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  • Einleitung
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  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet einen systematischen Rahmen für die Etablierung von Eierstockkrebs-Organoiden aus verschiedenen Krankheitsstadien und adressiert die Herausforderungen der patientenspezifischen Variabilität, um die Ausbeute zu erhöhen und eine robuste langfristige Expansion für nachfolgende Anwendungen zu ermöglichen. Es umfasst detaillierte Schritte für die Gewebeverarbeitung, die Aussaat, die Anpassung der Medienanforderungen und die Immunfluoreszenzfärbung.

Zusammenfassung

Während die Einrichtung einer Eierstockkrebs-Biobank aus patienteneigenen Organoiden zusammen mit ihren klinischen Hintergrundinformationen Fortschritte in der Forschung und Patientenversorgung verspricht, bleibt die Standardisierung aufgrund der Heterogenität dieser tödlichen Malignität in Kombination mit der inhärenten Komplexität der Organoidtechnologie eine Herausforderung. Dieses anpassungsfähige Protokoll bietet einen systematischen Rahmen, um das volle Potenzial von Eierstockkrebs-Organoiden unter Berücksichtigung einer patientenspezifischen Variabilität der Vorläuferzellen auszuschöpfen. Durch die Implementierung eines strukturierten experimentellen Arbeitsablaufs zur Auswahl optimaler Kulturbedingungen und Seeding-Methoden mit parallelen Tests der direkten 3D-Seeding im Vergleich zu einer 2D/3D-Route erhalten wir in den meisten Fällen robuste, langfristig expandierende Linien, die für eine breite Palette von Downstream-Anwendungen geeignet sind.

Insbesondere wurde das Protokoll in einer großen Anzahl von Fällen (N = 120) mit sehr heterogenem Ausgangsmaterial, einschließlich hochgradigem und niedriggradigem Eierstockkrebs und Stadien der Erkrankung mit primärem Debulking, rezidivierender Erkrankung und postneoadjuvanten chirurgischen Proben, getestet und als wirksam erwiesen. In einer exogenen Umgebung mit niedrigem Wnt und hohem BMP beobachteten wir, dass Vorläuferzellen unterschiedlich anfällig für die Aktivierung des Heregulin 1 ß (HERß-1)-Signalwegs sind, wobei HERß-1 in einigen die Organoidbildung fördert, während sie in anderen gehemmt wird. Für eine Teilmenge der Patientenproben erfordern eine optimale Organoidbildung und ein langfristiges Wachstum die Zugabe von Fibroblasten-Wachstumsfaktor 10 und R-Spondin 1 zum Medium.

Darüber hinaus heben wir die kritischen Schritte der Gewebeverdauung und der Vorläuferisolierung hervor und weisen auf Beispiele hin, bei denen eine kurze Kultivierung in 2D auf Kunststoff für die anschließende Organoidbildung in der Basalmembranextrakt-Typ-2-Matrix von Vorteil ist. Insgesamt erfordert ein optimales Biobanking eine systematische parallele Prüfung aller Hauptbedingungen, um ein adäquates Wachstumsumfeld für einzelne Sparten zu identifizieren. Das Protokoll beschreibt auch das Handhabungsverfahren für effizientes Einbetten, Schneiden und Färben, um hochauflösende Bilder von Organoiden zu erhalten, die für eine umfassende Phänotypisierung erforderlich sind.

Einleitung

Die klinische Behandlung von Patientinnen mit epithelialem Ovarialkarzinom bleibt aufgrund des heterogenen klinischen Erscheinungsbilds in fortgeschrittenen Stadien und der hohen Rezidivrateneine Herausforderung 1. Um die Entwicklung und das biologische Verhalten von Eierstockkrebs besser zu verstehen, sind Forschungsansätze erforderlich, die sich mit der patientenspezifischen Variabilität im Krankheitsverlauf, dem Ansprechen auf die Behandlung und den histopathologischen sowie molekularen Merkmalen befassen2.

Biobanking, das sich durch die systematische Sammlung und Langzeitkonservierung von Tumorproben von Eierstockkrebspatientinnen zusammen mit ihren klinischen Informationen auszeichnet, bietet die Erhaltung einer großen Patientenkohorte in verschiedenen Krankheitsstadien, einschließlich Tumorproben aus primären Debulking-Operationen, nach neoadjuvanter Chemotherapie und nach rezidivierenden Erkrankungen. Es birgt wertvolles Potenzial für die Weiterentwicklung der Krebsforschung und dient als Ressource für vielversprechende prognostische Biomarker und therapeutische Ziele3. Herkömmliche Biobanking-Methoden wie Formalinfixierung und Einfrieren sind jedoch aufgrund des Verlusts der Lebensfähigkeit und der Störung der nativen dreidimensionalen Gewebearchitektur nicht für die Durchführung funktioneller Studien an den ursprünglichen Tumorproben geeignet 4,5.

