organoidlerin morfolojisini belgelemek için 10x ve 20x kullanın.
    2. Resimlerin depolanmasını tek tek hatlara ayrılmış klasörlerde düzenleyin.
    3. Farklı tohumlama modalitelerinde (2D, ardından doğrudan 3D tohumlamaya karşı 3D tohumlama) ve farklı ortam bileşimlerinde (OCM1, OCM1+ HER1ß, OCM2 ve OCM2+ HER1ß) organoid oluşumunun karşılaştırmalı değerlendirmesini yaparak uzun vadeli yetiştirme için en iyi organoid hattını seçin.
      1. Ortalama olarak, izolasyondan 14-21 gün sonra, farklı koşullar altında yetiştirilen organoidlerin organoid oluşturma potansiyelini (miktarını) ve ayrıca boyutunu ve hücresel fenotipini değerlendirin. Aşağıdaki özelliklere bakın: vakuollerin yokluğu, zar kanaması veya yapışma kaybı ve hücrelerin yuvarlanması.

3. Uzun süreli organoid yetiştiriciliği

  1. Organoid pasaj
    1. Organoidleri çok sık ve proliferatif faz sırasında bölmekten kaçının. 10 günden fazla aralıklarla mekanik ve enzimatik sindirim prosedürleri uygulayın.
    2. Her bir BME 2 matris damlacığını bozmak için 250 μL (48 oyuklu format) veya 500 μL (24 oyuklu format) buz gibi soğuk bazal kültür ortamı++ ekleyin. Damlacığın ve pipetin aralıklı olarak yukarı ve aşağı tamamen çözünmesini sağlayın ve plakanın altını kazıyın. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve buzun üzerine yerleştirin. 1 mL buz gibi soğuk bazal kültür ortamı++ ekleyin.
      NOT: BME 2 matrisinin uzaklaştırma verimliliği, en iyi çözünme 4 °C'nin altında elde edildiğinden, büyük ölçüde ortam sıcaklığına bağlıdır.
    3. Havuz 2-3 teknik çoğaltma kuyuları eşit genişleme için. 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. BME 2 jelinin hala görünür olup olmadığını görmek için süspansiyonun içeriğini ışık kaynağına göre inceleyin. Süpernatanı çıkarın ve BME 2 matrisi hala görünüyorsa buz gibi soğuk bir ortamla yıkamayı tekrarlayın.
    4. 1 mL tripsin (20-25 °C'de saklanır) ile 37 °C'de bir su banyosunda 7-10 dakika inkübe edin. Ayrışmayı arttırmak için 10 saniye boyunca ara sıra girdap yapın. Ayrışmanın ilerleyip ilerlemediğini görmek için tüpü periyodik olarak görsel olarak inceleyin.
    5. Hücre süspansiyonunu bir şırınga ile 23 G ila 27 G arasında değişen bir iğneden yukarı ve aşağı çekin.
      NOT: Bir şırınga ile parçalanma isteğe bağlıdır ve iğne boyutu gerekli ayrışma etkinliğine bağlıdır. Homojen bir hücre süspansiyonu, kuyular arasında eşit dağılıma yol açar.
    6. Reaksiyonu etkisiz hale getirmek için 1 mL soğuk bazal kültür ortamı++ ekleyin.
    7. İSTEĞE BAĞLI: Hücreleri 2.1.12-2.1.13 adımlarında açıklandığı gibi sayın ve ebeveyn geçişine bölme oranına karar verin (örneğin, 1:3 kuyucuklar).
    8. 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın.
