卵巣がんオルガノイドのバイオバンキング戦略:組織学的サブタイプと疾患病期にわたる患者間の不均一性への対処

要約

このプロトコルは、さまざまな病期からの卵巣がんオルガノイドを確立するための体系的なフレームワークを提供し、患者固有の変動性の課題に対処して、収量を増やし、その後のアプリケーションのための堅牢な長期拡張を可能にします。これには、組織処理、播種、培地要件の調整、および免疫蛍光染色の詳細な手順が含まれています。

要約

患者由来のオルガノイドとその臨床的背景情報から卵巣がんバイオバンクを確立することは、研究と患者ケアの進歩を約束しますが、この致死的な悪性腫瘍の不均一性とオルガノイド技術の固有の複雑さが組み合わさったため、標準化は依然として課題です。この適応可能なプロトコルは、前駆細胞の患者固有の変動性を考慮して、卵巣がんオルガノイドの可能性を最大限に引き出すための体系的なフレームワークを提供します。最適な培養条件と播種方法を選択するための構造化された実験ワークフローを実装し、直接3D播種と2D/3Dルートの並列試験を行うことで、ほとんどの場合、幅広いダウンストリームアプリケーションに適した堅牢な長期増殖ラインが得られます。

特に、このプロトコルは、高悪性度および低悪性度の卵巣癌や、一次減量、再発性疾患、および術前補助術後の手術標本を伴う疾患の病期など、非常に不均一な出発物質の多数の症例(N = 120)でテストされ、有効であることが証明されています。低Wnt、高BMPの外因性シグナル伝達環境内では、前駆細胞がヘレグリン1β(HERβ-1)経路の活性化に対して異なる感受性を示し、HERβ-1がオルガノイド形成を促進するものと阻害するものがあることが観察されました。患者のサンプルのサブセットでは、最適なオルガノイド形成と長期増殖のために、線維芽細胞増殖因子10およびR-Spondin 1を培地に添加する必要があります。

さらに、組織消化と前駆細胞の単離の重要なステップを強調し、プラスチック上での2Dでの短時間の培養が、基底膜抽出物2型マトリックスにおけるその後のオルガノイド形成に有益である例を指摘します。全体として、最適なバイオバンキングには、個々のラインの適切な成長環境を特定するために、すべての主要な条件を並行して体系的にテストする必要があります。また、このプロトコルでは、包括的な表現型解析に必要なオルガノイドの高解像度画像を取得するための効率的な包埋、切片化、染色の処理手順についても説明しています。

概要

上皮性卵巣がん患者の臨床管理は、進行期における臨床症状の不均一性および^{再発率の高さ}により、依然として困難である1。卵巣がんの発生と生物学的挙動の理解を深めるには、疾患の経過中の患者固有の変動性、治療反応、病理組織学的および^{分子的特徴}に対処する研究アプローチが必要です2。

バイオバンキングは、卵巣がん患者に由来する腫瘍サンプルとその臨床情報を体系的に収集し、長期保存することを特徴としており、一次減量手術、ネオアジュバント化学療法後、再発性疾患からの腫瘍サンプルなど、さまざまな疾患ステージの大規模な患者コホートの保存を提供します。がん研究を前進させる貴重な可能性を秘めており、有望な予後バイオマーカーや^{治療標的の}リソースとして機能します3。しかし、ホルマリンの固定や凍結などの従来のバイオバンキング法は、生存率の喪失と天然の3次元^{組織構造の}破壊のために、元の腫瘍サンプルの機能研究を行うのに適していません^4,5。

