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요약

이 프로토콜은 다양한 질병 단계의 난소암 오가노이드 확립을 위한 체계적인 프레임워크를 제공하고 환자별 변동성 문제를 해결하여 수율을 높이고 후속 응용 분야에서 강력한 장기 확장을 가능하게 합니다. 여기에는 조직 처리, 파종, 배지 요구 사항 조정 및 면역형광 염색을 위한 자세한 단계가 포함됩니다.

초록

임상 배경 정보와 함께 환자 유래 오가노이드로부터 난소암 바이오뱅크를 구축하면 연구 및 환자 치료의 발전이 기대되지만, 이 치명적인 악성 종양의 이질성과 오가노이드 기술의 고유한 복잡성으로 인해 표준화는 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 이 적응형 프로토콜은 전구세포의 환자별 가변성을 고려하여 난소암 오가노이드의 잠재력을 최대한 실현할 수 있는 체계적인 프레임워크를 제공합니다. 최적의 배양 조건과 파종 방법을 선택하기 위한 구조화된 실험 워크플로우를 구현하고 직접 3D 파종과 2D/3D 경로의 병렬 테스트를 통해 대부분의 경우 광범위한 다운스트림 응용 분야에 적합한 강력한 장기 확장 라인을 얻을 수 있습니다.

특히, 이 프로토콜은 고등급 및 저등급 난소암과 1차 용적 축소, 재발성 질환 및 선행 후 수술 표본을 포함한 매우 이질적인 시작 물질의 많은 증례(N = 120)에서 테스트 및 효과가 입증되었습니다. 낮은 Wnt, 높은 BMP 외인성 신호전달 환경 내에서, 우리는 전구세포가 헤레굴린 1 ß (HERß-1)-경로의 활성화에 다르게 취약하며, HERß-1이 어떤 곳에서는 오가노이드 형성을 촉진하는 반면 다른 곳에서는 오가노이드 형성을 억제하는 것을 관찰했습니다. 환자 샘플의 하위 집합의 경우 최적의 오가노이드 형성 및 장기 성장을 위해서는 섬유아세포 성장 인자 10 및 R-Spondin 1을 배지에 추가해야 합니다.

또한, 조직 분해 및 전구 세포 분리의 중요한 단계를 강조하고 플라스틱에 대한 2D의 짧은 배양이 기저막 추출물 유형 2 매트릭스의 후속 오가노이드 형성에 도움이 되는 예를 지적합니다. 전반적으로, 최적의 바이오뱅킹을 위해서는 개별 계통에 대한 적절한 성장 환경을 식별하기 위해 모든 주요 조건을 병행하여 체계적으로 테스트해야 합니다. 이 프로토콜은 또한 포괄적인 표현형에 필요한 오가노이드의 고해상도 이미지를 얻기 위한 효율적인 임베딩, 절편화 및 염색을 위한 처리 절차를 설명합니다.

서문

상피난소암 환자의 임상적 관리는 진행된 단계에서 이질적인 임상 양상과 높은 재발률로 인해 여전히 어려운 과제로 남아 있다1. 난소암의 발병과 생물학적 행동에 대한 이해를 높이려면 난소암의 진행 과정, 치료 반응, 조직병리학적 및 분자적 특징을 다루는 연구적 접근이 필요하다2.

난소암 환자로부터 유래한 종양 샘플과 임상 정보를 체계적으로 수집하고 장기간 보존하는 것이 특징인 바이오뱅킹은 1차 용적 축소 수술, 선행 화학요법 후 및 재발성 질환의 종양 샘플을 포함하여 다양한 질병 단계에서 대규모 환자 코호트를 보존할 수 있습니다. 유망한 예후 바이오마커 및 치료 표적의 자원 역할을 하는 암 연구를 발전시킬 수 있는 귀중한 잠재력을 가지고 있습니다3. 그러나 포르말린 고정 및 동결과 같은 기존의 바이오뱅킹 방법은 생존력의 상실과 본래의 3차원 조직 구조의 파괴로 인해 원래의 종양 샘플에 대한 기능적 연구를 수행할 수 없습니다 4,5.

종양학 및 그 이상의 분자 메커니즘에 대한 연구는 질병의 생물학을 충실히 반영하고 생체 내에서 관찰된 조직의 체외 특성을 유지하는 적절한 실험 모델의 사용에 결정적으로 의존합니다. 재생 잠재력의 보존을 기반으로 하는 환자 유래 오가노이드는 실험실에서 상피의 원래 구조와 기능을 재현하고 환자별 맥락에서 테스트할 수 있습니다. 따라서 암 연구 및 개인 맞춤형 의학을 위한 매우 유망한 도구로 부상하여 임상 다양성과 실험실 연구 사이의 격차를 해소하고있습니다 6,7,8,9. 오가노이드 라인의 개별 약물 반응과 분자 프로파일의 기능적 관련성 테스트를 기반으로 하는 맞춤형 치료 전략은 잠재적으로 환자 치료에 직접 적용될 수 있습니다10,11. 환자별 특성을 포함한 장기 배양 가능성과 시간 경과에 따른 관련 전향적 임상 데이터 수집은 질병 진행 및 내성 메커니즘과 관련된 새로운 예후 및 예측 요인을 식별할 수 있는 큰 가능성을 가지고 있습니다 3,9.