    9. 2.1.16-2.1.18 adımlarında açıklandığı gibi tohumlama yapın ve önceden belirlenmiş uzun vadeli kültüre göre ilgili optimal yumurtalık kanseri organoid ortamını uygulayın. Yumurtalık kanseri ortamını her 3-4 günde bir değiştirin.
    10. Ortam değişimi sırasında BME 2 matris damlacığının bozulması durumunda, enzimatik sindirim olmadan yeniden tohumlamayı düşünün. Damlacığın bozulmasını önlemek için, BME 2 matris damlacığına doğrudan pipetleme yapmadan ortam değiştirme prosedürünü dikkatli bir şekilde gerçekleştirin. Ek olarak, damlacıkların kırılganlığını etkileyebileceğinden, adım 2.1.16'da BME 2 matrisi ile seyreltmeden önce pelet üzerinde aşırı miktarda kalıntı bazal kültür ortamı++ bırakmaktan kaçının.
  2. Organoidlerin dondurularak saklanması
    NOT: Geçişten sonraki ilk hafta proliferasyon aşamasında organoidlerin dondurularak saklanmasını sağlayın.
    1. Adım 3.1.2'ye göre buz gibi soğuk bazal kültür ortamı++ ile BME 2 matris damlacığını bozun. Santrifüjlemeden ve süpernatanı adım 3.1.3.'te açıklandığı gibi attıktan sonra, buz üzerinde çalışın ve hücre peletini 1 mL buz gibi soğuk kriyoprezervasyon ortamında yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu önceden etiketlenmiş 1.8 ml'lik kriyojenik tüplere aktarın.
    2. Tüpleri önceden soğutulmuş izopropil alkol içeren bir dondurma kabında saklayın ve gece boyunca -80 °C'de saklayın.
    3. Stok tüplerini en fazla 2 ay -80 °C'de tutun. Uzun süreli stabil depolama için sıvı nitrojene aktarın.
  3. Organoid stokların çözülmesi
    1. Etiketli 15 mL'lik bir tüpte 37 °C'lik bir su banyosunda 9 mL bazal kültür ortamını ++ önceden ısıtın.
    2. İstenilen stok şişesini -80 °C'deki depodan veya sıvı nitrojen ile dolu bir taşıma kabına sıvı nitrojene aktarın.
    3. Kriyotüpü 37 °C'de bir su banyosuna aktarın ve tüpün duvarlarına yakın donmuş malzeme çözülmeye başlayana kadar hafifçe çalkalayın.
    4. Organoid süspansiyonu yavaşça 9 mL ortamla doldurulmuş etiketli tüpe dağıtın. Tüpü yavaşça sallayın. 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
    5. Adım 2.1.16-2.1.18'de açıklandığı gibi tohumlama yapın ve ilgili optimal yumurtalık kanseri organoid ortamını bireysel hat için önceden belirlenmiş uzun vadeli kültür koşullarına göre uygulayın.
  4. Organoidlerin fiksasyonu
    1. Organoid toplamayı 3.1.2-3.1.3 adımlarında açıklandığı gibi gerçekleştirin.
    2. PBS'ye (pH 7.4) 3 mL %4 paraformaldehit (PFA) ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
    3. 2x'i 5 mL PBS ile yıkayın, 300 × g'da 3 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Pelete 4 mL taze PBS ekleyin ve gömülene kadar 4 °C'de tutun.
      NOT: Sabit organoidler stabildir ve gömülmeden önce 1 ay boyunca 4 ° C'de saklanması mümkündür.
    4. Histolojik jeli (-20 °C'de saklanır) sıvılaşana kadar 65 °C'de ısıtın.