腫瘍学およびそれ以外の分野における分子メカニズムの研究は、疾患の生物学を忠実に反映し、in vivoで観察された組織のin vitro特性を維持する適切な実験モデルの使用に決定的に依存しています。患者由来のオルガノイドは、再生能の保存に基づいて、上皮の元の構造と機能を実験室で再現し、患者固有の状況での検査を可能にします。したがって、それらは癌研究と個別化医療のための非常に有望なツールとして浮上しており、臨床的多様性と実験室研究の間のギャップを埋めています6,7,8,9。オルガノイド株の個々の薬物反応と分子プロファイルの機能的関連性の試験に基づいて調整された治療戦略は、患者ケアに直接適用できる可能性があります^10,11。患者固有の特性を含む長期的な培養の可能性と、関連する前向き臨床データの収集は、疾患の進行と耐性メカニズムに関与する新しい予後および予測因子を特定する上で大きな期待を寄せています^3,9。

それにもかかわらず、異なる腫瘍サンプルからのオルガノイドを含むバイオバンクを構築するには、複雑な方法論の厳守と、メンテナンスを容易にするためのプロトコルの設定を組み合わせる必要があります¹²。プロセスの標準化により、高い離職率でも訓練を受けたスタッフがバイオバンクを効率的に確立および維持できると同時に、最高の品質基準を順守することができます¹³。いくつかの研究で、元の腫瘍の突然変異および表現型プロファイルに対応する安定した卵巣がんオルガノイド株の作製に成功したことが報告されているが、効率はさまざまである。しかし、日常的なバイオバンキングは、特に大規模な拡大やゲノム編集の成功の前提条件であるラインの長期安定的な成長のためには、実際には依然として課題となっています。

特に、拡張性の問題は、成長が遅く、限られた成長の可能性を示すオルガノイドが確立された系統としてカウントされることがあるため、この分野では曖昧なままです。Hoffmannらによって最初に実証されたように、その主要な発見がこのさらに開発されたプロトコルの基礎を提供した研究、卵巣癌組織の最適な取り扱いには、不均一性に対応するための独自の戦略が必要です¹⁴。この方法によって得られたオルガノイドの表現型特性評価および親腫瘍組織との密接な類似性は、成熟培養物(4〜10か月の培養)のパネルDNAシーケンシングおよびトランスクリプトミクス分析によって確認され、モデルの安定性が実証されました^8,9,12,14。

健康な卵管の恒常性を調節するパラクリン環境とは対照的に、高悪性度漿液性卵巣がん(HGSOC)、がん再生能、およびオルガノイド形成能力をもたらす可能性が高い上皮層は、外因性Wnt補給への依存度が低い。さらに、オルガノイド培地にノギンが存在しないことを特徴とする活性骨形態形成タンパク質(BMP)シグナル伝達は、卵巣癌の固形組織沈着物からの長期培養の確立に有益であることが証明されました^14,15。卵巣がんの固形沈着物の体系的なバイオバンキング中に、私たちはこれらの発見を確認し、パイプラインを設定し、このプロトコルで詳細を概説することで、大部分の症例で持続的な長期拡大を保証します。一次単離株を扱う場合、異なる培地組成と播種モダリティの並行試験は、長期安定オルガノイド株の確立を改善し、収率を高め、下流の実験に必要なマルチウェルフォーマットへの堅牢な増殖と増殖を可能にするために不可欠であることがわかりました¹⁶。

さらに、手術中に採取されたサンプルの純度と品質は、基礎研究や分子診断における卵巣がんオルガノイドのトランスレーショナルポテンシャルにとって非常に重要です。HGSOCの臨床症状は複雑であるため、外科医、腫瘍医、およびラボの科学者が緊密に協力して、関連する材料を正しく識別し、輸送条件を一定に保ち、各患者の疾患の最も重要な特徴を表すオルガノイド株を高効率で生成する必要があります。このプロトコルは、卵巣がんを特徴づける不均一性を考慮して、卵巣がんオルガノイドの可能性を最大限に引き出すための標準化された適応可能なフレームワークを提供します^16,17。特に、このプロトコルは、さまざまな組織型(高悪性度および低悪性度卵巣がん、LGSOC)、幹細胞性調節に違いを示す同じ患者からの異なる沈着物、ネオアジュバント後の手術からの組織、生検材料、および疾患進行の再発期の手術からのサンプルを含む、幅広い卵巣がんの臨床症状の信頼性の高いバイオバンキングを可能にします。