Studien zu molekularen Mechanismen in der Onkologie und darüber hinaus hängen entscheidend von der Verwendung geeigneter experimenteller Modelle ab, die die Biologie der Krankheit getreu widerspiegeln und die in vitro Eigenschaften des in vivo beobachteten Gewebes beibehalten. Von Patienten stammende Organoide, die auf der Erhaltung des Erneuerungspotenzials basieren, reproduzieren im Labor die ursprüngliche Struktur und Funktion des Epithels und ermöglichen Tests in einem patientenspezifischen Kontext. Daher haben sie sich als vielversprechende Werkzeuge für die Krebsforschung und die personalisierte Medizin erwiesen, die die Lücke zwischen klinischer Vielfalt und Laborforschung schließen 6,7,8,9. Maßgeschneiderte therapeutische Strategien, die auf individuellen Wirkstoffreaktionen von Organoidlinien und der Prüfung der funktionellen Relevanz molekularer Profile basieren, können möglicherweise direkt auf die Patientenversorgung angewendet werden10,11. Die Möglichkeit der langfristigen Kultivierung unter Einbeziehung patientenspezifischer Merkmale und der Sammlung relevanter prospektiver klinischer Daten im Laufe der Zeit ist vielversprechend, um neue prognostische und prädiktive Faktoren zu identifizieren, die an der Krankheitsprogression und den Resistenzmechanismen beteiligt sind 3,9.

Der Aufbau einer Biobank, die Organoide aus verschiedenen Tumorproben enthält, erfordert jedoch eine Kombination aus strikter Einhaltung komplexer Methoden und der Einrichtung von Protokollen für eine einfache Wartung12. Die Prozessstandardisierung stellt sicher, dass die Biobank auch bei hohem Umsatz effizient von geschultem Personal aufgebaut und gepflegt werden kann und gleichzeitig höchste Qualitätsstandards eingehalten werden13. Mehrere Studien berichteten über die erfolgreiche Erzeugung stabiler Ovarialkarzinom-Organoidlinien, die dem Mutations- und phänotypischen Profil des ursprünglichen Tumors mit unterschiedlichen Effizienzraten entsprechen. Dennoch bleibt das routinemäßige Biobanking in der Praxis eine Herausforderung, insbesondere für ein langfristig stabiles Wachstum der Linien, das eine Voraussetzung für eine groß angelegte Expansion oder eine erfolgreiche Genomeditierung ist.

Insbesondere das Problem der Erweiterbarkeit bleibt in der Praxis vage definiert, da Organoide, die ein langsames und begrenztes Wachstumspotenzial aufweisen, gelegentlich als etablierte Linien gezählt werden. Wie ursprünglich von Hoffmann et al. gezeigt, einer Studie, deren Hauptergebnisse die Grundlage für dieses weiterentwickelte Protokoll bildeten, erfordert der optimale Umgang mit Eierstockkrebsgewebe eine einzigartige Strategie, um der Heterogenität Rechnung zu tragen14. Die phänotypische Charakterisierung der mit dieser Methode erhaltenen Organoide und die enge Ähnlichkeit mit dem elterlichen Tumorgewebe wurden durch Panel-DNA-Sequenzierung und Transkriptomik-Analyse reifer Kulturen (4-10 Monate Kultivierung) bestätigt, was die Stabilität des Modellsbelegt 8,9,12,14.

Im Gegensatz zur parakrinen Umgebung, die die Homöostase in den gesunden Eileitern reguliert, ist die Epithelschicht, die wahrscheinlich hochgradigen serösen Ovarialkrebs (HGSOC), das Krebsregenerationspotenzial und die Organoidbildungskapazität hervorbringt, weniger abhängig von einer exogenen Wnt-Supplementierung. Darüber hinaus erwies sich die aktive Signalgebung des Bone Morphogenetic Protein (BMP), die durch das Fehlen von Noggin im Organoidmedium gekennzeichnet ist, als vorteilhaft für die Etablierung von Langzeitkulturen aus festen Gewebeablagerungen von Eierstockkrebs14,15. Während des systematischen Biobankings von festen Ablagerungen von Eierstockkrebs haben wir diese Ergebnisse bestätigt und die Pipeline eingerichtet, wobei die Details in diesem Protokoll beschrieben sind, die in den meisten Fällen eine nachhaltige langfristige Expansion gewährleisten. Wir stellen fest, dass parallele Tests verschiedener Medienzusammensetzungen und Aussaatmodalitäten bei der Arbeit mit primären Isolaten unerlässlich sind, um die Etablierung langzeitstabiler Organoidlinien zu verbessern und die Ausbeute zu erhöhen, die eine robuste Vermehrung und Erweiterung auf Multiwell-Formate ermöglicht, die für nachgelagerte Experimente erforderlich sind16.

Darüber hinaus sind die Reinheit und Qualität der während der Operation entnommenen Proben von entscheidender Bedeutung für das translationale Potenzial von Eierstockkrebs-Organoiden in der Grundlagenforschung und molekularen Diagnostik. Die Komplexität der klinischen Präsentation von HGSOC erfordert eine enge Zusammenarbeit zwischen den Chirurgen, Onkologen und den Wissenschaftlern im Labor, um sicherzustellen, dass relevantes Material korrekt identifiziert, die Transportbedingungen konstant gehalten und Organoidlinien mit hoher Effizienz erzeugt werden, die die wichtigsten Merkmale der Krankheit jedes Patienten darstellen. Dieses Protokoll bietet einen standardisierten, aber anpassungsfähigen Rahmen, um das volle Potenzial von Eierstockkrebs-Organoiden unter Berücksichtigung der Heterogenität zu erfassen, die Eierstockkrebs charakterisiert16,17. Insbesondere ermöglicht dieses Protokoll ein zuverlässiges Biobanking des breiten Spektrums des klinischen Erscheinungsbildes von Eierstockkrebs, einschließlich verschiedener histologischer Typen (hochgradiger und niedriggradiger Eierstockkrebs, LGSOC), verschiedener Ablagerungen von denselben Patientinnen, die Unterschiede in der Stammzellregulation aufweisen, Gewebe von Operationen in postneoadjuvanter Umgebung, Biopsiematerial und Proben von Operationen in der rezidivierenden Phase des Krankheitsverlaufs.