    5. Tüpün dibine yerleşmiş ve görülebilen sabit organoidleri tespit edin. Süpernatanı çıkarın. Bozulmuş bir hücre peleti durumunda, 300 × g'da 3 dakika santrifüjleme yapın ve süpernatan PBS'yi atın.
    6. Peletleri 100 μL ılık jel içinde hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek süspanse edin. Damlacığı bir parça sızdırmazlık filmine aktarın ve oda sıcaklığında ~ 15 dakika sonra katılaşmanın gerçekleşmesine izin verin.
    7. Sabit jel damlacığını doku parafin kasetine taşıyın. Standart doku gömme protokollerini uygulayın19,20.
    8. Mikrokesit kesme aleti ile 5-10 μm kalınlığında dilimler kesin. Kesikleri histoloji slaytlarına aktarın. Slaytları 65 °C'de 1 saat kurutun; Onları kuru bir yerde saklayın.
  5. Organoid kesitlerin immünofloresan boyanması
    1. Hazırlanan slaytları aşağıdaki seyreltme serisiyle cam tepsilerden geçirin: histoloji için 2 x 15 dakika temizleme maddesi; 15 dk %100 etanol; 1 dk %100 etanol; 10 dakika% 96 etanol; 5 dakika% 70 etanol; 5 dk %50 etanol.
    2. PBS ekleyin ve çalkalayıcıda 100 rpm'de 5 dakika tutun. Yıkamayı 2 kez tekrarlayın.
    3. Termostabil odaya yerleştirilen slaytlara antijen alma çözeltisi (Tris(hidroksimetil)aminometan-Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)-tampon [pH 9.0] veya Sitrat [pH 6.0]) ekleyin. Bir buharlı pişiricide, kaydıraklı kabı 30 dakika tutun, ardından oda sıcaklığına soğutun.
    4. Adım 3.5.2'yi tekrarlayın.
    5. Slaytları içeren hazneyi 15 dakika boyunca %1 geçirgenleştirme deterjan çözeltisine (PBS cinsinden) aktarın.
    6. Adım 3.5.2'yi tekrarlayın.
    7. Aşağıdaki adımlar sırasında damlacığı korumak için slaytlar üzerindeki organoidlerin yerini immün boyama balmumu kalemi ile şekillendirin.
    8. İkincil antikorun türüne bağlı olarak, her slaytta bir seyreltme ortamında 100 μL% 10 serum ekleyin.
    9. Adım 3.5.2'yi tekrarlayın.
    10. Birincil antikorları bir ortamda seyreltin, bu da 100 μL'lik bir nihai hacme yol açar. Bir inkübasyon tepsisinde/nem odasında en az 16 saat boyunca 4 ° C'de tutun.
    11. Adım 3.5.2'yi tekrarlayın.
    12. İkincil antikorları bir ortamda seyreltin, 100 μL damlacıklara yol açın ve bir inkübasyon tepsisinde oda sıcaklığında 2 saat bekletin.
    13. Adım 3.5.2'yi tekrarlayın.
    14. 1: 1.000 seyreltme ortamında seyreltilmiş nükleer karşı boyama çözeltisi DAPI (4',6-Diamidin-2-fenilindol, Dihidroklorür) ekleyin. Kuluçka için oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.
    15. Adım 3.5.2'yi tekrarlayın.
    16. Montaj ortamını ekleyin ve lamel ile örtün. Slaytları kuruduktan sonra şeffaf oje ile sabitleyin (yaklaşık 8-12 saat sonra).
    17. Konfokal mikroskop veya başka bir floresan mikroskobu ile görüntü. Organoid morfolojisinin temel özelliklerini yakalayan hücre altı yapıların ayrıntılı görüntülerinin yanı sıra genel bakış resimleri yapın.