그럼에도 불구하고 다양한 종양 샘플의 오가노이드를 포함하는 바이오뱅크를 구축하려면 복잡한 방법론을 엄격하게 준수하고 손쉬운 유지 관리를 위한 프로토콜을 설정해야 합니다12. 프로세스 표준화는 높은 이직률에도 훈련된 직원이 바이오뱅크를 효율적으로 설립하고 유지할 수 있도록 하는 동시에 최고 품질 표준13을 준수할 수 있도록 합니다. 여러 연구에서 다양한 효율로 원래 종양의 돌연변이 및 표현형 프로파일에 해당하는 안정적인 난소암 오가노이드 라인의 성공적인 생성을 보고했습니다. 그럼에도 불구하고 일상적인 바이오 뱅킹은 특히 대규모 확장 또는 성공적인 게놈 편집의 전제 조건인 장기적이고 안정적인 계통 성장을 위해 실제로 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다.

특히, 확장성 문제는 성장 잠재력이 느리고 제한적인 오가노이드가 확립된 라인으로 간주되는 경우가 있기 때문에 현장에서 모호하게 정의되고 있습니다. Hoffmann et al.에 의해 처음 입증된 바와 같이, 난소암 조직의 최적 처리는 이질성을 수용하기 위한 독특한 전략이 필요하다14. 이 방법으로 수득한 오가노이드의 표현형 특성 분석 및 모체 종양 조직과의 밀접한 유사성은 성숙한 배양물(배양 4-10개월)의 패널 DNA 시퀀싱 및 전사체학 분석을 통해 확인되었으며, 이는 모델 8,9,12,14의 안정성을 입증했습니다.

건강한 나팔관의 항상성을 조절하는 측분비 환경과는 대조적으로, 고급 장액성 난소암(HGSOC), 암 재생 가능성 및 오가노이드 형성 능력을 생성할 가능성이 있는 상피층은 외인성 Wnt 보충에 덜 의존합니다. 또한, 오가노이드 배지에 Noggin이 없는 것을 특징으로 하는 활성 Bone Morphogenetic Protein(BMP) 신호전달은 난소암 고형 조직 침전물에서 장기 배양 확립에 도움이 되는 것으로 입증되었습니다14,15. 난소암의 고형 침전물에 대한 체계적인 바이오뱅킹 과정에서 우리는 이러한 발견을 확인하고 파이프라인을 설정했으며, 대부분의 사례에서 지속적인 장기 확장을 보장하는 이 프로토콜에 설명된 세부 사항을 제공합니다. 1차 분리체로 작업할 때 다양한 배지 조성 및 파종 양식에 대한 병렬 테스트는 장기적으로 안정적인 오가노이드 라인의 확립을 개선하고 수율을 높여 다운스트림 실험에 필요한 다중 웰 형식으로의 강력한 전파 및 확장을 가능하게 하는 데 필수적이라는 것을 발견했습니다16.

또한 수술 중 수집된 샘플의 순도와 품질은 기초 연구 및 분자 진단에서 난소암 오가노이드의 중개 잠재력에 매우 중요합니다. HGSOC의 임상 표현이 복잡하기 때문에 관련 물질을 정확하게 식별하고, 운송 조건을 일정하게 유지하고, 각 환자 질병의 가장 중요한 특성을 나타내는 오가노이드 라인을 고효율로 생성하기 위해 실험실의 외과의, 종양학자 및 과학자 간의 긴밀한 협력이 필요합니다. 이 프로토콜은 난소암을 특징짓는 이질성을 고려하여 난소암 오가노이드의 잠재력을 최대한 포착할 수 있는 표준화되었지만 적응 가능한 프레임워크를 제공합니다16,17. 특히, 이 프로토콜은 다양한 조직학적 유형(고등급 및 저등급 난소암, LGSOC), 줄기 조절에 차이를 보이는 동일한 환자의 다양한 침전물, 선행 후 수술 조직, 생검 재료 및 질병 진행의 재발 단계에서 수술 샘플을 포함하여 난소암 임상 증상의 광범위한 스펙트럼에 대한 신뢰할 수 있는 바이오뱅킹을 가능하게 합니다.

프로토콜

난소암 수술에서 얻은 종양 조직 표본을 수집하고 LMU 대학의 윤리 위원회(17-471)에 따라 환자 유래 오가노이드를 생성했으며, 기존의 해당 EU, 국가 및 지역 규정을 준수했습니다. 연구에 참여한 각 환자는 서면 형식으로 동의했습니다. 신선한 조직 샘플로 작업할 때 생물 안전 레벨 2 안전 허가 및 층류 캐비닛이 필요합니다. 관련 전염병에 대한 정기 검사가 없기 때문에 배제할 수 없는 조직 샘플의 잠재적 감염 특성을 감안할 때 제도적 생물 안전 규정을 엄격하게 준수하고 실험을 수행하는 직원에게 적절한 개인 보호 장비를 사용할 수 있도록 해야 합니다.

1. 준비

  1. 배지 준비
    1. 일주일에 한 번 2D 및 3D 배지를 새로 준비하고 4°C에서 보관합니다.
      참고: 각 배지에 대한 성분의 정확한 구성은 표 1에 나와 있습니다. 난소암 배지 1(OCM1)과 OCM2 모두 HER1ß(최종 농도: 50ng/mL)에 의해 추가로 보충될 수 있으며, 그 결과 OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß의 네 가지 조건이 발생합니다.
    2. 성장 인자 시약의 원액을 만들고 20 °C와 A83-01 및 니코틴아미드(+4 °C에서 보관)로 유지합니다. 성장 인자의 온도 민감성으로 인해 해동된 원액을 배지 준비를 위해 즉시 사용하고 부분 표본을 생성하여 반복적인 해동 주기를 피하십시오.
      참고: 미디어 준비는 엄격하게 제어해야 하는 중요한 단계입니다.
    3. RSPO-1 컨디셔닝 배지의 제조
      1. HA-R-Spondin1-Fc 293 T 세포(-80°C에서 보관)를 37°C에서 빠르게 해동합니다. 10mL의 기초 배양 배지로 세척하고 10% 태아 송아지 혈청(FCS)을 보충하며, 이후 기저 배양 배지++라고 합니다.
      2. 세포 펠릿을 12mL의 기초 배양 배지++에 재현탁시키고 T75 플라스크에 파종합니다.
      3. 세포가 합류점에 도달하면 트립신이 함유된 해리 시약을 사용하여 세포를 1:6의 비율로 분할합니다(37°C에서 4분). 새 T75 플라스크에 씨를 뿌립니다.
      4. 다음날 플로오마이신 D1(1,25μL/mL)을 배지에 추가합니다.
      5. 세포가 합류할 때 트립신과 1:20의 비율로 세포를 분할합니다(37°C에서 4분). 세포를 여러 개의 T75 플라스크(목표한 최종 부피에 따른 플라스크 수)에 넣고 30mL의 기초 배양 배지++(10% FCS 함유)에 넣고 플로마이신 D1을 보충합니다.
      6. 세포가 합류점의 약 50%에 도달하면 조절된 배지 생산을 시작합니다: 배지를 플로마이신 D1이 없는 5% FCS가 보충된 40mL의 기초 배양 배지로 교체합니다.
      7. 3일 후에 첫 번째 상층액을 수집합니다. 이물질을 제거하려면 1,200× g에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 멸균 용기에 담아 4°C로 보관합니다.
      8. 5% FCS가 보충된 새로운 기초 배양 배지를 세포에 추가합니다. 3-4일 후에 두 번째 상층액을 수집합니다. 1,200 × g에서 10분 동안 원심분리합니다. 두 번째 상층액을 첫 번째 상층액에 추가합니다.
      9. 0.2μm 병뚜껑 필터를 사용하여 조절된 배지를 걸러냅니다.
      10. 품질 관리 및 RSPO1 정량 분석을 위해 생산된 배지를 293T 세포주(293T WntR, 7xTcf-eGFP)14에 첨가하고 GFP-플라스미드 운반 Wnt 리포터18로 안정적으로 transduction합니다.
        참고: GFP 신호의 양과 강도에 따라 Wnt 경로의 작용제로서의 RSPO1의 활성은 Wnt 리포터 세포주의 정량화에 의해 테스트됩니다.
      11. 4°C에서 즉시 사용할 수 있도록 15mL의 분취액을 보관하십시오(1주일 이내). 더 오래 보관하려면(6개월) 조절된 매체를 -20°C로 유지하십시오.

2. 난소암 오가노이드 배양 시작

  1. 1차 조직 분리
    1. 신선하고 생존 가능한 조직을 가급적이면 수술 직후에 운반하고 채취 후 최대 20시간 이내에 격리를 수행합니다. 약 4°C에서 냉찜질이 장착된 운송 상자를 사용하여 조직 수집 배지에서 적절한 운송 조건을 확인하십시오.
    2. 실험실에서 적시에 시료를 처리할 수 있도록 필요한 시약과 장비를 준비합니다.
      1. 기저막 추출물 유형 II 매트릭스(BME 2 매트릭스)를 얼음(약 2시간)에서 해동합니다.
      2. 일회용 메스, 멸균된 해부 도구(가위 및 핀셋) 및 50mL 튜브용 400μm 크기의 필터 삽입물을 준비합니다.
      3. 급속 냉동을 위해 소량의 액체 질소가 담긴 용기와 37°C에서 예열된 수조를 준비합니다.
        알림: 세포 배양 층류 후드 내에서 작업하십시오.
    3. 페트리 접시의 신선한 조직을 인산염 완충 식염수(PBS)(Ca++ 및 Mg++ 제외)로 철저히 씻습니다. 페트리 접시 안에서 일회용 메스 및/또는 가위를 사용하여 조직을 3-5mm 크기의 작은 조각으로 조각냅니다.
    4. 얻은 조직을 다음 목적을 위해 세 부분으로 분리합니다.
      1. 극저온 튜브에서 조직을 수집합니다. 충격 동결을 위해 극저온 튜브를 액체 질소로 채워진 준비된 용기로 옮깁니다.
      2. 고정(2시간)을 위해 포르말린으로 채워진 조직학적 표본 용기에 조직(3-24mm)을 수집하고 염색 목적으로 파라핀에 삽입합니다19,20.
      3. 또한, 효소 소화 전에 조직을 균질화하십시오. 메스로 기계적 해리를 극대화하고 50mL 조직 튜브로 옮깁니다.
        알림: 조직이 건조되는 것을 방지하기 위해 균질화하는 동안 조직이 항상 PBS에 담가 있는지 확인하십시오.
    5. 균질화된 조직을 PBS(Ca++ 및 Mg++ 제외), 콜라겐분해효소 I(원액 5U/μL, 최종 농도 1U/μL) 및 선택적 ROCK1 및 2 억제제(3μM 최종 농도)( 표 1에 나열된 성분)를 포함하는 분해 혼합물과 결합합니다. 종양의 각2cm3 에 대해 50mL 튜브에 15mL의 분해 혼합물을 사용합니다.
      참고: 제한된 물질(예: 생검 샘플)은 효소 해리를 보장하기 위해 소량(약 2-3mL)의 분해 혼합물만 필요합니다.
    6. 효소 해리를 위해 튜브를 37°C의 수조에서 1.5시간 동안 배양합니다. 기계적 해리를 지원하기 위해 산발적이고 격렬한 소용돌이(20-10초 동안 약 15분마다)를 수행합니다.
    7. 배양 후 15mL의 저온 기초 배양 배지++를 튜브에 추가합니다. 원심분리기 300 × g에서 5분
    8. 상층액을 제거한 후 새로운 기초 배양 배지++ 5mL를 추가합니다. 400μm 필터를 사용하여 새 50mL 튜브에 세포 현탁액을 변형합니다.
    9. 300 × g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 유지하십시오.
    10. 적혈구 제거를 위해 5mL의 적혈구 용해(RBC) 완충액을 세포 펠릿에 추가합니다. 37°C의 수조에서 5분간 배양합니다.
    11. 용해 불활성화를 위해 5mL의 기초 배양 배지++를 추가합니다. 300 × g에서 5분 동안 원심분리합니다. 3mL의 기초 배양 배지++를 세포 펠릿에 추가합니다.
    12. 트리판 블루 염색 용액(예: 시료 10μL + 트리판 블루 염색 용액 10μL)으로 1:1 희석 후 자동 세포 카운터에서 또는 Neubauer 챔버에서 수동으로 생존 가능한 세포를 계수합니다.
    13. 직접 3D 시드에 필요한 셀 수를 계산합니다. 각 종양 침전물에 대해 난소암 배지당 최소 2-3웰을 48웰 형식 플레이트에 파종하며, 이는 파종 매트릭스(OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß)의 총 8-12웰에 해당합니다. BME Type 2 매트릭스의 25μL 액적에서 각 웰에 대해 30,000개의 세포를 계산합니다. 선택적으로, 50μL의 BME 2 매트릭스와 웰당 50,000개의 시드 셀이 있는 24웰 형식을 선택할 수 있습니다.
    14. 나머지 셀을 2D로 시드합니다(2.1.13단계 참조).
    15. 필요한 세포의 총 수를 포함하는 기초 배양 medium++ 현탁액의 양을 새 튜브에 피펫팅하고 300× g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 유지하십시오.
    16. 얼음 위에서 콜드 BME 2 매트릭스의 총량(48웰 형식 플레이트의 각 웰당 25μL, 따라서 4웰의 경우 100μL)을 펠릿에 추가하고 잘 혼합하여 기포를 생성하지 않고 펠릿을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 웰당 세포가 고르게 분포되도록 합니다.
    17. BME 2 매트릭스(25μL) 방울의 세포를 예열된 빈 48웰 플레이트에 파종합니다. 웰 간에 균일한 분포를 이루려면 BME 2 매트릭스 방울을 각 웰로 옮기기 전에 튜브 내부에서 피펫을 위아래로(3-4x) 부드럽게 움직여 분배 중 세포 침전을 방지합니다.
    18. BME 2 매트릭스의 액적을 통합하기 위해 플레이트를 37°C에서 최소 30분 동안 배양한 후, 4개의 난소암 배지(OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß) 각각을 250μL씩 피펫팅하여 해당 웰에 넣습니다.
    19. 직접 3D 파종 절차와 병행하여 2D 배양을 시작하여 분리된 나머지 세포를 보존합니다.
      1. 300× g에서 5분 동안 원심분리한 후 펠릿을 2D 배지에 첨가합니다. 3D 시드 후 사용할 수 있는 셀 수에 따라 형식(T75 플라스크 또는 T25 플라스크)을 선택합니다.
      2. 세포 접착을 위해 37°C에서 3-5일 동안 플라스크를 배양합니다. 처음 72시간 동안 동일한 매체를 유지하십시오.
      3. 세포가 합류점에 도달하면 배양액을 BME 2 매트릭스로 옮깁니다. 2D에서 장기간 전파하면 줄기 잠재력에 해로울 수 있으므로 분할하여 2D 배양에서 1차 분리물을 확장하지 마십시오.
  2. 2D 문화에서 3D 문화로 전환
    1. T75 또는 T25 플라스크에서 단층을 5mL의 PBS로 2배 세척하여 바닥 표면에서 세포를 분리합니다. 37°C에서 10분 동안 1mL의 트립신을 배양합니다.
    2. 해리 시약의 비활성화를 위해 5mL의 저온 기초 배양 medium++을 추가합니다. 300× g에서 5분 동안 원심분리합니다.
    3. 펠릿에 3mL의 기초 배양 배지++를 추가합니다. 2.1.12-2.1.13단계에 설명된 대로 셀 수를 셉니다. 2.1.16-2.1.18 단계에 설명된 대로 다양한 미디어 구성( 그림 1 참조)에 대한 시드입니다.
  3. 오가노이드 성장 평가
    1. 오가노이드 성장을 문서화하기 위해 적어도 일주일에 한 번 웰을 이미지화합니다. 2D/3D 배양에 대한 비교 가능한 고품질 이미지를 만들고 위상차 현미경으로 플레이트를 직접 파종합니다. 배율의 일관성을 유지하고 웰 개요(정량화)에 4x를 사용하고 오가노이드의 형태를 문서화하는 데 10x 및 20x를 사용합니다.
    2. 개별 라인 전용 폴더에 사진 저장을 구성합니다.
    3. 다양한 파종 방식(2D 후 3D 파종 대 직접 3D 파종)과 다양한 배지 구성(OCM1, OCM1+ HER1ß, OCM2 및 OCM2+ HER1ß)에서 오가노이드 형성을 비교 평가하여 장기 배양에 가장 적합한 오가노이드 라인을 선택합니다.
      1. 평균적으로 분리 후 14-21일 후에 오가노이드 형성 잠재력(양)과 다양한 조건에서 성장한 오가노이드의 크기 및 세포 표현형을 평가합니다. 액포의 부재, 막 블리빙 또는 접착력 손실, 세포 반올림과 같은 특징을 찾으십시오.

3. 장기 오가노이드 배양

  1. 오가노이드 통과
    1. 오가노이드를 너무 자주 그리고 증식 단계에서 분할하지 마십시오. 기계적 및 효소적 소화 절차를 10일 이상의 간격으로 수행합니다.
    2. 각 BME 2 매트릭스 액적을 파괴하려면 250μL(48웰 형식) 또는 500μL(24웰 형식)의 얼음처럼 차가운 기저 배양 배지++를 추가합니다. 물방울과 피펫이 간헐적으로 위아래로 완전히 용해되었는지 확인하고 플레이트 바닥을 긁어냅니다. 세포 현탁액을 15mL 튜브에 옮기고 얼음 위에 놓습니다. 얼음처럼 차가운 기초 배양 배지 1mL를 추가합니다.++.
      참고: BME 2 매트릭스의 제거 효율은 4°C 이하에서 최상의 용해가 이루어지기 때문에 매체 온도에 크게 좌우됩니다.
    3. 풀 2-3 기술 복제 우물 균일 확장. 300× g에서 5분 동안 원심분리합니다. 광원에 대해 현탁액의 내용물을 검사하여 BME 2 겔이 여전히 보이는지 확인합니다. 상층액을 제거하고 BME 2 매트릭스가 여전히 보이면 얼음처럼 차가운 매체로 세척을 반복합니다.
    4. 1 mL의 트립신(20-25 °C에서 보관)을 37°C의 수조에서 7-10분 동안 배양합니다. 해리를 강화하기 위해 10초 동안 산발적으로 소용돌이. 튜브를 주기적으로 육안으로 검사하여 해리가 진행되고 있는지 확인하십시오.
    5. 23G에서 27G 크기의 바늘을 통해 주사기로 세포 현탁액을 위아래로 당깁니다. 큰 세포 덩어리가 여전히 존재하는지 확인하고 필요한 경우 절차를 반복합니다.
      알림: 주사기를 통한 단편화는 선택 사항이며 바늘 크기는 필요한 해리 효능에 따라 다릅니다. 균질한 세포 현탁액은 웰 사이에 균일한 분포를 유도합니다.
    6. 1mL의 저온 기초 배양 배지++를 첨가하여 반응을 비활성화합니다.
    7. 선택 사항: 2.1.12-2.1.13단계에 설명된 대로 셀을 계산하고 상위 통로(예: 1:3 웰)에 대한 분할 비율을 결정합니다.
    8. 300× g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거합니다.
    9. 2.1.16-2.1.18 단계에 설명된 대로 파종을 수행하고 이미 확립된 장기 배양에 따라 각각의 최적 난소암 오가노이드 배지를 적용합니다. 난소암 배지는 3-4일마다 교체합니다.
    10. 배지 변화 중 BME 2 매트릭스 액적이 파괴되는 경우 효소 분해 없이 다시 파종하는 것을 고려하십시오. 액적의 붕괴를 방지하려면 BME 2 매트릭스 액적에 직접 피펫팅하지 않고 배지 교환 절차를 조심스럽게 수행하십시오. 또한 2.1.16단계에서 BME 2 매트릭스로 희석하기 전에 펠릿에 과도한 양의 잔류 기저 배양 배지++를 남겨 두면 액적의 취약성에 영향을 미칠 수 있으므로 피하십시오.
  2. 오가노이드의 동결 보존
    알림: 통과 후 첫 주에 증식 단계에서 오가노이드의 동결 보존을 수행합니다.
    1. 2단계에 따라 얼음처럼 차가운 기초 배양 medium++로 BME 3.1.2 매트릭스 액적을 파괴합니다. 단계 3.1.3.에 기술된 바와 같이 상층액을 원심분리하고 폐기한 후, 얼음 위에서 작업하고 세포 펠릿을 얼음 저온 동결 보존 배지 1mL에 재현탁시킵니다. 세포 현탁액을 사전 라벨링된 1.8ml 극저온 튜브로 옮깁니다.
    2. 튜브를 예절된 이소프로필 알코올 함유 냉동 용기에 보관하고 -80°C에서 밤새 둡니다.
    3. 스톡 튜브를 최대 80개월 동안 -2°C로 유지하십시오. 장기간 안정적인 보관을 위해 액체 질소로 옮깁니다.
  3. 오가노이드 스톡의 해동
    1. 라벨이 부착된 15mL 튜브의 37°C 수조에서 9mL의 기초 배양 배지++를 예열합니다.
    2. 원하는 스톡 바이알을 -80°C의 저장실에서 액체 질소로 옮기거나 액체 질소로 채워진 운송 용기로 옮깁니다.
    3. 극저온 튜브를 37°C의 수조로 옮기고 튜브 벽 근처의 동결 물질이 해동되기 시작할 때까지 부드럽게 저어줍니다.
    4. 오가노이드 현탁액을 9mL의 배지로 채워진 라벨이 붙은 튜브에 천천히 분배합니다. 튜브를 부드럽게 흔듭니다. 300× g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다.
    5. 2.1.16-2.1.18 단계에 설명된 대로 파종을 수행하고 개별 라인에 대해 이미 결정된 장기 배양 조건에 따라 각각의 최적 난소암 오가노이드 배지를 적용합니다.
  4. 오가노이드 고정
    1. 3.1.2-3.1.3단계에 설명된 대로 오가노이드 수집을 수행합니다.
    2. PBS(pH 7.4)에 4% 파라포름알데히드(PFA) 3mL를 넣고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
    3. PBS 5mL로 2회 세척하고 300× g에서 3분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거합니다. 펠릿에 신선한 PBS 4mL를 넣고 포입될 때까지 4°C에서 유지합니다.
      NOTE: 고정형 오가노이드는 안정적이며 4°C에서 1개월 동안 보관한 후 임베딩할 수 있습니다.
    4. 액화될 때까지 65°C에서 조직학적 겔(-20°C에서 보관)을 가열합니다.
    5. 튜브 바닥에 고정되고 보이는 고정 오가노이드를 감지합니다. 상층액을 제거합니다. 파쇄된 세포 펠릿의 경우 300× g 에서 3분 동안 원심분리를 수행하고 상층액 PBS를 폐기합니다.
    6. 펠릿을 100μL의 따뜻한 젤에 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 현탁합니다. 물방울을 밀봉 필름 조각으로 옮기고 실온에서 ~15분 후에 응고가 발생하도록 합니다.
    7. 고정된 겔 방울을 조직 파라핀 카세트로 옮깁니다. 표준 조직 매끼 프로토콜19,20을 수행합니다.
    8. 미세 절편 절삭 공구로 5-10 μm 두께의 조각을 자릅니다. 절단을 조직학 슬라이드로 옮깁니다. 슬라이드를 65°C에서 1시간 동안 건조시킵니다. 건조한 곳에 보관하십시오.
  5. 오가노이드 절편의 면역형광 염색
    1. 준비된 슬라이드를 다음 희석 시리즈가 있는 유리 트레이를 통해 이동합니다: 조직학을 위한 2 x 15분 투명화제; 15분 100% 에탄올; 1 분 100 % 에탄올; 10 분 96 % 에탄올; 5 분 70 % 에탄올; 5분 50% 에탄올.
    2. PBS를 추가하고 Shaker에서 100rpm으로 5분 동안 유지합니다. 세탁을 2회 반복합니다.
    3. 항원 회수 용액(트리스(하이드록시메틸)아미노메탄-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)-완충액[pH 9.0] 또는 시트레이트[pH 6.0])을 내열성 챔버에 놓인 슬라이드에 추가합니다. 찜기에서 슬라이드가 있는 용기를 30분 동안 보관한 다음 실온으로 식힙니다.
    4. 3.5.2단계를 반복합니다.
    5. 슬라이드가 포함된 챔버를 15분 동안 1% 투과화 세제 용액(PBS)으로 옮깁니다.
    6. 3.5.2단계를 반복합니다.
    7. 다음 단계에서 액적을 유지하기 위해 면역염색 왁스 펜으로 슬라이드에서 오가노이드의 위치를 윤곽을 그립니다.
    8. 2차 항체의 종에 따라 희석 배지에 10% 혈청 100μL를 각 슬라이드에 추가합니다.
    9. 3.5.2단계를 반복합니다.
    10. 1차 항체를 배지에 희석하여 최종 부피가 100μL가 되도록 합니다. 배양 트레이/습도 챔버에서 4°C에서 최소 16시간 동안 보관합니다.
    11. 3.5.2단계를 반복합니다.
    12. 2차 항체를 배지에 희석하여 100μL 방울을 만들고 배양 트레이에서 실온에서 2시간 동안 보관합니다.
    13. 3.5.2단계를 반복합니다.
    14. 희석 배지에 1:1,000으로 희석한 핵 대조염색 용액 DAPI(4',6-Diamidin-2-phenylindol, Dihydrochloride)를 추가합니다. 배양을 위해 실온에서 10분 동안 보관합니다.
    15. 3.5.2단계를 반복합니다.
    16. 장착 매체를 추가하고 커버슬립으로 덮습니다. 투명 매니큐어로 슬라이드를 고정합니다(약 8-12시간 후).
    17. 컨포칼 현미경 또는 다른 형광 현미경을 사용한 이미지. 오가노이드 형태학의 주요 특성을 포착하는 세포 내 구조의 상세한 이미지뿐만 아니라 전체 사진을 만드십시오.

결과

초기 조직 해리, 여과 및 계수 후 세포는 위에서 설명한 대로 3D 형식으로 직접 병렬로 파종되고 짧은 2D 확장을 위해 플라스크에 현탁됩니다. 경우에 따라 일시적인 2D 확장이 오가노이드 형성에 긍정적인 영향을 미치며, 이 경로를 통해 장기 라인이 성공적으로 설정되는 반면 비교 병렬 3D 시딩은 성장 정지를 초래할 수 있습니다(그림 1). 처리되는 각 기증자 조직에 대해 세포...

토론

설계된 프로토콜은 오가노이드 형성 및 장기 통과 가능성과 관련하여 난소암 오가노이드 바이오뱅킹의 이전 문제를 해결하고 대부분의 고형 종양 퇴적물에서 완전히 확장 가능한 라인의 생성을 보장합니다. 오가노이드 생성에 사용되는 종양 샘플의 외과적 수집 공정은 수율과 확장 가능성에 상당한 영향을 미칩니다. 종양 조직 샘플은 다중 내장 수술, 진단적 복강경 검사 또는 생검을 포함한 다?...

공개

M.K.는 난소암 오가노이드용 배지와 관련된 특허에 발명자로 등재되어 있습니다. F.T.는 아스트라제네카(AstraZeneca), 클로비스(Clovis), 에이사이(Eisai), 이뮤노젠(ImmunoGen), 메닥(Medac), MSD, 파마마(PharmaMar), 로슈(Roche), SAGA 진단(SAGA diagnostics), 테사로/GSK(Tesaro/GSK)로부터 연구비, 자문위원회, 사례금, 여행 경비를 지원받았다. S.M.은 애브비(AbbVie), 아스트라제네카(AstraZeneca), 클로비스(Clovis), 에이사이(Eisai), 글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline), 휴브로(Hubro), 메닥(Medac), MSD, 노바티스(Novartis), 니코드(Nykode), 올림푸스(Olympus), 파마마(PharmaMar), 화이자(Pfizer), 로슈(Roche), 센서 키네시스(Sensor Kinesis), 테바(Teva), 테사로(Tesaro)와 같은 연구 자금, 자문 위원회, 명예 또는 여행 경비를 지원받았습니다.

감사의 말

이 연구는 독일 암 연구 센터(German Cancer Research Center)의 자금 지원을 받고 있으며, 파트너 사이트인 뮌헨(Munich)은 DKFZ와 뮌헨 대학병원(University Hospital LMU Munich)의 파트너십을 맺고 있습니다. 이 연구는 또한 독일 암 원조 보조금(#70113426 및 #70113433)의 지원을 받습니다. 조직 및 오가노이드의 파라핀 임베딩은 뮌헨 LMU 뮌헨 의과대학 해부학 연구소의 핵심 시설에서 수행되었습니다. 공초점 이미징은 Biomedical Center(BMC)의 핵심 시설인 Bioimaging에서 수행되었습니다. 저자는 기술적인 도움을 준 Simone Hofmann, Maria Fischer, Cornelia Herbst, Sabine Fink 및 Martina Rahmeh에게 감사의 뜻을 전합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
100 Sterican 26 GBraun, Melsungen, Germany4657683
100 Sterican 27 GBraun, Melsungen, Germany4657705
293T HA Rspo1-FcR&D systems, Minneapolis, USA3710-001-01Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111
A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV)Merck, Darmstadt, Germany616454
Advanced DMEM/F-12 Medium Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA12634028
Anti-p53 antibody (DO1)Santa Cruz Biotechnology, Texas, USAsc-126
Anti-PAX8 antibodyProteintech, Manchester, UK 10336-1-AP
B-27 Supplement (50x)Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA17504-044
Bottle-top vacuum filter 0.2 µmCorning, Berlin, Germany 430049
CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria661175
CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria690160
CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria658175
Collagenase IThermo Scientific, Waltham, USA17018029
Costar 48-well Clear TC-treated Corning, Berlin, Germany 3548
Cryo SFMPromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, GermanyC-29912
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, PathclearR&D systems, Minneapolis, USA3533-005-02Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix  Corning, 356231 
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgGJackson Immuno715-175-151
DAKO  Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen RetrieverSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyC9999-1000ML
DAPIThermo Scientific, Waltham, USA62248
Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555Thermo Scientific, Waltham, USAA32794
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Scientific, Waltham, USAA32814
Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA14190-094
Epredia Richard-Allan Scientific HistoGelThermo Scientific, Waltham, USAEpredia HG-4000-012
Falcon 24-well Polystyrene Corning, Berlin, Germany 351447
Feather scalpel Pfm medical, Cologne, Germany200130010
Fetal Bovine SerumGibco, Thermo Scientific, Waltham, USA10270106
Formalin 37% acid free, stabilizedMorphisto, Offenbach am Main, Germany1019205000
GlutaMAXGibco, Thermo Scientific, Waltham, USA35050038
HEPES (1 M)Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA156630080
Human EpCAM/TROP-1 AntibodyR&D systems, Minneapolis, USAAF960
Human FGF10Peprotech, NJ, USA100-26
Human recombinant BMP2Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USAPHC7146
Human recombinant EGFGibco, Thermo Scientific, Waltham, USAPHG0311L
Human recombinant Heregulin beta-1Peprotech, NJ, USA100-03
LAS X core SoftwareLeica Microsystemshttps://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/
Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal MicroscopeLeica Microsystems
N-2 Supplement (100x)Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA17502-048
NicotinamideSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyN0636
Omnifix 1 mLBraun, Melsungen, Germany3570519
Paraffin
ParafilmOmnilab, Munich, Germany5170002
Paraformaldehyd Morphisto, Offenbach am Main, Germany1176201000
Pen StrepGibco, Thermo Scientific, Waltham, USA15140-122
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyP4333-100
PluriStrainer 400 µmPluriSelect, Leipzig, Germany43-50400-01
PrimocinInvivoGen, Toulouse, Franceant-pm-05
Red Blood Cell Lysing BufferSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany11814389001
RoticlearCarl Roth, Karlsruhe, GermanyA538.5
Surgipath ParaplastLeica, Wetzlar, Germany39602012
Thermo Scientific Nunc CryovialsThermo Scientific, Waltham, USA375418PK
Triton X-100Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyT8787
Trypan Blue StainSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyT8154
TrypLE Express Enzyme Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA12604-013
Tween-20PanReac AppliChem, Darmstadt, GermanyA4974-0100
Y-27632TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany1254
ZeocinInvitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USAR25001

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