Protokoll

Tumorgewebeproben von Eierstockkrebsoperationen wurden gesammelt und von Patientinnen stammende Organoide wurden in Übereinstimmung mit der Ethikkommission der LMU (17-471) unter Einhaltung der geltenden EU-, nationalen und lokalen Vorschriften erzeugt. Jeder an der Studie beteiligte Patient hat schriftlich zugestimmt. Bei der Arbeit mit frischen Gewebeproben sind eine Sicherheitsgenehmigung der Biosicherheitsstufe 2 und Laminar-Flow-Werkbänke erforderlich. Angesichts des potenziell infektiösen Charakters der Gewebeproben, der aufgrund fehlender Routinetests auf relevante Infektionskrankheiten nicht ausgeschlossen werden kann, muss sichergestellt werden, dass die institutionellen Biosicherheitsvorschriften strikt eingehalten werden und dass dem Personal, das die Experimente durchführt, angemessene persönliche Schutzausrüstung zur Verfügung steht.

1. Vorbereitungen

  1. Mittlere Vorbereitung
    1. Bereiten Sie die 2D- und 3D-Medien einmal pro Woche frisch vor und lagern Sie sie bei 4 °C.
      HINWEIS: Die genaue Zusammensetzung der Inhaltsstoffe für jedes Medium ist in Tabelle 1 aufgeführt. Sowohl Ovarialkarzinom Medium 1 (OCM1) als auch OCM2 können zusätzlich durch HER1ß (Endkonzentration: 50 ng/ml) ergänzt werden, was zu vier verschiedenen Erkrankungen führt: OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß.
    2. Es werden Stammlösungen der Wachstumsfaktorreagenzien hergestellt und bei 20 °C sowie von A83-01 und Nicotinamid (Lagerung bei +4 °C) aufbewahrt. Aufgrund der Temperaturempfindlichkeit der Wachstumsfaktoren sofort aufgetaute Stammlösungen für die Mediumaufbereitung verwenden und wiederholte Auftauzyklen durch die Bildung von Aliquoten vermeiden.
      HINWEIS: Die Medienvorbereitung ist ein kritischer Schritt, der streng kontrolliert werden muss.
    3. Herstellung von RSPO-1 konditioniertem Medium
      1. HA-R-Spondin1-Fc 293 T-Zellen (Lagerung bei -80 °C) schnell bei 37 °C auftauen. Waschen Sie sie mit 10 ml Basalkulturmedium, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), im Folgenden als Basalkulturmedium++ bezeichnet.
      2. Das Zellpellet wird in 12 ml Basalkulturmedium++ resuspendiert und in einem T75-Kolben ausgesät.
      3. Teilen Sie die Zellen im Verhältnis 1:6 mit einem Dissoziationsreagenz mit Trypsin (4 min bei 37 °C), wenn die Zellen die Konfluenz erreichen. Säen Sie sie in einen neuen T75-Kolben.
      4. Am nächsten Tag geben Sie Phleomycin D1 (1,25 μl/ml) in das Medium.
      5. Teilen Sie die Zellen im Verhältnis 1:20 mit Trypsin (4 min bei 37 °C), wenn die Zellen die Konfluenz erreichen. Die Zellen werden in mehrere T75-Kolben (Anzahl der Kolben entsprechend dem angestrebten Endvolumen) in 30 ml Basalkulturmedium++ (mit 10 % FCS) und ergänzt mit Phleomycin D1 ausgesät.
      6. Beginnen Sie mit der Produktion des konditionierten Mediums, wenn die Zellen etwa 50 % der Konfluenz erreichen: Ersetzen Sie das Medium durch 40 ml Basalkulturmedium, das mit 5 % FCS ohne Phleomycin D1 ergänzt wird.
      7. Sammeln Sie den ersten Überstand nach 3 Tagen. Um den Schmutz zu entfernen, zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 1.200 × g. Bewahren Sie den Überstand in einem sterilen Behälter bei 4 °C auf.
      8. Fügen Sie den Zellen neues Basalkulturmedium hinzu, das mit 5 % FCS ergänzt ist. Sammeln Sie den zweiten Überstand nach 3-4 Tagen. 10 min bei 1.200 × g zentrifugieren. Den zweiten Überstand zum ersten Überstand hinzufügen.
      9. Das konditionierte Medium mit einem 0,2 μm Flaschenfilter abseihen.
      10. Zur Qualitätskontrolle und RSPO1-Quantifizierung wird das produzierte Medium zu einer 293T-Zelllinie (293T WntR, 7xTcf-eGFP)14 gegeben, die stabil mit GFP-Plasmid-tragendem Wnt-Reporter18 transduziert wird.
        HINWEIS: Abhängig von der Menge und Intensität des GFP-Signals wird die Aktivität von RSPO1 als Agonist des Wnt-Signalwegs durch die Quantifizierung der Wnt-Reporterzelllinie getestet.
      11. Bewahren Sie Aliquots von 15 ml zur sofortigen Verwendung (innerhalb von 1 Woche) bei 4 °C auf. Für eine längere Lagerung (6 Monate) halten Sie das konditionierte Medium bei -20 °C.

2. Initiierung einer Eierstockkrebs-Organoidkultur

  1. Primäre Gewebeisolierung
    1. Transportieren Sie frisches und lebensfähiges Gewebe vorzugsweise unmittelbar nach der Operation und führen Sie die Isolierung innerhalb von maximal 20 Stunden nach der Entnahme durch. Sorgen Sie für einen ordnungsgemäßen Transportzustand im Gewebesammelmedium mit einer Transportbox, die mit Kühlakkus bei ca. 4 °C ausgestattet ist.
    2. Bereiten Sie im Labor die erforderlichen Reagenzien und Geräte vor, um eine rechtzeitige Probenverarbeitung zu ermöglichen:
      1. Auftauen von Basalmembranextrakt Typ II Matrix (BME 2 Matrix) auf Eis (ca. 2 h).
      2. Bereiten Sie Einwegskalpelle, sterilisierte Sezierwerkzeuge (Schere und Pinzette) und 400 μm große Filtereinsätze für 50-ml-Röhrchen vor.
      3. Bereiten Sie einen Behälter mit einer kleinen Menge flüssigem Stickstoff zum Schockfrosten und ein vorgewärmtes Wasserbad bei 37 °C vor.
        HINWEIS: Arbeiten Sie in einer Zellkultur-Laminar-Flow-Haube.
    3. Waschen Sie das frische Gewebe in einer Petrischale gründlich in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (ohne Ca++ und Mg++). Fragmentieren Sie das Gewebe in der Petrischale mit den Einwegskalpellen und/oder der Schere in kleine, 3-5 mm große Stücke.
    4. Trennen Sie das erhaltene Gewebe zu folgenden Zwecken in drei Abschnitte:
      1. Sammeln Sie Gewebe in Kryoröhrchen. Füllen Sie die Kryoröhrchen zum Schockfrosten in den vorbereiteten Behälter, der mit flüssigem Stickstoff gefüllt ist.
      2. Sammeln Sie Gewebe (2-3 mm) in einem mit Formalin gefüllten histologischen Probenbehälter zur Fixierung (24 h) und betten Sie es zu Färbezwecken in Paraffin ein19,20.
      3. Homogenisieren Sie außerdem das Gewebe vor der enzymatischen Verdauung. Maximieren Sie die mechanische Dissoziation mit einem Skalpell und übertragen Sie es in ein 50-ml-Geweberöhrchen.
        HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Gewebe während der Homogenisierung immer in PBS getränkt ist, um ein Austrocknen des Gewebes zu vermeiden.
    5. Kombinieren Sie das homogenisierte Gewebe mit einem Aufschlussgemisch, das PBS (ohne Ca++ und Mg++), Kollagenase I (Stammlösung 5 U/μl, Endkonzentration 1 U/μl) und einen selektiven ROCK1- und ROCK2-Inhibitor (3 μM Endkonzentration) enthält (in Tabelle 1 aufgeführte Komponenten). Verwenden Sie 15 ml Verdauungsmischung in einem 50-ml-Röhrchen für jeweils 2 cm3 des Tumors.
      HINWEIS: Begrenztes Material (z. B. Biopsieproben) erfordert nur geringe Mengen (ca. 2-3 ml) der Aufschlussmischung, um die enzymatische Dissoziation zu gewährleisten.
    6. Für die enzymatische Dissoziation wird das Röhrchen 1,5 h lang in einem Wasserbad bei 37 °C inkubiert. Führen Sie sporadisches und kräftiges Wirbeln durch (ca. alle 20 Minuten für 10-15 s), um die mechanische Dissoziation zu unterstützen.
    7. Nach der Inkubation 15 ml kaltes Basalkulturmedium++ in das Röhrchen geben. 5 min bei 300 × g zentrifugieren.
    8. Nach dem Entfernen des Überstands 5 ml neues Basalkulturmedium++ hinzufügen. Die Zellsuspension mit einem 400-μm-Filter in ein frisches 50-ml-Röhrchen abseihen.
    9. 5 min bei 300 × g zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und bewahren Sie das Zellpellet auf.
    10. Um Erythrozyten zu entfernen, fügen Sie dem Zellpellet 5 ml Red Blood Cell Lysing (RBC)-Puffer hinzu. 5 min im Wasserbad bei 37 °C inkubieren.
    11. Fügen Sie 5 ml Basalkulturmedium++ zur Lyseinaktivierung hinzu. 5 min bei 300 × g zentrifugieren. Fügen Sie dem Zellpellet 3 ml Basalkulturmedium++ hinzu.
    12. Zählen Sie lebensfähige Zellen nach 1:1-Verdünnung mit Trypanblau-Färbelösung (z. B. 10 μl der Probe + 10 μl Trypanblau-Färbelösung) in einem automatischen Zellzähler oder manuell in einer Neubauer-Kammer.
    13. Berechnen Sie die Anzahl der Zellen, die für das direkte 3D-Seeding benötigt werden. Für jedes Tumordepot werden mindestens 2-3 Vertiefungen pro Eierstockkrebsmedium in eine Platte im 48-Well-Format ausgesät, was insgesamt 8-12 Vertiefungen in einer Aussaatmatrix (OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß) entspricht. Berechnen Sie 30.000 Zellen für jede Vertiefung in einem Tröpfchen von 25 μl BME-Typ-2-Matrix. Wählen Sie optional ein 24-Well-Format mit 50 μl BME 2-Matrix und 50.000 ausgesäten Zellen pro Well.