Sonuçlar

İlk doku ayrışması, filtrasyonu ve sayımından sonra, hücreler, yukarıda açıklandığı gibi, doğrudan 3D formatında paralel olarak ekilir ve ayrıca kısa 2D genişleme için şişedeki süspansiyon yapılır. Bazı durumlarda, geçici 2D genişleme organoid oluşumunu olumlu yönde etkiler ve uzun vadeli çizgi bu rota üzerinden başarılı bir şekilde kurulurken, karşılaştırmalı paralel 3D tohumlama büyümenin durmasına neden olabilir (Şekil 1). İşlenen her donör d...

Tartışmalar

Tasarlanan protokol, organoid oluşumu ve uzun vadeli geçiş potansiyeli ile ilgili olarak yumurtalık kanseri organoid biyobankacılığının önceki zorluklarını ele alır ve katı tümör birikintilerinin çoğundan tamamen genişletilebilir hatların oluşturulmasını sağlar. Organoid üretimi için kullanılacak tümör örneklerinin cerrahi olarak toplanması süreci, verimi ve genişleme potansiyelini önemli ölçüde etkiler. Tümör dokusu örnekleri, çoklu viseral cerrahi, tanısal laparoskopi veya biyo...

Açıklamalar

M.K., yumurtalık kanseri organoidleri için bir besiyeri ile ilgili bir patentte mucit olarak listelenmiştir. F.T., AstraZeneca, Clovis, Eisai, ImmunoGen, Medac, MSD, PharmaMar, Roche, SAGA diagnostics ve Tesaro/GSK'dan araştırma fonu, danışma kurulu, onur ve seyahat masrafları aldı. S.M. araştırma fonu, danışma kurulu, onursal veya seyahat masrafları aldı: AbbVie, AstraZeneca, Clovis, Eisai, GlaxoSmithKline, Hubro, Medac, MSD, Novartis, Nykode, Olympus, PharmaMar, Pfizer, Roche, Sensor Kinesis, Teva, Tesaro.

Teşekkürler

Çalışma, DKFZ ve Münih Üniversite Hastanesi arasındaki bir ortaklık olan Alman Kanser Araştırma Merkezi DKTK, Ortak site Münih tarafından finanse edilmektedir. Çalışma aynı zamanda Alman Kanser Yardımı hibesi (#70113426 ve #70113433) tarafından da desteklenmektedir. Doku ve organoidlerin parafin gömülmesi, LMU Münih, Münih Tıp Fakültesi Anatomi Enstitüsü'nün Çekirdek tesisinde gerçekleştirilmiştir. Konfokal Görüntüleme, Biyomedikal Merkezi'ndeki (BMC) Biyogörüntüleme Çekirdek tesisinde gerçekleştirilmiştir. Yazarlar teknik yardım için Simone Hofmann, Maria Fischer, Cornelia Herbst, Sabine Fink ve Martina Rahmeh'e teşekkür etmek istiyor.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
100 Sterican 26 GBraun, Melsungen, Germany4657683
100 Sterican 27 GBraun, Melsungen, Germany4657705
293T HA Rspo1-FcR&D systems, Minneapolis, USA3710-001-01Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111
A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV)Merck, Darmstadt, Germany616454
Advanced DMEM/F-12 Medium Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA12634028
Anti-p53 antibody (DO1)Santa Cruz Biotechnology, Texas, USAsc-126
Anti-PAX8 antibodyProteintech, Manchester, UK 10336-1-AP
B-27 Supplement (50x)Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA17504-044
Bottle-top vacuum filter 0.2 µmCorning, Berlin, Germany 430049
CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria661175
CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria690160
CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria658175
Collagenase IThermo Scientific, Waltham, USA17018029
Costar 48-well Clear TC-treated Corning, Berlin, Germany 3548
Cryo SFMPromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, GermanyC-29912
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, PathclearR&D systems, Minneapolis, USA3533-005-02Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix  Corning, 356231 
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgGJackson Immuno715-175-151
DAKO  Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen RetrieverSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyC9999-1000ML
DAPIThermo Scientific, Waltham, USA62248
Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555Thermo Scientific, Waltham, USAA32794
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Scientific, Waltham, USAA32814
Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA14190-094
Epredia Richard-Allan Scientific HistoGelThermo Scientific, Waltham, USAEpredia HG-4000-012
Falcon 24-well Polystyrene Corning, Berlin, Germany 351447
Feather scalpel Pfm medical, Cologne, Germany200130010
Fetal Bovine SerumGibco, Thermo Scientific, Waltham, USA10270106
Formalin 37% acid free, stabilizedMorphisto, Offenbach am Main, Germany1019205000
GlutaMAXGibco, Thermo Scientific, Waltham, USA35050038
HEPES (1 M)Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA156630080
Human EpCAM/TROP-1 AntibodyR&D systems, Minneapolis, USAAF960
Human FGF10Peprotech, NJ, USA100-26
Human recombinant BMP2Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USAPHC7146
Human recombinant EGFGibco, Thermo Scientific, Waltham, USAPHG0311L
Human recombinant Heregulin beta-1Peprotech, NJ, USA100-03
LAS X core SoftwareLeica Microsystemshttps://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/
Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal MicroscopeLeica Microsystems
N-2 Supplement (100x)Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA17502-048
NicotinamideSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyN0636
Omnifix 1 mLBraun, Melsungen, Germany3570519
Paraffin
ParafilmOmnilab, Munich, Germany5170002
Paraformaldehyd Morphisto, Offenbach am Main, Germany1176201000
Pen StrepGibco, Thermo Scientific, Waltham, USA15140-122
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyP4333-100
PluriStrainer 400 µmPluriSelect, Leipzig, Germany43-50400-01
PrimocinInvivoGen, Toulouse, Franceant-pm-05
Red Blood Cell Lysing BufferSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany11814389001
RoticlearCarl Roth, Karlsruhe, GermanyA538.5
Surgipath ParaplastLeica, Wetzlar, Germany39602012
Thermo Scientific Nunc CryovialsThermo Scientific, Waltham, USA375418PK
Triton X-100Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyT8787
Trypan Blue StainSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyT8154
TrypLE Express Enzyme Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA12604-013
Tween-20PanReac AppliChem, Darmstadt, GermanyA4974-0100
Y-27632TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany1254
ZeocinInvitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USAR25001