プロトコル

卵巣がん手術からの腫瘍組織標本が収集され、患者由来のオルガノイドは、LMU大学の倫理委員会(17-471)に準拠して作成され、既存の適用されるEU、国内、および地域の規制に準拠しています。研究に関与する各患者は、書面による同意をしています。新鮮な組織サンプルを扱う場合は、バイオセーフティレベル2の安全許可と層流キャビネットが必要です。関連する感染症の定期的な検査がないため、組織サンプルの潜在的に感染性の性質を考慮すると、機関のバイオセーフティ規制が厳守され、実験を実施する担当者が適切な個人用保護具を利用できることを確認する必要があります。

1. 事前準備

1. 培地調製
   1. 2Dおよび3D培地は週に1回新たに調製し、4°Cで保存します。
      注:各培地の成分の正確な組成を 表1に示します。卵巣がん培地1(OCM1)とOCM2の両方にHER1β(最終濃度:50 ng/mL)を追加で補うことができ、OCM1、OCM1+HER1β、OCM2、OCM2+HER1βの4つの異なる状態になります。
   2. 成長因子試薬のストック溶液を作成し、20°Cで保存し、A83-01とニコチンアミド(+4°Cで保存)します。成長因子は温度に敏感であるため、培地調製には解凍した原液を直ちに使用し、アリコートを作成して融解サイクルの繰り返しを避けてください。
      メモ: 培地の準備は、厳密に管理する必要がある重要なステップです。
   3. RSPO-1馴化培地の調製
      1. HA-R-Spondin1-Fc 293 T細胞(-80°Cで保存)を37°Cで迅速に解凍します。 10 mLの基礎培養培地に10%ウシ胎児血清(FCS)(以下、基礎培養培地++と呼ぶ)を添加して洗浄します。
      2. 細胞ペレットを12 mLの基礎培地++に再懸濁し、T75フラスコに播種します。
      3. 細胞が合流に達したら、トリプシンを含む解離試薬で細胞を1:6の比率で分割します(37°Cで4分間)。それらを新しいT75フラスコに播種します。
      4. 翌日、フレオマイシンD1(1.25μL/mL)を培地に加えます。
      5. 細胞がコンフルエントに達したら、トリプシンで1:20の比率で細胞を分割します(37°Cで4分間)。フレオマイシンD1を添加した30 mLの基礎培養培地++(10%FCSを含む)に細胞を複数のT75フラスコ(目的の最終容量に応じたフラスコの数)に播種します。
      6. 細胞がコンフルエンスの約50%に達したら、コンディショニング培地の生産を開始します:培地を、フレオマイシンD1を含まない5%FCSを添加した40 mLの基礎培地と交換します。
      7. 3日後に最初の上清を採取します。破片を除去するには、1,200 × gで10分間遠心分離します。上清を4°Cの滅菌容器に保管してください。
      8. 5%FCSを添加した新しい基礎培養培地を細胞に添加します。3〜4日後に2番目の上清を回収します。1,200 × gで10分間遠心分離します。最初の上澄みに2番目の上清を追加します。
      9. 0.2 μmのボトルトップフィルターを使用して、馴化培地を濾します。
      10. 品質管理およびRSPO1定量のために、作製した培地を293T細胞株(293T WntR、7xTcf-eGFP)¹⁴に添加し、GFPプラスミド担持Wnt^{レポーター18}で安定的に形質導入します。
          注:GFPシグナルの量と強度に応じて、Wnt経路のアゴニストとしてのRSPO1の活性は、Wntレポーター細胞株の定量によってテストされます。
      11. 15 mLのアリコートは、4°Cですぐに(1週間以内に)使用するために保管してください。 長期保存(6ヶ月)の場合は、調整した培地を-20°Cに保管してください。

