卵巣がんオルガノイドのバイオバンキング戦略:組織学的サブタイプと疾患病期にわたる患者間の不均一性への対処

要約

このプロトコルは、さまざまな病期からの卵巣がんオルガノイドを確立するための体系的なフレームワークを提供し、患者固有の変動性の課題に対処して、収量を増やし、その後のアプリケーションのための堅牢な長期拡張を可能にします。これには、組織処理、播種、培地要件の調整、および免疫蛍光染色の詳細な手順が含まれています。

要約

患者由来のオルガノイドとその臨床的背景情報から卵巣がんバイオバンクを確立することは、研究と患者ケアの進歩を約束しますが、この致死的な悪性腫瘍の不均一性とオルガノイド技術の固有の複雑さが組み合わさったため、標準化は依然として課題です。この適応可能なプロトコルは、前駆細胞の患者固有の変動性を考慮して、卵巣がんオルガノイドの可能性を最大限に引き出すための体系的なフレームワークを提供します。最適な培養条件と播種方法を選択するための構造化された実験ワークフローを実装し、直接3D播種と2D/3Dルートの並列試験を行うことで、ほとんどの場合、幅広いダウンストリームアプリケーションに適した堅牢な長期増殖ラインが得られます。

特に、このプロトコルは、高悪性度および低悪性度の卵巣癌や、一次減量、再発性疾患、および術前補助術後の手術標本を伴う疾患の病期など、非常に不均一な出発物質の多数の症例(N = 120)でテストされ、有効であることが証明されています。低Wnt、高BMPの外因性シグナル伝達環境内では、前駆細胞がヘレグリン1β(HERβ-1)経路の活性化に対して異なる感受性を示し、HERβ-1がオルガノイド形成を促進するものと阻害するものがあることが観察されました。患者のサンプルのサブセットでは、最適なオルガノイド形成と長期増殖のために、線維芽細胞増殖因子10およびR-Spondin 1を培地に添加する必要があります。

さらに、組織消化と前駆細胞の単離の重要なステップを強調し、プラスチック上での2Dでの短時間の培養が、基底膜抽出物2型マトリックスにおけるその後のオルガノイド形成に有益である例を指摘します。全体として、最適なバイオバンキングには、個々のラインの適切な成長環境を特定するために、すべての主要な条件を並行して体系的にテストする必要があります。また、このプロトコルでは、包括的な表現型解析に必要なオルガノイドの高解像度画像を取得するための効率的な包埋、切片化、染色の処理手順についても説明しています。

概要

上皮性卵巣がん患者の臨床管理は、進行期における臨床症状の不均一性および^{再発率の高さ}により、依然として困難である1。卵巣がんの発生と生物学的挙動の理解を深めるには、疾患の経過中の患者固有の変動性、治療反応、病理組織学的および^{分子的特徴}に対処する研究アプローチが必要です2。

バイオバンキングは、卵巣がん患者に由来する腫瘍サンプルとその臨床情報を体系的に収集し、長期保存することを特徴としており、一次減量手術、ネオアジュバント化学療法後、再発性疾患からの腫瘍サンプルなど、さまざまな疾患ステージの大規模な患者コホートの保存を提供します。がん研究を前進させる貴重な可能性を秘めており、有望な予後バイオマーカーや^{治療標的の}リソースとして機能します3。しかし、ホルマリンの固定や凍結などの従来のバイオバンキング法は、生存率の喪失と天然の3次元^{組織構造の}破壊のために、元の腫瘍サンプルの機能研究を行うのに適していません^4,5。

腫瘍学およびそれ以外の分野における分子メカニズムの研究は、疾患の生物学を忠実に反映し、in vivoで観察された組織のin vitro<....

プロトコル

卵巣がん手術からの腫瘍組織標本が収集され、患者由来のオルガノイドは、LMU大学の倫理委員会(17-471)に準拠して作成され、既存の適用されるEU、国内、および地域の規制に準拠しています。研究に関与する各患者は、書面による同意をしています。新鮮な組織サンプルを扱う場合は、バイオセーフティレベル2の安全許可と層流キャビネットが必要です。関連する感染症の定期的な検査がないため、組織サンプルの潜在的に感染性の性質を考慮すると、機関のバイオセーフティ規制が厳守され、実験を実施する担当者が適切な個人用保護具を利用できることを確認する必要があります。

1. 事前準備

1. 培地調製
   1. 2Dおよび3D培地は週に1回新たに調製し、4°Cで保存します。
      注:各培地の成分の正確な組成を 表1に示します。卵巣がん培地1(OCM1)とOCM2の両方にHER1β(最終濃度:50 ng/mL)を追加で補うことができ、OCM1、OCM1+HER1β、OCM2、OCM2+HER1βの4つの異なる状態になります。
   2. 成長因子試薬のストック溶液を作成し、20°Cで保存し、A83-01とニコチンアミド(+4°Cで保存)します。成長因子は温度に敏感であるため、培地調製には解凍した原液を直ちに使用し、アリコートを作成して融解サイクルの繰り返しを避けてください。
      メモ: 培地の準備は、厳密に管理....

結果

最初の組織解離、濾過、およびカウントの後、細胞は、上記で説明したように、3Dフォーマットで直接並行して播種され、フラスコ内の懸濁液で短時間の2D増殖が行われます。場合によっては、一過性の2D増殖がオルガノイド形成にプラスの影響を与え、この経路を介して長期的なラインが正常に確立されますが、比較並行3Dシーディングは成長停止をもたらす可能性があります(

ディスカッション

設計されたプロトコルは、オルガノイド形成と長期継代の可能性に関する卵巣がんオルガノイドバイオバンキングの以前の課題に対処し、固形腫瘍沈着物の大部分から完全に拡張可能なラインの生成を保証します。オルガノイドの生成に使用される腫瘍サンプルの外科的収集プロセスは、収量と増殖の可能性に大きく影響します。腫瘍組織サンプルは、多臓手術、診断的腹腔鏡検査、生検な?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 Sterican 26 G	Braun, Melsungen, Germany	4657683
100 Sterican 27 G	Braun, Melsungen, Germany	4657705
293T HA Rspo1-Fc	R&D systems, Minneapolis, USA	3710-001-01	Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111
A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV)	Merck, Darmstadt, Germany	616454
Advanced DMEM/F-12 Medium	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	12634028
Anti-p53 antibody (DO1)	Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA	sc-126
Anti-PAX8 antibody	Proteintech, Manchester, UK	10336-1-AP
B-27 Supplement (50x)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	17504-044
Bottle-top vacuum filter 0.2 µm	Corning, Berlin, Germany	430049
CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2	Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria	661175
CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2	Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria	690160
CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2	Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria	658175
Collagenase I	Thermo Scientific, Waltham, USA	17018029
Costar 48-well Clear TC-treated	Corning, Berlin, Germany	3548
Cryo SFM	PromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, Germany	C-29912
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear	R&D systems, Minneapolis, USA	3533-005-02	Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix  Corning, 356231
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG	Jackson Immuno	715-175-151
DAKO  Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	C9999-1000ML
DAPI	Thermo Scientific, Waltham, USA	62248
Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555	Thermo Scientific, Waltham, USA	A32794
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488	Thermo Scientific, Waltham, USA	A32814
Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	14190-094
Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel	Thermo Scientific, Waltham, USA	Epredia HG-4000-012
Falcon 24-well Polystyrene	Corning, Berlin, Germany	351447
Feather scalpel	Pfm medical, Cologne, Germany	200130010
Fetal Bovine Serum	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	10270106
Formalin 37% acid free, stabilized	Morphisto, Offenbach am Main, Germany	1019205000
GlutaMAX	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	35050038
HEPES (1 M)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	156630080
Human EpCAM/TROP-1 Antibody	R&D systems, Minneapolis, USA	AF960
Human FGF10	Peprotech, NJ, USA	100-26
Human recombinant BMP2	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	PHC7146
Human recombinant EGF	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	PHG0311L
Human recombinant Heregulin beta-1	Peprotech, NJ, USA	100-03
LAS X core Software	Leica Microsystems		https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/
Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal Microscope	Leica Microsystems
N-2 Supplement (100x)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	17502-048
Nicotinamide	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	N0636
Omnifix 1 mL	Braun, Melsungen, Germany	3570519
Paraffin
Parafilm	Omnilab, Munich, Germany	5170002
Paraformaldehyd	Morphisto, Offenbach am Main, Germany	1176201000
Pen Strep	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	15140-122
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	P4333-100
PluriStrainer 400 µm	PluriSelect, Leipzig, Germany	43-50400-01
Primocin	InvivoGen, Toulouse, France	ant-pm-05
Red Blood Cell Lysing Buffer	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	11814389001
Roticlear	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	A538.5
Surgipath Paraplast	Leica, Wetzlar, Germany	39602012
Thermo Scientific Nunc Cryovials	Thermo Scientific, Waltham, USA	375418PK
Triton X-100	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	T8787
Trypan Blue Stain	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	T8154
TrypLE Express Enzyme	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	12604-013
Tween-20	PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany	A4974-0100
Y-27632	TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany	1254
Zeocin	Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA	R25001