Referanslar

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 72 (1), 7-33 (2022).
  2. Berger, A. C., et al. A comprehensive pan-cancer molecular study of gynecologic and breast cancers. Cancer Cell. 33 (4), 690-705 (2018).
  3. Watson, R. W. G., Kay, E. W., Smith, D. Integrating biobanks: addressing the practical and ethical issues to deliver a valuable tool for cancer research. Nat Rev Cancer. 10 (9), 646-651 (2010).
  4. Coppola, L., et al. Biobanking in health care: evolution and future directions. J Transl Med. 17 (1), 172 (2019).
  5. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
  6. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  7. Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discov. 8 (11), 1404-1421 (2018).
  8. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
  9. Larsen, B. M., et al. A pan-cancer organoid platform for precision medicine. Cell Rep. 36 (4), 109429 (2021).
  10. Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. J Mol Med (Berl). 95 (7), 729-738 (2017).
  11. Larsen, B. M., Cancino, A., Shaxted, J. M., Salahudeen, A. A. Protocol for drug screening of patient-derived tumor organoids using high-content fluorescent imaging. STAR Protoc. 3 (2), 101407 (2022).
  12. Senkowski, W., et al. A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids. Dev Cell. 58 (12), 1106-1121 (2023).
  13. LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. Next-generation cancer organoids. Nat Mater. 21 (2), 143-159 (2022).
  14. Hoffmann, K., et al. Stable expansion of high-grade serous ovarian cancer organoids requires a low-Wnt environment. EMBO J. 39 (6), e104013 (2020).
  15. Kessler, M., et al. The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids. Nat Commun. 6, 8989 (2015).
  16. Trillsch, F., et al. Protocol to optimize the biobanking of ovarian cancer organoids by accommodating patient-specific differences in stemness potential. STAR Protoc. 4 (3), 102484 (2023).
  17. Maenhoudt, N., et al. Developing organoids from ovarian cancer as experimental and preclinical models. Stem Cell Reports. 14 (4), 717-729 (2020).
  18. Fuerer, C., Nusse, R. Lentiviral vectors to probe and manipulate the Wnt signaling pathway. PLoS One. 5 (2), e9370 (2010).
  19. . Leica ASP300S - Advanced smart processor vacuum tissue processor, instructions for use, V 2.1 Available from: https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/media_product-download/2022-01/Leica_ASP300S_IFU_2v1N_en.pdf (2021)
  20. Thermo Scientific. . Microm EC350 Modular tissue embedding center Instruction manual. , (2009).
  21. Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Sci Rep. 10 (1), 12581 (2020).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır