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Résumé

Ce protocole offre un cadre systématique pour l’établissement d’organoïdes du cancer de l’ovaire à différents stades de la maladie et relève les défis de la variabilité spécifique à la patiente pour augmenter le rendement et permettre une expansion robuste à long terme pour des applications ultérieures. Il comprend des étapes détaillées pour le traitement des tissus, l’ensemencement, l’ajustement des exigences en matière de milieux et la coloration par immunofluorescence.

Résumé

Bien que la création d’une biobanque du cancer de l’ovaire à partir d’organoïdes dérivés de patientes et de leurs informations cliniques de base promette des avancées dans la recherche et les soins aux patients, la normalisation reste un défi en raison de l’hétérogénéité de cette tumeur maligne mortelle, combinée à la complexité inhérente à la technologie des organoïdes. Ce protocole adaptable fournit un cadre systématique pour réaliser le plein potentiel des organoïdes du cancer de l’ovaire en tenant compte de la variabilité des progéniteurs spécifique à la patiente. En mettant en œuvre un flux de travail expérimental structuré pour sélectionner des conditions de culture et des méthodes de semis optimales, avec des tests parallèles de semis 3D direct par rapport à une voie 2D/3D, nous obtenons, dans la plupart des cas, des lignes d’expansion à long terme robustes adaptées à une large gamme d’applications en aval.

Notamment, le protocole a été testé et s’est avéré efficace dans un grand nombre de cas (N = 120) de matériel de départ très hétérogène, y compris le cancer de l’ovaire de haut et de bas grade et les stades de la maladie avec réduction tumorale primaire, maladie récurrente et échantillons chirurgicaux post-néoadjuvants. Dans un environnement de signalisation exogène à faible Wnt et à BMP élevé, nous avons observé que les progéniteurs étaient différemment sensibles à l’activation de la voie Heregulin 1 ß (HERß-1), HERß-1 favorisant la formation d’organoïdes chez certains tout en l’inhibant chez d’autres. Pour un sous-ensemble d’échantillons du patient, la formation optimale d’organoïdes et la croissance à long terme nécessitent l’ajout du facteur de croissance des fibroblastes 10 et de la R-Spondine 1 au milieu.

De plus, nous soulignons les étapes critiques de la digestion tissulaire et de l’isolement des progéniteurs et indiquons des exemples où une brève culture en 2D sur du plastique est bénéfique pour la formation ultérieure d’organoïdes dans la matrice de type 2 de l’extrait de membrane basale. Dans l’ensemble, une biobanque optimale nécessite des tests systématiques de toutes les principales conditions en parallèle afin d’identifier un environnement de croissance adéquat pour les lignées individuelles. Le protocole décrit également la procédure de manipulation pour un enrobage, une coupe et une coloration efficaces afin d’obtenir des images haute résolution des organoïdes, ce qui est nécessaire pour un phénotypage complet.

Introduction

La prise en charge clinique des patientes atteintes d’un cancer épithélial de l’ovaire reste difficile en raison de sa présentation clinique hétérogène à des stades avancés et de ses taux de récidive élevés1. Pour mieux comprendre le développement du cancer de l’ovaire et le comportement biologique, il faut des approches de recherche qui tiennent compte de la variabilité spécifique à la patiente au cours de la maladie, de la réponse au traitement et des caractéristiques histopathologiques et moléculaires2.

La biobanque, caractérisée par la collecte systématique et la conservation à long terme d’échantillons tumoraux provenant de patientes atteintes d’un cancer de l’ovaire ainsi que de leurs informations cliniques, offre la préservation d’une large cohorte de patientes à différents stades de la maladie, y compris des échantillons tumoraux provenant de chirurgies primaires de réduction tumorale, après une chimiothérapie néoadjuvante et d’une maladie récurrente. Il présente un potentiel précieux pour faire progresser la recherche sur le cancer en tant que ressource de biomarqueurs pronostiques prometteurs et de cibles thérapeutiques3. Cependant, les méthodes conventionnelles de biobanque, telles que la fixation et la congélation du formol, ne se prêtent pas à la réalisation d’études fonctionnelles sur les échantillons tumoraux d’origine en raison de la perte de viabilité et de la perturbation de l’architecture tissulaire tridimensionnelle native 4,5.

Les études des mécanismes moléculaires, en oncologie et au-delà, dépendent de manière cruciale de l’utilisation de modèles expérimentaux appropriés qui reflètent fidèlement la biologie de la maladie et maintiennent les propriétés in vitro du tissu observé in vivo. Les organoïdes dérivés du patient, basés sur la préservation du potentiel de renouvellement, reproduisent en laboratoire la structure et la fonction d’origine de l’épithélium et permettent des tests dans un contexte spécifique au patient. Par conséquent, ils sont devenus des outils très prometteurs pour la recherche sur le cancer et la médecine personnalisée, comblant le fossé entre la diversité clinique et la recherche en laboratoire 6,7,8,9. Des stratégies thérapeutiques sur mesure basées sur les réponses médicamenteuses individuelles des lignées organoïdes et l’évaluation de la pertinence fonctionnelle des profils moléculaires peuvent potentiellement être appliquées directement aux soins aux patients10,11. La possibilité d’une culture à long terme incluant des caractéristiques spécifiques au patient et la collecte de données cliniques prospectives pertinentes au fil du temps est très prometteuse pour identifier de nouveaux facteurs pronostiques et prédictifs impliqués dans la progression de la maladie et les mécanismes de résistance 3,9.

Néanmoins, la construction d’une biobanque comprenant des organoïdes provenant de différents échantillons tumoraux nécessite une combinaison de respect strict d’une méthodologie complexe et de mise en place de protocoles pour une maintenance facile12. La standardisation des processus garantit que la biobanque peut être établie et entretenue efficacement par du personnel formé, même en cas de chiffre d’affaires élevé, tout en respectant les normes de qualité les plus élevées13. Plusieurs études ont rapporté la génération réussie de lignées organoïdes stables pour le cancer de l’ovaire correspondant au profil mutationnel et phénotypique de la tumeur d’origine avec des taux d’efficacité variables. Pourtant, la biobanque de routine reste difficile dans la pratique, en particulier pour la croissance stable à long terme des lignées, qui est une condition préalable à une expansion à grande échelle ou à une édition génomique réussie.

En particulier, la question de l’extensibilité reste vaguement définie sur le terrain car les organoïdes qui présentent un potentiel de croissance lent et limité sont parfois comptés comme des lignées établies. Comme l’ont initialement démontré Hoffmann et al., une étude dont les principaux résultats ont servi de base à ce protocole plus développé, la manipulation optimale du tissu cancéreux de l’ovaire nécessite une stratégie unique pour s’adapter à l’hétérogénéité14. La caractérisation phénotypique des organoïdes obtenus par cette méthode et l’étroite similitude avec le tissu tumoral parental ont été confirmées par le séquençage de l’ADN et l’analyse transcriptomique des cultures matures (4-10 mois de culture) démontrant la stabilité du modèle 8,9,12,14.

Contrairement à l’environnement paracrine qui régule l’homéostasie dans les trompes de Fallope saines, la couche épithéliale, qui produit probablement un cancer de l’ovaire séreux de haut grade (HGSOC), un potentiel de régénération du cancer et une capacité de formation d’organoïdes, est moins dépendante de la supplémentation exogène en Wnt. De plus, la signalisation active de la protéine morphogénétique osseuse (BMP), caractérisée par l’absence de Noggin dans le milieu organoïde, s’est avérée bénéfique pour l’établissement de cultures à long terme à partir de dépôts de tissus solides du cancer de l’ovaire14,15. Au cours de la biobanque systématique de dépôts solides de cancer de l’ovaire, nous avons confirmé ces résultats et mis en place le pipeline, avec des détails décrits dans ce protocole qui assure une expansion soutenue à long terme dans la majorité des cas. Nous constatons que les tests parallèles de différentes compositions de milieux et modalités d’ensemencement lors de l’utilisation d’isolats primaires sont essentiels pour améliorer l’établissement de lignées organoïdes stables à long terme et pour augmenter les rendements permettant une propagation robuste et une expansion vers des formats multipuits requis pour les expériences en aval16.

En outre, la pureté et la qualité des échantillons prélevés lors de la chirurgie sont d’une importance cruciale pour le potentiel translationnel des organoïdes du cancer de l’ovaire dans la recherche fondamentale et le diagnostic moléculaire. La complexité de la présentation clinique du HGSOC nécessite une coopération étroite entre les chirurgiens, les oncologues et les scientifiques du laboratoire pour s’assurer que le matériel pertinent est correctement identifié, que les conditions de transport sont maintenues constantes et que les lignées organoïdes sont générées avec une grande efficacité représentant les caractéristiques les plus importantes de la maladie de chaque patient. Ce protocole fournit un cadre standardisé mais adaptable pour saisir tout le potentiel des organoïdes du cancer de l’ovaire, compte tenu de l’hétérogénéité qui caractérise le cancer de l’ovaire16,17. Ce protocole permet notamment une biobanque fiable du large spectre de la présentation clinique du cancer de l’ovaire, y compris différents types histologiques (cancer de l’ovaire de haut grade et de bas grade, LGSOC), différents dépôts provenant des mêmes patientes qui présentent des différences dans la régulation de la souche, des tissus provenant de chirurgies en contexte post-néoadjuvant, du matériel de biopsie et des échantillons de chirurgies dans la phase récurrente de progression de la maladie.

Protocole

Des échantillons de tissus tumoraux provenant de chirurgies du cancer de l’ovaire ont été collectés et des organoïdes dérivés de patientes ont été générés conformément au comité d’éthique de l’Université LMU (17-471), conformément aux réglementations européennes, nationales et locales applicables. Chaque patient participant à l’étude a donné son consentement par écrit. Lorsque vous travaillez avec des échantillons de tissus frais, une autorisation de sécurité de niveau de biosécurité 2 et des armoires à flux laminaire sont requises. Compte tenu de la nature potentiellement infectieuse des échantillons de tissus, qui ne peut être exclue en raison de l’absence de tests de routine pour les maladies infectieuses pertinentes, il est nécessaire de veiller à ce que les réglementations institutionnelles en matière de biosécurité soient strictement respectées et à ce que des équipements de protection individuelle adéquats soient disponibles pour le personnel menant les expériences.

1. Préparatifs

  1. Préparation moyenne
    1. Préparez les médias 2D et 3D une fois par semaine et conservez-les à 4 °C.
      REMARQUE : La composition exacte des ingrédients pour chaque milieu est indiquée dans le tableau 1. Le milieu 1 du cancer de l’ovaire (OCM1) et l’OCM2 peuvent être complétés par HER1ß (concentration finale : 50 ng/mL), ce qui entraîne quatre conditions différentes : OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß.
    2. Créer des solutions mères de réactifs de facteur de croissance et les conserver à 20 °C et de A83-01 et de nicotinamide (stockage à +4 °C). En raison de la sensibilité à la température des facteurs de croissance, utiliser immédiatement des solutions mères décongelées pour la préparation du milieu et éviter les cycles de décongélation répétés en créant des aliquotes.
      REMARQUE : La préparation des supports est une étape critique qui doit être strictement contrôlée.
    3. Préparation du milieu conditionné RSPO-1
      1. Décongeler rapidement les lymphocytes T HA-R-Spondin1-Fc 293 (stockage à -80 °C) à 37 °C. Lavez-les avec 10 mL de milieu de culture basal, complété par 10 % de sérum de veau fœtal (SCF), ci-après appelé milieu de culture basal++.
      2. Remettre la pastille en suspension dans 12 mL de milieu de culture basal++ et l’ensemencer dans une fiole T75.
      3. Diviser les cellules dans un rapport de 1 :6 avec un réactif de dissociation contenant de la trypsine (4 min à 37 °C) lorsque les cellules atteignent la confluence. Semez-les dans une nouvelle fiole T75.
      4. Le lendemain, ajouter la phléomycine D1 (1,25 μL/mL) au milieu.
      5. Divisez les cellules dans un rapport de 1 :20 avec la trypsine (4 min à 37 °C) lorsque les cellules atteignent la confluence. Ensemencer les cellules dans plusieurs fioles T75 (nombre de fioles en fonction du volume final visé) dans 30 mL de milieu de culture basal++ (contenant 10 % de FCS) complété par de la phléomycine D1.
      6. Démarrer la production de milieux conditionnés lorsque les cellules atteignent environ 50 % de confluence : remplacer le milieu par 40 mL de milieu de culture de base complété par 5 % de FCS sans phléomycine D1.
      7. Récupérez le premier surnageant après 3 jours. Pour éliminer les débris, centrifugez pendant 10 min à 1 200 × g. Conserver le surnageant dans un récipient stérile à 4 °C.
      8. Ajouter un nouveau milieu de culture basal complété par 5 % de FCS dans les cellules. Récupérez le deuxième surnageant après 3-4 jours. Centrifuger pendant 10 min à 1 200 × g. Ajoutez le deuxième surnageant au premier surnageant.
      9. Filtrer le milieu conditionné à l’aide d’un filtre à bouchon de 0,2 μm.
      10. Pour le contrôle de la qualité et la quantification de RSPO1, ajoutez le milieu produit à une lignée cellulaire 293T (293T WntR, 7xTcf-eGFP)14, transduite de manière stable avec un plasmide GFP portant le rapporteurWnt 18.
        REMARQUE : En fonction de la quantité et de l’intensité du signal GFP, l’activité de RSPO1 en tant qu’agoniste de la voie Wnt est testée par la quantification de la lignée cellulaire rapporteuse Wnt.
      11. Conserver des aliquotes de 15 mL pour une utilisation immédiate (dans un délai de 1 semaine) à 4 °C. Pour une conservation plus longue (6 mois), maintenez le fluide conditionné à -20 °C.

2. Initiation d’une culture d’organoïdes du cancer de l’ovaire

  1. Isolement des tissus primaires
    1. Transporter les tissus frais et viables, de préférence immédiatement après la chirurgie, et effectuer l’isolement dans un délai maximum de 20 heures après le prélèvement. Assurez-vous de bonnes conditions de transport dans le milieu de prélèvement de tissus avec une boîte de transport équipée de compresses froides à environ 4 °C.
    2. En laboratoire, préparez les réactifs et l’équipement nécessaires pour faciliter le traitement rapide des échantillons :
      1. Matrice d’extrait de membrane basale de type II (matrice BME 2) sur glace (environ 2 h).
      2. Préparez des scalpels jetables, des outils de dissection stérilisés (ciseaux et pince à épiler) et des inserts filtrants de 400 μm pour des tubes de 50 ml.
      3. Préparez un récipient avec une petite quantité d’azote liquide pour la congélation instantanée et un bain-marie préchauffé à 37 °C.
        REMARQUE : Travailler dans une hotte à flux laminaire de culture cellulaire.
    3. Lavez soigneusement le tissu frais dans une boîte de Pétri dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (sans Ca++ ni Mg++). À l’intérieur de la boîte de Pétri, fragmentez le tissu à l’aide des scalpels et/ou des ciseaux jetables en petits morceaux de 3 à 5 mm.
    4. Séparez le tissu obtenu en trois sections aux fins suivantes :
      1. Prélever les tissus dans des tubes cryogéniques. Transférez les tubes cryogéniques dans le récipient préparé rempli d’azote liquide pour la congélation choc.
      2. Prélever des tissus (2-3 mm) dans un récipient histologique rempli de formol pour la fixation (24 h) et les incorporer dans de la paraffine à des fins de coloration 19,20.
      3. De plus, homogénéisez le tissu avant la digestion enzymatique. Maximisez la dissociation mécanique avec un scalpel et transférez-la dans un tube de tissu de 50 ml.
        REMARQUE : Assurez-vous que le tissu est toujours trempé dans du PBS pendant l’homogénéisation pour éviter le dessèchement du tissu.
    5. Combiner le tissu homogénéisé avec un mélange digestif contenant du PBS (sans Ca++ et Mg++), de la collagénase I (solution mère 5 U/μL, concentration finale 1 U/μL) et un inhibiteur sélectif de ROCK1 et 2 (concentration finale de 3 μM) (composants énumérés dans le tableau 1). Utilisez 15 ml de mélange de digestion dans un tube de 50 ml pour chaque 2 cm3 de la tumeur.
      REMARQUE : Un matériel limité (p. ex., échantillons de biopsie) ne nécessite que de petites quantités (environ 2 à 3 ml) de mélange de digestion pour assurer la dissociation enzymatique.
    6. Pour la dissociation enzymatique, incuber le tube pendant 1,5 h dans un bain-marie à 37 °C. Effectuer des tourbillons sporadiques et vigoureux (environ toutes les 20 minutes pendant 10 à 15 s) pour favoriser la dissociation mécanique.
    7. Après l’incubation, ajouter 15 mL de milieu de culture basal froid++ dans le tube. Centrifuger 5 min à 300 × g.
    8. Après avoir retiré le surnageant, ajouter 5 mL de nouveau milieu de culture basal++. Filtrer la suspension cellulaire à l’aide d’un filtre de 400 μm dans un tube frais de 50 mL.
    9. Centrifuger pendant 5 min à 300 × g. Retirez le surnageant et conservez la pastille cellulaire.
    10. Pour éliminer les érythrocytes, ajoutez 5 mL de tampon de lyse des globules rouges (GR) à la pastille cellulaire. Incuber au bain-marie pendant 5 min à 37 °C.
    11. Ajouter 5 mL de milieu de culture basal++ pour l’inactivation de la lyse. Centrifuger pendant 5 min à 300 × g. Ajouter 3 mL de milieu de culture basal++ à la pastille cellulaire.
    12. Compter les cellules viables après dilution 1 :1 avec une solution de coloration au bleu de trypan (par exemple, 10 μL de l’échantillon + 10 μL de solution de coloration au bleu de trypan) dans un compteur de cellules automatique ou manuellement dans une chambre de Neubauer.
    13. Calculez le nombre de cellules nécessaires pour l’ensemencement direct en 3D. Pour chaque dépôt tumoral, ensemencer dans une plaque de format 48 puits au moins 2-3 puits par milieu de cancer de l’ovaire, ce qui correspond à un total de 8-12 puits dans une matrice d’ensemencement (OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß). Calculez 30 000 cellules pour chaque puits dans une gouttelette de 25 μL de matrice BME de type 2. En option, choisissez un format de 24 puits avec 50 μL de matrice BME 2 et 50 000 cellules ensemencées par puits.
    14. Ensemencez les cellules restantes en 2D (voir étape 2.1.13).
    15. Pipeter la quantité de milieu de culture basal++ en suspension contenant le nombre total de cellules nécessaires dans un nouveau tube et centrifuger pendant 5 min à 300 × g. Retirez le surnageant et conservez la pastille cellulaire.
    16. Sur la glace, ajouter la quantité totale de matrice BME 2 froide (25 μL pour chaque puits dans une plaque de format 48 puits ; donc, 100 μL pour 4 puits) à la pastille et bien mélanger pour obtenir une répartition uniforme des cellules par puits en pipetant doucement la pastille de haut en bas sans créer de bulles.
    17. Ensemencer les cellules dans des gouttelettes de matrice BME 2 (25 μL) dans la plaque vide préchauffée à 48 puits. Pour obtenir une distribution uniforme entre les puits, déplacez doucement et lentement la pipette de haut en bas (3-4x) à l’intérieur du tube avant de transférer la gouttelette de la matrice BME 2 dans chaque puits pour éviter la précipitation des cellules pendant la distribution.
    18. Après avoir incubé la plaque à 37 °C pendant au moins 30 min pour consolider les gouttelettes de la matrice BME 2, pipeter 250 μL de chacun des quatre milieux du cancer de l’ovaire (OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß) dans les puits correspondants.
    19. Parallèlement à la procédure d’ensemencement 3D direct, préserver les cellules isolées restantes en commençant une culture 2D.
      1. Après centrifugation pendant 5 min à 300 × g, ajoutez le granulé au milieu 2D. Sélectionnez le format (fiole T75 ou fiole T25), en fonction du nombre de cellules disponibles après l’ensemencement 3D.
      2. Incuber le ballon pendant 3 à 5 jours à 37 °C pour l’adhérence des cellules. Gardez le même milieu pendant les 72 premières heures.
      3. Lorsque les cellules atteignent la confluence, transférez la culture dans la matrice BME 2. Ne pas développer les isolats primaires en culture 2D en les fractionnant, car la propagation à long terme en 2D nuit au potentiel de souche.
  2. Transfert de la culture 2D à la culture 3D
    1. Dans la fiole T75 ou T25, laver la monocouche 2x avec 5 mL de PBS pour détacher les cellules de la surface inférieure. Incuber avec 1 mL de trypsine pendant 10 min à 37 °C.
    2. Ajouter 5 mL de milieu de culture basal froid++ pour l’inactivation du réactif de dissociation. Centrifuger pendant 5 min à 300 × g.
    3. Ajouter 3 mL de milieu de culture basal++ à la pastille. Comptez les cellules comme décrit aux étapes 2.1.12-2.1.13. Semences pour les différentes compositions de milieux (voir figure 1) comme décrit aux étapes 2.1.16 à 2.1.18.
  3. Évaluation de la croissance des organoïdes
    1. Imagez les puits au moins une fois par semaine pour documenter la croissance des organoïdes. Réalisez des images comparables de haute qualité de la culture 2D/3D et des plaques d’ensemencement direct par microscope à contraste de phase. Veillez à la cohérence du grossissement et utilisez 4x pour une vue d’ensemble des puits (quantification) et 10x et 20x pour documenter la morphologie des organoïdes.
    2. Organisez le stockage des images dans des dossiers dédiés à des lignes individuelles.
    3. Sélectionner la meilleure lignée d’organoïdes pour la culture à long terme par évaluation comparative de la formation d’organoïdes aux différentes modalités de semis (2D suivi d’un semis 3D versus semis 3D direct) et à différentes compositions de milieux (OCM1, OCM1+ HER1ß, OCM2 et OCM2+ HER1ß).
      1. En moyenne, 14 à 21 jours après l’isolement, évaluer le potentiel de formation d’organoïdes (quantité) ainsi que la taille et le phénotype cellulaire des organoïdes cultivés dans différentes conditions. Recherchez les caractéristiques suivantes : absence de vacuoles, bulle membranaire ou perte d’adhérence et arrondi des cellules.

3. Culture d’organoïdes à long terme

  1. Passage d’organoïdes
    1. Évitez de diviser les organoïdes trop fréquemment et pendant la phase proliférative. Effectuer des procédures de digestion mécanique et enzymatique à des intervalles de plus de 10 jours.
    2. Pour perturber chaque gouttelette de matrice BME 2, ajoutez 250 μL (format 48 puits) ou 500 μL (format 24 puits) de milieu de culture basal glacé ++. Assurez-vous de la dissolution complète de la gouttelette et pipetez par intermittence de haut en bas et raclez le fond de la plaque. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml et placez-la sur de la glace. Ajouter 1 mL de milieu de culture basale glacé++.
      REMARQUE : L’efficacité d’élimination de la matrice BME 2 dépend fortement de la température du fluide, car la meilleure dissolution est obtenue en dessous de 4 °C.
    3. Pool 2-3 puits techniques de réplication pour une expansion uniforme. Centrifuger pendant 5 min à 300 × g. Inspectez le contenu de la suspension par rapport à la source de lumière pour voir si le gel BME 2 est toujours visible. Retirez le surnageant et répétez le lavage avec un milieu glacé si la matrice BME 2 est toujours visible.
    4. Incuber avec 1 mL de trypsine (conservée à 20-25 °C) dans un bain-marie à 37 °C pendant 7-10 min. Vortex sporadiquement pendant 10 s pour améliorer la dissociation. Inspectez le tube périodiquement visuellement pour voir si la dissociation progresse.
    5. Tirez la suspension cellulaire de haut en bas avec une seringue à travers une aiguille d’une taille allant de 23 G à 27 G. Vérifiez si de gros amas cellulaires sont toujours présents et répétez la procédure si nécessaire.
      REMARQUE : La fragmentation à travers une seringue est facultative et la taille de l’aiguille dépend de l’efficacité de dissociation requise. Une suspension cellulaire homogène conduit à une répartition uniforme entre les puits.
    6. Ajouter 1 mL de milieu de culture basal froid++ pour inactiver la réaction.
    7. FACULTATIF : Comptez les cellules comme décrit aux étapes 2.1.12-2.1.13 et décidez du rapport de division par rapport au passage parental (par exemple, puits 1 :3).
    8. Centrifuger pendant 5 min à 300 × g. Retirez le surnageant.
    9. Effectuer l’ensemencement comme décrit aux étapes 2.1.16 à 2.1.18 et appliquer le milieu organoïde optimal pour le cancer de l’ovaire en fonction de la culture à long terme déjà établie. Changez le milieu du cancer de l’ovaire tous les 3-4 jours.
    10. En cas de perturbation de la gouttelette de la matrice BME 2 lors du changement de milieu, envisager un réensemencement sans digestion enzymatique. Pour éviter toute perturbation de la gouttelette, effectuez soigneusement la procédure de changement de milieu sans pipetage direct sur la gouttelette de matrice BME 2. De plus, évitez de laisser une quantité excessive de milieu de culture basal résiduel++ sur la pastille avant la dilution avec la matrice BME 2 à l’étape 2.1.16 car cela pourrait affecter la fragilité des gouttelettes.
  2. Cryoconservation des organoïdes
    REMARQUE : Effectuer la cryoconservation des organoïdes pendant la phase de prolifération au cours de la première semaine après le passage.
    1. Perturber la gouttelette de la matrice BME 2 avec un milieu de culture basal glacé ++ selon l’étape 3.1.2. Après centrifugation et élimination du surnageant comme décrit à l’étape 3.1.3., travailler sur de la glace et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu de cryoconservation glacé. Transférez la suspension cellulaire dans des tubes cryogéniques prémarqués de 1,8 ml.
    2. Conservez les tubes dans un récipient de congélation contenant de l’alcool isopropylique prérefroidi et placez-les à -80 °C pendant la nuit.
    3. Conservez les tubes d’origine à -80 °C pendant 2 mois maximum. Transfert à l’azote liquide pour un stockage stable à long terme.
  3. Dégel des stocks d’organoïdes
    1. Préchauffer 9 mL de milieu de culture basal++ dans un bain-marie à 37 °C dans un tube de 15 mL marqué.
    2. Transférez le flacon de stockage souhaité du stockage à -80 °C ou à l’azote liquide dans un récipient de transport rempli d’azote liquide.
    3. Transférez le cryotube dans un bain-marie à 37 °C et agitez-le doucement jusqu’à ce que le matériau congelé près des parois du tube commence à dégeler.
    4. Répartir lentement la suspension organoïde dans le tube étiqueté rempli de 9 mL de milieu. Secouez doucement le tube. Centrifuger pendant 5 min à 300 × g et retirer le surnageant.
    5. Effectuer l’ensemencement comme décrit aux étapes 2.1.16 à 2.1.18 et appliquer le milieu organoïde optimal pour le cancer de l’ovaire en fonction des conditions de culture à long terme déjà déterminées pour la lignée individuelle.
  4. Fixation des organoïdes
    1. Effectuez le prélèvement d’organoïdes comme décrit aux étapes 3.1.2-3.1.3.
    2. Ajouter 3 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans du PBS (pH 7,4) et incuber pendant 1 h à température ambiante.
    3. Laver 2 fois avec 5 mL de PBS, centrifuger pendant 3 min à 300 × g et retirer le surnageant. Ajouter 4 ml de PBS frais à la pastille et la maintenir à 4 °C jusqu’à l’incorporation.
      REMARQUE : Les organoïdes fixes sont stables et le stockage à 4 °C est possible pendant 1 mois avant l’enrobage.
    4. Chauffer le gel histologique (conservé à -20 °C) à 65 °C jusqu’à liquéfaction.
    5. Détectez les organoïdes fixes installés et visibles au fond du tube. Retirez le surnageant. En cas de boulette de cellule perturbée, effectuer une centrifugation pendant 3 min à 300 × g et jeter le PBS surnageant.
    6. Suspendre la pastille dans 100 μL de gel chaud en pipetant doucement de haut en bas. Transférez la gouttelette sur un morceau de film d’étanchéité et laissez la solidification se produire après ~15 min à température ambiante.
    7. Déplacez la gouttelette de gel fixe vers la cassette de paraffine tissulaire. Appliquer des protocoles d’enrobage tissulaire standard19,20.
    8. Coupez des tranches de 5 à 10 μm d’épaisseur avec un outil de coupe de microsection. Transférer les coupes sur des lames d’histologie. Sécher les lames pendant 1 h à 65 °C ; Conservez-les dans un endroit sec.
  5. Coloration par immunofluorescence de coupes organoïdes
    1. Déplacer les lames préparées à travers des plateaux en verre avec les séries de dilution suivantes : 2 x 15 min d’agent d’élimination pour l’histologie ; 15 min 100% éthanol ; 1 min 100% éthanol ; 10 min d’éthanol à 96 % ; 5 min d’éthanol à 70 % ; 5 min 50% d’éthanol.
    2. Ajouter le PBS et garder 5 min sur le shaker à 100 tr/min. Répétez le lavage 2 fois.
    3. Ajouter une solution de récupération d’antigène (tampon tris(hydroxyméthyl)aminométhane-acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) [pH 9,0] ou citrate [pH 6,0]) aux lames placées dans la chambre thermostable. Dans un cuiseur vapeur, conservez le récipient avec les lames pendant 30 min, puis laissez refroidir à température ambiante.
    4. Répétez l’étape 3.5.2.
    5. Transférez la chambre contenant les lames pendant 15 min dans une solution détergente de perméabilisation à 1% (dans du PBS).
    6. Répétez l’étape 3.5.2.
    7. Tracez le contour de l’emplacement des organoïdes sur les lames avec un stylo à cire immunomarquant pour maintenir la gouttelette pendant les étapes suivantes.
    8. Ajouter sur chaque lame 100 μL de sérum à 10 % dans un milieu de dilution, selon l’espèce de l’anticorps secondaire.
    9. Répétez l’étape 3.5.2.
    10. Diluer les anticorps primaires dans un milieu pour obtenir un volume final de 100 μL. Conserver à 4 °C pendant au moins 16 h dans un plateau d’incubation ou une chambre d’humidité.
    11. Répétez l’étape 3.5.2.
    12. Diluer les anticorps secondaires dans un milieu, jusqu’à obtenir des gouttelettes de 100 μL, et conserver pendant 2 h à température ambiante dans un plateau d’incubation.
    13. Répétez l’étape 3.5.2.
    14. Ajouter une solution de contrecoloration nucléaire DAPI (4',6-Diamidin-2-phénylindol, dichlorhydrate) diluée dans un milieu de dilution 1 :1 000. Conserver 10 min à température ambiante pour l’incubation.
    15. Répétez l’étape 3.5.2.
    16. Ajoutez un support de montage et couvrez avec la lamelle. Fixez les lames avec du vernis à ongles transparent une fois sèches (environ après 8-12 h).
    17. Image avec un microscope confocal ou un autre microscope à fluorescence. Faites des images d’ensemble ainsi que des images détaillées des structures subcellulaires qui capturent les principales caractéristiques de la morphologie des organoïdes.

Résultats

Après la dissociation tissulaire initiale, la filtration et le comptage, les cellules sont ensemencées en parallèle directement au format 3D, comme expliqué ci-dessus, ainsi que la suspension dans le flacon pour une brève expansion 2D. Dans certains cas, l’expansion 2D transitoire influence positivement la formation de l’organoïde, et la lignée à long terme est établie avec succès par cette voie, tandis qu’un ensemencement 3D parallèle comparatif peut entraîner un arrêt de la croissance (

Discussion

Le protocole conçu répond aux défis précédents de la biobanque d’organoïdes du cancer de l’ovaire en ce qui concerne la formation d’organoïdes et le potentiel de passage à long terme et garantit la génération de lignées entièrement extensibles à partir de la majorité des dépôts tumoraux solides. Le processus de collecte chirurgicale d’échantillons tumoraux à utiliser pour la génération d’organoïdes a un impact significatif sur le rendement et le potentiel d’expansion. Des échantillons de...

Déclarations de divulgation

M.K. est inscrit en tant qu’inventeur sur un brevet lié à un milieu pour les organoïdes du cancer de l’ovaire. F.T. a reçu des fonds de recherche, un conseil consultatif, des honoraires et des frais de déplacement d’AstraZeneca, Clovis, Eisai, ImmunoGen, Medac, MSD, PharmaMar, Roche, SAGA diagnostics et Tesaro/GSK. S.M. a reçu des fonds de recherche, un conseil consultatif, des honoraires ou des frais de déplacement : AbbVie, AstraZeneca, Clovis, Eisai, GlaxoSmithKline, Hubro, Medac, MSD, Novartis, Nykode, Olympus, PharmaMar, Pfizer, Roche, Sensor Kinesis, Teva, Tesaro.

Remerciements

L’étude est financée par le Centre allemand de recherche sur le cancer DKTK, le site partenaire de Munich, un partenariat entre DKFZ et l’hôpital universitaire LMU Munich. L’étude est également soutenue par la subvention allemande Cancer Aid (#70113426 et #70113433). L’enrobage de paraffine de tissus et d’organoïdes a été effectué à la plateforme de l’Institut d’anatomie de la Faculté de médecine de la LMU de Munich. L’imagerie confocale a été réalisée à la plateforme de bioimagerie du Centre biomédical (BMC). Les auteurs tiennent à remercier Simone Hofmann, Maria Fischer, Cornelia Herbst, Sabine Fink et Martina Rahmeh, pour leur aide technique.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
100 Sterican 26 GBraun, Melsungen, Germany4657683
100 Sterican 27 GBraun, Melsungen, Germany4657705
293T HA Rspo1-FcR&D systems, Minneapolis, USA3710-001-01Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111
A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV)Merck, Darmstadt, Germany616454
Advanced DMEM/F-12 Medium Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA12634028
Anti-p53 antibody (DO1)Santa Cruz Biotechnology, Texas, USAsc-126
Anti-PAX8 antibodyProteintech, Manchester, UK 10336-1-AP
B-27 Supplement (50x)Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA17504-044
Bottle-top vacuum filter 0.2 µmCorning, Berlin, Germany 430049
CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria661175
CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria690160
CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria658175
Collagenase IThermo Scientific, Waltham, USA17018029
Costar 48-well Clear TC-treated Corning, Berlin, Germany 3548
Cryo SFMPromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, GermanyC-29912
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, PathclearR&D systems, Minneapolis, USA3533-005-02Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix  Corning, 356231 
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgGJackson Immuno715-175-151
DAKO  Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen RetrieverSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyC9999-1000ML
DAPIThermo Scientific, Waltham, USA62248
Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555Thermo Scientific, Waltham, USAA32794
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Scientific, Waltham, USAA32814
Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA14190-094
Epredia Richard-Allan Scientific HistoGelThermo Scientific, Waltham, USAEpredia HG-4000-012
Falcon 24-well Polystyrene Corning, Berlin, Germany 351447
Feather scalpel Pfm medical, Cologne, Germany200130010
Fetal Bovine SerumGibco, Thermo Scientific, Waltham, USA10270106
Formalin 37% acid free, stabilizedMorphisto, Offenbach am Main, Germany1019205000
GlutaMAXGibco, Thermo Scientific, Waltham, USA35050038
HEPES (1 M)Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA156630080
Human EpCAM/TROP-1 AntibodyR&D systems, Minneapolis, USAAF960
Human FGF10Peprotech, NJ, USA100-26
Human recombinant BMP2Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USAPHC7146
Human recombinant EGFGibco, Thermo Scientific, Waltham, USAPHG0311L
Human recombinant Heregulin beta-1Peprotech, NJ, USA100-03
LAS X core SoftwareLeica Microsystemshttps://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/
Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal MicroscopeLeica Microsystems
N-2 Supplement (100x)Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA17502-048
NicotinamideSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyN0636
Omnifix 1 mLBraun, Melsungen, Germany3570519
Paraffin
ParafilmOmnilab, Munich, Germany5170002
Paraformaldehyd Morphisto, Offenbach am Main, Germany1176201000
Pen StrepGibco, Thermo Scientific, Waltham, USA15140-122
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyP4333-100
PluriStrainer 400 µmPluriSelect, Leipzig, Germany43-50400-01
PrimocinInvivoGen, Toulouse, Franceant-pm-05
Red Blood Cell Lysing BufferSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany11814389001
RoticlearCarl Roth, Karlsruhe, GermanyA538.5
Surgipath ParaplastLeica, Wetzlar, Germany39602012
Thermo Scientific Nunc CryovialsThermo Scientific, Waltham, USA375418PK
Triton X-100Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyT8787
Trypan Blue StainSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyT8154
TrypLE Express Enzyme Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA12604-013
Tween-20PanReac AppliChem, Darmstadt, GermanyA4974-0100
Y-27632TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany1254
ZeocinInvitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USAR25001

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