    14. Die verbleibenden Zellen werden in 2D gesät (siehe Schritt 2.1.13).
    15. Die Menge der Basalkulturmedium++-Suspension, die die Gesamtzahl der benötigten Zellen enthält, in ein neues Röhrchen pipettieren und 5 Minuten bei 300 × g zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und bewahren Sie das Zellpellet auf.
    16. Geben Sie auf dem Eis die Gesamtmenge der kalten BME 2-Matrix (25 μl für jede Vertiefung in einer Platte im 48-Well-Format; daher 100 μl für 4 Vertiefungen) zum Pellet und mischen Sie sie gut, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen pro Vertiefung zu erreichen, indem Sie das Pellet vorsichtig auf und ab pipettieren, ohne Blasen zu erzeugen.
    17. Die Zellen in Tröpfchen der BME 2-Matrix (25 μl) auf die vorgewärmte, leere 48-Well-Platte aussäen. Um eine gleichmäßige Verteilung zwischen den Wells zu erreichen, bewegen Sie die Pipette vorsichtig und langsam (3-4x) im Röhrchen auf und ab, bevor Sie das BME 2-Matrixtröpfchen in jedes Well übertragen, um eine Zellfällung während der Verteilung zu verhindern.
    18. Nachdem die Platte mindestens 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert wurde, um die Tröpfchen der BME 2-Matrix zu konsolidieren, pipettieren Sie jeweils 250 μl der vier Eierstockkrebsmedien (OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß) in die entsprechenden Wells.
    19. Parallel zum direkten 3D-Seeding-Verfahren konservieren Sie die verbleibenden isolierten Zellen, indem Sie eine 2D-Kultur starten.
      1. Nach 5 min Zentrifugation bei 300 × g das Pellet in das 2D-Medium geben. Wählen Sie das Format (T75-Kolben oder T25-Kolben), abhängig von der Anzahl der Zellen, die nach dem 3D-Seeding verfügbar sind.
      2. Inkubieren Sie den Kolben 3-5 Tage lang bei 37 °C für die Zelladhäsion. Behalten Sie das gleiche Medium für die ersten 72 Stunden.
      3. Wenn die Zellen die Konfluenz erreichen, übertragen Sie die Kultur in die BME 2-Matrix. Expandieren Sie primäre Isolate in 2D-Kulturen nicht durch Aufteilen, da eine langfristige Vermehrung auf 2D dem Stammpotenzial abträglich ist.
  2. Transfer von der 2D-Kultur zur 3D-Kultur
    1. Waschen Sie die Monoschicht im T75- oder T25-Kolben 2x mit 5 ml PBS, um die Zellen von der Unterseite zu lösen. Mit 1 ml Trypsin 10 min bei 37 °C inkubieren.
    2. 5 ml kaltes Basalkulturmedium++ zur Inaktivierung des Dissoziationsreagenzes hinzufügen. 5 min bei 300 × g zentrifugieren.
    3. Geben Sie 3 ml Basalkulturmedium++ in das Pellet. Zählen Sie die Zellen wie in den Schritten 2.1.12-2.1.13 beschrieben. Saatgut für die verschiedenen Medienzusammensetzungen (siehe Abbildung 1), wie in den Schritten 2.1.16-2.1.18 beschrieben.
  3. Bewertung des Organoidwachstums
    1. Bilden Sie die Vertiefungen mindestens einmal pro Woche ab, um das Organoidwachstum zu dokumentieren. Erstellen Sie qualitativ hochwertige, vergleichbare Bilder von 2D/3D-Kulturen und Direktsaatplatten mit dem Phasenkontrastmikroskop. Achten Sie auf Konsistenz in der Vergrößerung und verwenden Sie 4x für einen Überblick über die Wells (Quantifizierung) und 10x und 20x zur Dokumentation der Morphologie von Organoiden.
    2. Organisieren Sie die Speicherung von Bildern in Ordnern, die einzelnen Zeilen zugeordnet sind.
    3. Wählen Sie die beste Organoidlinie für die Langzeitkultivierung aus, indem Sie die Organoidbildung bei den verschiedenen Aussaatmodalitäten (2D, gefolgt von 3D-Aussaat versus direkte 3D-Aussaat) und verschiedenen Medienzusammensetzungen (OCM1, OCM1+ HER1ß, OCM2 und OCM2+ HER1ß) vergleichen.
      1. Bewerten Sie im Durchschnitt 14-21 Tage nach der Isolierung das Organoid-bildende Potenzial (Menge) sowie die Größe und den zellulären Phänotyp von Organoiden, die unter verschiedenen Bedingungen gezüchtet wurden. Achten Sie auf die folgenden Merkmale: Fehlen von Vakuolen, Membranblasen oder Adhäsionsverlust und Aufrunden von Zellen.

3. Langfristige Organoid-Kultivierung

  1. Organoide Passage
    1. Vermeiden Sie es, Organoide zu häufig und während der proliferativen Phase zu spalten. Führen Sie mechanische und enzymatische Aufschlussverfahren im Abstand von mehr als 10 Tagen durch.
    2. Um jedes BME 2-Matrixtröpfchen aufzubrechen, fügen Sie 250 μl (48-Well-Format) oder 500 μl (24-Well-Format) eiskaltes Basalkulturmedium++ hinzu. Stellen Sie sicher, dass sich der Tropfen vollständig auflöst und pipettieren Sie intermittierend auf und ab und kratzen Sie den Boden der Platte ab. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-ml-Röhrchen und legen Sie es auf Eis. Fügen Sie 1 ml eiskaltes Basalkulturmedium++ hinzu.
      HINWEIS: Die Abscheideleistung der BME 2-Matrix hängt stark von der Mediumstemperatur ab, da die beste Auflösung unter 4 °C erreicht wird.
    3. Pool 2-3 technische Replikatbrunnen für eine gleichmäßige Erweiterung. 5 min bei 300 × g zentrifugieren. Überprüfen Sie den Inhalt der Suspension gegen die Lichtquelle, um festzustellen, ob das BME 2-Gel noch sichtbar ist. Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie das Waschen mit einem eiskalten Medium, wenn die BME 2-Matrix noch sichtbar ist.
    4. Inkubieren Sie mit 1 ml Trypsin (gelagert bei 20-25 °C) in einem Wasserbad bei 37 °C für 7-10 Minuten. Wirbeln Sie sporadisch für 10 s, um die Dissoziation zu verbessern. Überprüfen Sie die Sonde regelmäßig visuell, um festzustellen, ob die Dissoziation fortschreitet.
    5. Ziehen Sie die Zellsuspension mit einer Spritze durch eine Nadel mit einer Größe von 23 g bis 27 g auf und ab. Prüfen Sie, ob noch große Zellklumpen vorhanden sind, und wiederholen Sie den Vorgang gegebenenfalls.
      HINWEIS: Die Fragmentierung durch eine Spritze ist optional, und die Nadelgröße hängt von der erforderlichen Dissoziationswirksamkeit ab. Eine homogene Zellsuspension führt zu einer gleichmäßigen Verteilung auf die Wells.
    6. Fügen Sie 1 ml kaltes Basalkulturmedium++ hinzu, um die Reaktion zu inaktivieren.
    7. OPTIONAL: Zählen Sie die Zellen wie in den Schritten 2.1.12-2.1.13 beschrieben und entscheiden Sie das Teilungsverhältnis zum elterlichen Durchgang (z. B. 1:3-Vertiefungen).
    8. 5 min bei 300 × g zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand.
    9. Führen Sie die Aussaat wie in den Schritten 2.1.16-2.1.18 beschrieben durch und wenden Sie das jeweils optimale Eierstockkrebs-Organoidmedium entsprechend der bereits etablierten Langzeitkultur an. Wechseln Sie das Eierstockkrebsmedium alle 3-4 Tage.
    10. Im Falle einer Störung des BME 2-Matrixtröpfchens während des Mediumwechsels sollten Sie eine erneute Aussaat ohne enzymatischen Verdau in Betracht ziehen. Um eine Störung des Tröpfchens zu vermeiden, führen Sie den Medienwechsel vorsichtig durch, ohne direkt auf das BME 2-Matrixtröpfchen zu pipettieren. Vermeiden Sie außerdem, vor der Verdünnung mit der BME 2-Matrix in Schritt 2.1.16 eine übermäßige Menge an restlichem Basalkulturmedium++ auf dem Pellet zu belassen, da dies die Zerbrechlichkeit der Tröpfchen beeinträchtigen könnte.
  2. Kryokonservierung von Organoiden
    HINWEIS: Führen Sie die Kryokonservierung der Organoide während der Proliferationsphase in der ersten Woche nach der Passage durch.
    1. Zerstören Sie das BME 2-Matrixtröpfchen mit eiskaltem Basalkulturmedium++ gemäß Schritt 3.1.2. Nach der Zentrifugation und dem Verwerfen des Überstands wie in Schritt 3.1.3 beschrieben wird auf Eis gearbeitet und das Zellpellet in 1 ml eiskaltem Kryokonservierungsmedium resuspendiert. Übertragen Sie die Zellsuspension in vormarkierte 1,8-ml-Kryoröhrchen.
    2. Lagern Sie die Röhrchen in einem vorgekühlten, isopropylalkoholhaltigen Gefrierbehälter und stellen Sie sie über Nacht auf -80 °C.
    3. Bewahren Sie die Standardröhrchen maximal 2 Monate bei -80 °C auf. Überführung in flüssigen Stickstoff zur langzeitstabilen Lagerung.
  3. Auftauen von Organoidbeständen
    1. 9 ml Basalkulturmedium++ in einem 37 °C warmen Wasserbad in einem beschrifteten 15 ml-Röhrchen vorwärmen.
    2. Füllen Sie das gewünschte Vorratsfläschchen bei -80 °C aus dem Lager oder in flüssigen Stickstoff in einen mit flüssigem Stickstoff gefüllten Transportbehälter um.
    3. Das Kryoröhrchen wird in ein Wasserbad bei 37 °C überführt und vorsichtig geschüttelt, bis das gefrorene Material in der Nähe der Röhrchenwände aufzutauen beginnt.
    4. Verteilen Sie die Organoidsuspension langsam in dem mit 9 ml Medium gefüllten beschrifteten Röhrchen. Schütteln Sie die Tube vorsichtig. 5 min bei 300 × g zentrifugieren und den Überstand entfernen.
    5. Führen Sie die Aussaat wie in den Schritten 2.1.16-2.1.18 beschrieben durch und tragen Sie das jeweils optimale Ovarialkarzinom-Organoidmedium gemäß den bereits ermittelten Langzeitkulturbedingungen für die einzelne Linie auf.
  4. Fixierung von Organoiden
    1. Führen Sie die Organoidsammlung wie in den Schritten 3.1.2 bis 3.1.3 beschrieben durch.
    2. 3 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS (pH 7,4) geben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
    3. 2x mit 5 ml PBS waschen, 3 min bei 300 × g zentrifugieren und den Überstand entfernen. Fügen Sie dem Pellet 4 ml frisches PBS hinzu und halten Sie es bis zum Einbetten bei 4 °C.
      HINWEIS: Fixierte Organoide sind stabil und eine Lagerung bei 4 °C ist vor dem Einbetten 1 Monat lang möglich.
    4. Das histologische Gel (gelagert bei -20 °C) wird auf 65 °C erhitzt, bis es verflüssigt ist.
    5. Erkennen Sie die festen Organoide, die sich am Boden des Röhrchens abgesetzt haben und sichtbar sind. Entfernen Sie den Überstand. Im Falle eines zerbrochenen Zellpellets 3 Minuten lang bei 300 × g zentrifugieren und den Überstand PBS verwerfen.
    6. Suspendieren Sie das Pellet in 100 μl warmem Gel, indem Sie es vorsichtig auf und ab pipettieren. Übertragen Sie das Tröpfchen auf ein Stück Siegelfolie und lassen Sie es nach ~15 min bei Raumtemperatur erstarren.
    7. Bewegen Sie das fixierte Geltröpfchen in die Gewebeparaffinkassette. Führen Sie Standardprotokolle zur Gewebeeinbettungdurch 19,20.
    8. Schneiden Sie 5-10 μm dicke Scheiben mit einem Mikroschnitt-Schneidwerkzeug. Übertragen Sie die Schnitte auf Histologie-Objektträger. Trocknen Sie die Objektträger 1 h bei 65 °C; Bewahren Sie sie an einem trockenen Ort auf.
  5. Immunfluoreszenzfärbung von Organoidschnitten
    1. Bewegen Sie die vorbereiteten Objektträger durch Glasschalen mit den folgenden Verdünnungsreihen: 2 x 15 min Clearingmittel für die Histologie; 15 min 100% Ethanol; 1 min 100% Ethanol; 10 min 96% Ethanol; 5 min 70% Ethanol; 5 min 50% Ethanol.
    2. Fügen Sie PBS hinzu und lassen Sie den Shaker 5 min bei 100 U/min. Wiederholen Sie das Waschen 2x.
    3. Geben Sie Antigen-Rückgewinnungslösung (Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Puffer [pH 9,0] oder Citrat [pH 6,0]) zu den Objektträgern, die in die thermostabile Kammer gegeben werden. In einem Dampfgarer den Behälter mit den Objektträgern 30 Minuten aufbewahren und anschließend auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
    4. Wiederholen Sie Schritt 3.5.2.
    5. Die Kammer mit den Objektträgern für 15 min in 1%ige Permeabilisierungs-Detergenzlösung (in PBS) überführen.
    6. Wiederholen Sie Schritt 3.5.2.
    7. Konturieren Sie die Position der Organoide auf den Objektträgern mit einem immunfärbenden Wachsstift, um das Tröpfchen während der folgenden Schritte zu erhalten.
    8. Geben Sie auf jeden Objektträger 100 μl 10% Serum in einem Verdünnungsmedium, abhängig von der Spezies des Sekundärantikörpers.
    9. Wiederholen Sie Schritt 3.5.2.
    10. Die Primärantikörper werden in einem Medium verdünnt, was zu einem Endvolumen von 100 μl führt. Bei 4 °C mindestens 16 h in einer Inkubationsschale/Feuchtigkeitskammer aufbewahren.
    11. Wiederholen Sie Schritt 3.5.2.
    12. Verdünnen Sie die Sekundärantikörper in einem Medium, was zu 100 μl Tröpfchen führt, und bewahren Sie sie 2 h bei Raumtemperatur in einer Inkubationsschale auf.
    13. Wiederholen Sie Schritt 3.5.2.
    14. Nukleare Gegenfärbelösung DAPI (4',6-Diamidin-2-phenylindol, Dihydrochlorid) in einem Verdünnungsmedium 1:1.000 verdünnt. Zur Inkubation 10 Minuten bei Raumtemperatur aufbewahren.
    15. Wiederholen Sie Schritt 3.5.2.
    16. Fügen Sie Montagemedium hinzu und decken Sie es mit dem Deckglas ab. Befestigen Sie die Objektträger nach dem Trocknen (ca. nach 8-12 h) mit transparentem Nagellack.
    17. Aufnahme mit einem Konfokalmikroskop oder einem anderen Fluoreszenzmikroskop. Erstellen Sie Übersichtsbilder sowie detaillierte Bilder von subzellulären Strukturen, die die Hauptmerkmale der Organoidmorphologie erfassen.