2. 卵巣癌オルガノイド培養の開始

1. 初代組織の単離
   1. 新鮮で生存可能な組織を手術直後に輸送し、採取後最大20時間以内に単離します。約4°Cのコールドパックを備えた輸送ボックスを使用して、組織採取培地中の適切な輸送条件を確保します。
   2. ラボでは、タイムリーなサンプル処理を促進するために必要な試薬と機器を準備します。
      1. 基底膜抽出物II型マトリックス(BME 2マトリックス)を氷上で融解します(約2時間)。
      2. 使い捨てメス、滅菌した解剖ツール(ハサミとピンセット)、および50 mLチューブ用の400 μmサイズのフィルターインサートを準備します。
      3. 急速凍結用の液体窒素を少量入れた容器を用意し、37°Cに予熱したウォーターバスを用意します。
         注:細胞培養層流フード内で作業します。
   3. ペトリ皿で新鮮な組織をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(Ca⁺⁺ およびMg⁺⁺なし)で完全に洗浄します。シャーレの中で、使い捨てメスやハサミを使用して組織を3〜5mmの小さな小片に断片化します。
   4. 得られた組織を以下の目的で3つのセクションに分離します。
      1. 極低温チューブに組織を採取します。極低温チューブを液体窒素で満たされた準備された容器に移し、衝撃凍結します。
      2. 組織(2〜3 mm)をホルマリンで満たされた組織学的標本容器に集めて固定し(24時間)、染色目的でパラフィンに埋め込みます^19,20。
      3. さらに、酵素消化の前に組織を均質化します。メスで機械的解離を最大化し、50 mLの組織チューブに移します。
         注:組織が乾燥しないように、均質化中は常に組織がPBSに浸されていることを確認してください。
   5. ホモジナイズした組織を、PBS(Ca⁺⁺ およびMg⁺⁺を含まない)、コラゲナーゼI(原液5 U/μL、最終濃度1 U/μL)、および選択的ROCK1および2阻害剤(最終濃度3 μM)( 表1に記載の成分)を含む消化混合物と組み合わせます。腫瘍の^2cm3 ごとに50mLチューブに15mLの消化混合物を使用します。
      注:限られた材料(生検サンプルなど)では、酵素解離を確実にするために少量(約2〜3 mL)の消化混合物のみが必要です。
   6. 酵素解離の場合は、チューブを37°Cのウォーターバス中で1.5時間インキュベートします。 散発的かつ激しいボルテックス(約20分ごとに10〜15秒間)を行い、メカニックの解離をサポートします。
   7. インキュベーション後、15 mLの冷たい基礎培地++をチューブに加えます。300 × gで5分間遠心分離します。
   8. 上清を除去した後、新しい基礎培地++を5 mL添加します。400 μmフィルターを使用して細胞懸濁液を新しい50 mLチューブに濾します。
   9. 300 × gで5分間遠心分離します。上澄み液を取り除き、細胞ペレットを保管します。
   10. 赤血球を除去するには、5 mLの赤血球溶解(RBC)バッファーを細胞ペレットに加えます。ウォーターバス中で37°Cで5分間インキュベートします。
   11. 溶解不活性化のために5 mLの基礎培地++を添加します。300 × gで5分間遠心分離します。細胞ペレットに3 mLの基礎培地++を加えます。
   12. トリパンブルー染色液(例:サンプル10 μL + トリパンブルー染色液10 μL)で1:1に希釈した後、自動セルカウンターまたはノイバウアーチャンバーで手動で生細胞をカウントします。
   13. 直接 3D シード処理に必要なセルの数を計算します。各腫瘍沈着物について、播種マトリックス(OCM1、OCM1 + HER1ß、OCM2、OCM2 + HER1ß)の合計8〜12ウェルに対応する、卵巣癌培地あたり少なくとも2〜3ウェルを48ウェルフォーマットプレートに播種します。25 μL の BME タイプ 2 マトリックスの液滴中の各ウェルについて 30,000 個の細胞を計算します。オプションで、50 μL の BME 2 マトリックスとウェルあたり 50,000 個の播種細胞を含む 24 ウェルフォーマットを選択します。
   14. 残りのセルを2Dでシードします(ステップ2.1.13を参照)。
   15. 必要な細胞の総数を含む基底培養培地++懸濁液の量を新しいチューブにピペットで移し、300 × gで5分間遠心分離します。上澄み液を取り除き、細胞ペレットを保管します。
   16. 氷上で、コールドBME 2マトリックスの総量(48ウェルフォーマットプレートの各ウェルで25 μL、したがって、4ウェルで100 μL)をペレットに加え、気泡を作らずにペレットを静かに上下にピペッティングすることにより、ウェルあたりの細胞の均一な分布が得られるようにウェルを混合します。
   17. BME 2マトリックス(25 μL)の液滴に細胞を播種し、予熱した空の48ウェルプレートに播種します。ウェル間で均等に分配するには、チューブ内でピペットを上下に(3〜4回)ゆっくりと動かしてから、BME 2マトリックス液滴を各ウェルに移し、分配中の細胞沈殿を防ぎます。
   18. プレートを37°Cで少なくとも30分間インキュベートしてBME2マトリックスの液滴を固めた後、4つの卵巣がん培地(OCM1、OCM1+HER1ß、OCM2、OCM2+HER1ß)のそれぞれ250μLを対応するウェルにピペットで移します。
   19. 直接3D播種手順と並行して、2D培養を開始して、残りの単離細胞を保存します。
       1. 300 × gで5分間遠心分離した後、ペレットを2D培地に添加します。3D播種後に使用可能な細胞の数に応じて、フォーマット(T75フラスコまたはT25フラスコ)を選択します。
       2. フラスコを37°Cで3〜5日間インキュベートし、細胞接着を行います。最初の72時間は同じ培地を保ちます。
       3. 細胞が合流に達したら、培養液を BME 2 マトリックスに移します。2D培養で一次分離株を分割して増殖させないでください(2Dでの長期増殖は幹細胞性の可能性に有害であるため)。
2. 2D培養から3D培養への移行
   1. T75 または T25 フラスコで、単層を 5 mL の PBS で 2 回洗浄し、細胞を底面から剥離します。1 mLのトリプシンとともに、37°Cで10分間インキュベートします。
   2. 解離試薬の不活性化のために、5 mLの冷たい基礎培地++を加えます。300 × gで5分間遠心分離します。
   3. 3 mLの基礎培地++をペレットに加えます。手順2.1.12-2.1.13の説明に従ってセルをカウントします。ステップ2.1.16-2.1.18で説明したように、さまざまな培地組成物( 図1を参照)のシード。
3. オルガノイド増殖の評価
   1. 少なくとも週に一度はウェルを画像化して、オルガノイドの成長を記録します。位相差顕微鏡により、2D/3D培養と直接播種プレートの高品質な比較画像を作成します。倍率の一貫性に注意し、ウェルの概要(定量)には 4 倍、オルガノイドの形態の記録には 10 倍と 20 倍を使用します。
   2. 個々の行専用のフォルダに画像のストレージを整理します。
   3. 異なる播種モダリティ(2D播種モダリティ、3D播種、直接3D播種)および異なる培地組成(OCM1、OCM1+ HER1ß、OCM2、OCM2+ HER1ß)でのオルガノイド形成の比較評価により、長期培養に最適なオルガノイド株を選択します。
      1. 平均して、単離後14〜21日で、オルガノイド形成能(量)と、さまざまな条件下で増殖したオルガノイドのサイズと細胞表現型を評価します。液胞がない、膜がブレブまたは接着を失っている、細胞が丸められるなどの特徴を探します。

3. オルガノイドの長期培養

1. オルガノイド継代
   1. オルガノイドの分裂を頻繁に行いすぎたり、増殖期に分裂させたりすることは避けてください。機械的および酵素的消化手順を10日以上の間隔で実施します。
   2. 各 BME 2 マトリックス液滴を破壊するには、250 μL(48 ウェルフォーマット)または 500 μL (24 ウェルフォーマット)の氷冷基礎培地++を添加します。液滴とピペットが断続的に上下に完全に溶解し、プレートの底をこすります。細胞懸濁液を15 mLチューブに移し、氷上に置いてください。氷冷した基礎培地++を1mL加えます。
      注:BME 2マトリックスの除去効率は、4°C以下で最良の溶解が得られるため、媒体温度に大きく依存します。
   3. プール2-3は、均一な拡張のために井戸を技術的に複製します。300 × gで5分間遠心分離します。懸濁液の内容物を光源に照らして検査し、BME 2ゲルがまだ見えるかどうかを確認します。上清を取り除き、BME 2マトリックスがまだ見える場合は、氷冷した培地で洗浄を繰り返します。
   4. 1 mLのトリプシン(20〜25°Cで保存)を37°Cのウォーターバスで7〜10分間インキュベートします。10秒間散発的に渦巻き、解離を促進します。定期的にチューブを目視で検査し、解離が進行していないか確認してください。
   5. 23 Gから27 Gの範囲のサイズの針を通してシリンジで細胞懸濁液を上下に引っ張ります。
      注:シリンジによるフラグメンテーションはオプションであり、針のサイズは必要な解離効果によって異なります。均質な細胞懸濁液は、ウェル間に均等に分布します。
   6. 1 mLの冷たい基礎培地++を添加して反応を不活性化します。
   7. オプション:ステップ2.1.12-2.1.13の説明に従って細胞をカウントし、親継代に対する分割比を決定します(例:1:3ウェル)。
   8. 300 × gで5分間遠心分離します。上澄みを取り除きます。
   9. ステップ2.1.16-2.1.18に記載されているように播種を行い、すでに確立されている長期培養に従って、それぞれに最適な卵巣癌オルガノイド培地を適用します。卵巣がん培地は3〜4日ごとに交換してください。
   10. 培地交換中にBME2マトリックス液滴が破砕された場合は、酵素消化を行わずに再播種することを検討してください。液滴の破壊を避けるため、BME 2マトリックス液滴に直接ピペッティングすることなく、培地交換手順を慎重に行ってください。さらに、ステップ2.1.16でBME2マトリックスで希釈する前に、ペレットに過剰な量の残留基礎培地++を残すことは、液滴の脆弱性に影響を与える可能性があるため、避けてください。
2. オルガノイドの凍結保存
   注:オルガノイドの凍結保存は、継代後1週間の増殖期に行ってください。
   1. ステップ3.1.2に従って、氷冷した基礎培地++でBME 2マトリックス液滴を破壊します。ステップ3.1.3.で説明したように上清を遠心分離して廃棄した後、氷上で作業し、細胞ペレットを氷冷凍結保存培地1 mLに再懸濁します。細胞懸濁液を標識済みの1.8 ml極低温チューブに移します。
   2. チューブは予冷したイソプロピルアルコール含有凍結容器に保管し、-80°Cで一晩置きます。
   3. ストックチューブを-80°Cで最大2ヶ月間保管してください。液体窒素に移し替え、長期安定保存が可能です。
3. オルガノイドストックの融解
   1. 標識付き15 mLチューブ内の37°Cの水浴中で、9 mLの基礎培地++を予温します。
   2. 所望のストックバイアルを-80°Cの保管庫から液体窒素に移すか、液体窒素で満たされた輸送容器に移します。
   3. クライオチューブを37°Cのウォーターバスに移し、チューブの壁近くの凍結物質が解凍し始めるまで静かに攪拌します。
   4. オルガノイド懸濁液を、9 mLの培地で満たされた標識チューブにゆっくりと分配します。チューブを静かに振ってください。300 × g で5分間遠心分離し、上清を除去します。
   5. ステップ2.1.16-2.1.18に記載されているように播種を行い、個々の系統についてすでに決定されている長期培養条件に従って、それぞれに最適な卵巣癌オルガノイド培地を適用します。
4. オルガノイドの固定
   1. 手順3.1.2-3.1.3の説明に従ってオルガノイド収集を実行します。
   2. PBS(pH 7.4)に4%パラホルムアルデヒド(PFA)3 mLを加え、室温で1時間インキュベートします。
   3. 5 mLのPBSで2回洗浄し、300 × gで3分間遠心分離し、上清を除去します。4 mLの新鮮なPBSをペレットに加え、包埋するまで4°Cに保ちます。
      注:固定オルガノイドは安定しており、包埋前に4°Cで1ヶ月間保存できます。
   4. 組織学的ゲル(-20°Cで保存)を65°Cで液化するまで加熱します。
   5. チューブの底部に沈殿して見える固定オルガノイドを検出します。上澄みを取り除きます。細胞ペレットが破砕された場合は、300 × g で3分間遠心分離を行い、上清PBSを廃棄します。
   6. ペレットを100μLの温かいゲルに静かにピペッティングして懸濁します。液滴をシーリングフィルムに移し、室温で~15分後に凝固させます。
   7. 固定したゲル液滴を組織パラフィンカセットに移動します。標準的な組織包埋プロトコルを実施する^19,20.
   8. 5〜10μmの厚さのスライスをマイクロセクショニング切削工具で切断します。切り口を組織学スライドに移します。スライドを65°Cで1時間乾燥させます。乾燥した場所に保管してください。
5. オルガノイド切片の免疫蛍光染色
   1. 準備したスライドを、次の希釈シリーズでガラストレイに通します:組織学用の2 x 15分間の透明化剤。15分100%エタノール;1分間100%エタノール;10分間96%エタノール;5分間70%エタノール;5分間50%エタノール。
   2. PBSを添加し、シェーカー上で100rpmで5分間保持します。洗濯を2回繰り返します。
   3. 抗原賦活化溶液(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)-緩衝液[pH 9.0]またはクエン酸[pH 6.0])を、耐熱性チャンバーに入れたスライドに添加します。蒸し器で、スライドの入った容器を30分間保管した後、室温まで冷まします。
   4. 手順 3.5.2 を繰り返します。
   5. スライドの入ったチャンバーを1%透過性界面活性剤溶液(PBS中)に15分間移します。
   6. 手順 3.5.2 を繰り返します。
   7. スライド上のオルガノイドの位置を免疫染色ワックスペンで輪郭を描き、以下のステップで液滴を維持します。
   8. 二次抗体の種類に応じて、希釈培地に100 μLの10%血清を各スライドに加えます。
   9. 手順 3.5.2 を繰り返します。
   10. 一次抗体を培地で希釈し、最終容量が100 μLになるようにします。 インキュベーショントレイ/湿度チャンバー内で4°Cで少なくとも16時間保持します。
   11. 手順 3.5.2 を繰り返します。
   12. 二次抗体を培地で希釈し、液滴を100 μLとし、インキュベーショントレイで室温で2時間保存します。
   13. 手順 3.5.2 を繰り返します。
   14. 希釈培地で1:1,000に希釈した核対比染色液DAPI(4',6-ジアミジン-2-フェニルリンドール、二塩酸塩)を加えます。インキュベーションのために室温で10分間保管します。
   15. 手順 3.5.2 を繰り返します。
   16. 封入剤を追加し、カバーガラスで覆います。乾いたら(約8〜12時間後)、透明なマニキュアでスライドを固定します。
   17. 共焦点顕微鏡などの蛍光顕微鏡で撮影します。オルガノイド形態の主な特徴を捉えた細胞内構造の概要写真と詳細な画像を作成します。