Ergebnisse

Nach anfänglicher Gewebedissoziation, Filtration und Zählung werden die Zellen parallel direkt im 3D-Format ausgesät, wie oben erläutert, sowie die Suspension im Kolben für eine kurze 2D-Expansion. In einigen Fällen beeinflusst die vorübergehende 2D-Expansion die Organoidbildung positiv, und die Langzeitlinie wird auf diesem Weg erfolgreich etabliert, während eine vergleichende parallele 3D-Aussaat zu einem Wachstumsstillstand führen kann (Abbildung 1). Für jedes Spendergewebe, das...

Diskussion

Das entworfene Protokoll adressiert frühere Herausforderungen des Biobankings von Ovarialkarzinom-Organoiden in Bezug auf die Organoidbildung und das langfristige Passagepotenzial und stellt die Generierung vollständig expandierbarer Linien aus der Mehrheit der soliden Tumorablagerungen sicher. Der chirurgische Entnahmeprozess von Tumorproben, die für die Organoiderzeugung verwendet werden sollen, wirkt sich erheblich auf die Ausbeute und das Expansionspotenzial aus. Tumorgewebeproben können während verschiedener Ve...

Offenlegungen

M.K. ist als Erfinder in einem Patent aufgeführt, das sich auf ein Medium für Eierstockkrebs-Organoide bezieht. F.T. erhielt Forschungsgelder, Beirat, Honorare und Reisekosten von AstraZeneca, Clovis, Eisai, ImmunoGen, Medac, MSD, PharmaMar, Roche, SAGA Diagnostics und Tesaro/GSK. S.M. erhielt Forschungsgelder, Beirat, Ehren- oder Reisekosten: AbbVie, AstraZeneca, Clovis, Eisai, GlaxoSmithKline, Hubro, Medac, MSD, Novartis, Nykode, Olympus, PharmaMar, Pfizer, Roche, Sensor Kinesis, Teva, Tesaro.

Danksagungen

Gefördert wird die Studie vom Deutschen Krebsforschungszentrum DKTK, Partnerstandort München, einer Partnerschaft zwischen dem DKFZ und dem Universitätsklinikum LMU München. Die Studie wird auch durch die Deutsche Krebshilfe (#70113426 und #70113433) unterstützt. Die Paraffineinbettung von Gewebe und Organoiden wurde an der Core Facility des Instituts für Anatomie der Medizinischen Fakultät der LMU München, München, durchgeführt. Die konfokale Bildgebung wurde in der Core Facility Bioimaging am Biomedical Center (BMC) durchgeführt. Die Autoren danken Simone Hofmann, Maria Fischer, Cornelia Herbst, Sabine Fink und Martina Rahmeh für die technische Hilfe.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
100 Sterican 26 GBraun, Melsungen, Germany4657683
100 Sterican 27 GBraun, Melsungen, Germany4657705
293T HA Rspo1-FcR&D systems, Minneapolis, USA3710-001-01Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111
A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV)Merck, Darmstadt, Germany616454
Advanced DMEM/F-12 Medium Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA12634028
Anti-p53 antibody (DO1)Santa Cruz Biotechnology, Texas, USAsc-126
Anti-PAX8 antibodyProteintech, Manchester, UK 10336-1-AP
B-27 Supplement (50x)Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA17504-044
Bottle-top vacuum filter 0.2 µmCorning, Berlin, Germany 430049
CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria661175
CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria690160
CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria658175
Collagenase IThermo Scientific, Waltham, USA17018029
Costar 48-well Clear TC-treated Corning, Berlin, Germany 3548
Cryo SFMPromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, GermanyC-29912
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, PathclearR&D systems, Minneapolis, USA3533-005-02Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix  Corning, 356231 
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgGJackson Immuno715-175-151
DAKO  Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen RetrieverSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyC9999-1000ML
DAPIThermo Scientific, Waltham, USA62248
Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555Thermo Scientific, Waltham, USAA32794
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Scientific, Waltham, USAA32814
Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA14190-094
Epredia Richard-Allan Scientific HistoGelThermo Scientific, Waltham, USAEpredia HG-4000-012
Falcon 24-well Polystyrene Corning, Berlin, Germany 351447
Feather scalpel Pfm medical, Cologne, Germany200130010
Fetal Bovine SerumGibco, Thermo Scientific, Waltham, USA10270106
Formalin 37% acid free, stabilizedMorphisto, Offenbach am Main, Germany1019205000
GlutaMAXGibco, Thermo Scientific, Waltham, USA35050038
HEPES (1 M)Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA156630080
Human EpCAM/TROP-1 AntibodyR&D systems, Minneapolis, USAAF960
Human FGF10Peprotech, NJ, USA100-26
Human recombinant BMP2Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USAPHC7146
Human recombinant EGFGibco, Thermo Scientific, Waltham, USAPHG0311L
Human recombinant Heregulin beta-1Peprotech, NJ, USA100-03
LAS X core SoftwareLeica Microsystemshttps://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/
Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal MicroscopeLeica Microsystems
N-2 Supplement (100x)Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA17502-048
NicotinamideSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyN0636
Omnifix 1 mLBraun, Melsungen, Germany3570519
Paraffin
ParafilmOmnilab, Munich, Germany5170002
Paraformaldehyd Morphisto, Offenbach am Main, Germany1176201000
Pen StrepGibco, Thermo Scientific, Waltham, USA15140-122
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyP4333-100
PluriStrainer 400 µmPluriSelect, Leipzig, Germany43-50400-01
PrimocinInvivoGen, Toulouse, Franceant-pm-05
Red Blood Cell Lysing BufferSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany11814389001
RoticlearCarl Roth, Karlsruhe, GermanyA538.5
Surgipath ParaplastLeica, Wetzlar, Germany39602012
Thermo Scientific Nunc CryovialsThermo Scientific, Waltham, USA375418PK
Triton X-100Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyT8787
Trypan Blue StainSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyT8154
TrypLE Express Enzyme Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA12604-013
Tween-20PanReac AppliChem, Darmstadt, GermanyA4974-0100
Y-27632TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany1254
ZeocinInvitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USAR25001

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