結果

最初の組織解離、濾過、およびカウントの後、細胞は、上記で説明したように、3Dフォーマットで直接並行して播種され、フラスコ内の懸濁液で短時間の2D増殖が行われます。場合によっては、一過性の2D増殖がオルガノイド形成にプラスの影響を与え、この経路を介して長期的なラインが正常に確立されますが、比較並行3Dシーディングは成長停止をもたらす可能性があります(

ディスカッション

設計されたプロトコルは、オルガノイド形成と長期継代の可能性に関する卵巣がんオルガノイドバイオバンキングの以前の課題に対処し、固形腫瘍沈着物の大部分から完全に拡張可能なラインの生成を保証します。オルガノイドの生成に使用される腫瘍サンプルの外科的収集プロセスは、収量と増殖の可能性に大きく影響します。腫瘍組織サンプルは、多臓手術、診断的腹腔鏡検査、生検な?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 Sterican 26 G	Braun, Melsungen, Germany	4657683
100 Sterican 27 G	Braun, Melsungen, Germany	4657705
293T HA Rspo1-Fc	R&D systems, Minneapolis, USA	3710-001-01	Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111
A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV)	Merck, Darmstadt, Germany	616454
Advanced DMEM/F-12 Medium	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	12634028
Anti-p53 antibody (DO1)	Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA	sc-126
Anti-PAX8 antibody	Proteintech, Manchester, UK	10336-1-AP
B-27 Supplement (50x)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	17504-044
Bottle-top vacuum filter 0.2 µm	Corning, Berlin, Germany	430049
CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2	Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria	661175
CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2	Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria	690160
CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2	Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria	658175
Collagenase I	Thermo Scientific, Waltham, USA	17018029
Costar 48-well Clear TC-treated	Corning, Berlin, Germany	3548
Cryo SFM	PromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, Germany	C-29912
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear	R&D systems, Minneapolis, USA	3533-005-02	Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix  Corning, 356231
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG	Jackson Immuno	715-175-151
DAKO  Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	C9999-1000ML
DAPI	Thermo Scientific, Waltham, USA	62248
Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555	Thermo Scientific, Waltham, USA	A32794
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488	Thermo Scientific, Waltham, USA	A32814
Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	14190-094
Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel	Thermo Scientific, Waltham, USA	Epredia HG-4000-012
Falcon 24-well Polystyrene	Corning, Berlin, Germany	351447
Feather scalpel	Pfm medical, Cologne, Germany	200130010
Fetal Bovine Serum	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	10270106
Formalin 37% acid free, stabilized	Morphisto, Offenbach am Main, Germany	1019205000
GlutaMAX	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	35050038
HEPES (1 M)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	156630080
Human EpCAM/TROP-1 Antibody	R&D systems, Minneapolis, USA	AF960
Human FGF10	Peprotech, NJ, USA	100-26
Human recombinant BMP2	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	PHC7146
Human recombinant EGF	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	PHG0311L
Human recombinant Heregulin beta-1	Peprotech, NJ, USA	100-03
LAS X core Software	Leica Microsystems		https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/
Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal Microscope	Leica Microsystems
N-2 Supplement (100x)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	17502-048
Nicotinamide	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	N0636
Omnifix 1 mL	Braun, Melsungen, Germany	3570519
Paraffin
Parafilm	Omnilab, Munich, Germany	5170002
Paraformaldehyd	Morphisto, Offenbach am Main, Germany	1176201000
Pen Strep	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	15140-122
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	P4333-100
PluriStrainer 400 µm	PluriSelect, Leipzig, Germany	43-50400-01
Primocin	InvivoGen, Toulouse, France	ant-pm-05
Red Blood Cell Lysing Buffer	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	11814389001
Roticlear	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	A538.5
Surgipath Paraplast	Leica, Wetzlar, Germany	39602012
Thermo Scientific Nunc Cryovials	Thermo Scientific, Waltham, USA	375418PK
Triton X-100	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	T8787
Trypan Blue Stain	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	T8154
TrypLE Express Enzyme	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	12604-013
Tween-20	PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany	A4974-0100
Y-27632	TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany	1254
Zeocin	Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA	R25001