JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מציע מסגרת שיטתית להקמת אורגנואידים של סרטן השחלות משלבי מחלה שונים ונותן מענה לאתגרים של שונות ספציפית למטופלת כדי להגדיל את התשואה ולאפשר התרחבות חזקה לטווח ארוך ליישומים הבאים. הוא כולל שלבים מפורטים לעיבוד רקמות, זריעה, התאמת דרישות מדיה וצביעה אימונופלואורסצנטית.

Abstract

בעוד הקמת ביובנק לסרטן השחלות מאורגנואידים שמקורם במטופלות יחד עם מידע הרקע הקליני שלהם מבטיח התקדמות במחקר ובטיפול בחולים, סטנדרטיזציה נותרה אתגר בשל ההטרוגניות של ממאירות קטלנית זו, בשילוב עם המורכבות האינהרנטית של טכנולוגיית אורגנואידים. פרוטוקול הסתגלות זה מספק מסגרת שיטתית למימוש מלוא הפוטנציאל של אורגנואידים של סרטן השחלות, בהתחשב בשונות ספציפית למטופלת של אבות. על ידי יישום זרימת עבודה ניסיונית מובנית לבחירת תנאי תרבית ושיטות זריעה אופטימליים, עם בדיקות מקבילות של זריעה תלת-ממדית ישירה לעומת מסלול דו-ממדי/תלת-ממדי, אנו משיגים, ברוב המקרים, קווים מתרחבים ארוכי טווח חזקים המתאימים למגוון רחב של יישומים במורד הזרם.

יש לציין כי הפרוטוקול נבדק והוכח כיעיל במספר רב של מקרים (N = 120) של חומר מוצא הטרוגני מאוד, כולל סרטן שחלות בדרגה גבוהה ובדרגה נמוכה ושלבי המחלה עם debulking ראשוני, מחלה חוזרת ודגימות כירורגיות פוסט-ניאו-אדג'ובנטיות. בתוך סביבת איתות אקסוגנית נמוכה של Wnt ו-BMP גבוה, ראינו אבות רגישים באופן שונה להפעלת מסלול Heregulin 1 ß (HERß-1), כאשר HERß-1 מקדם היווצרות אורגנואידים בחלק מהמקרים ומעכב אותו באחרים. עבור תת-קבוצה של דגימות המטופל, היווצרות אורגנואידים אופטימלית וצמיחה ארוכת טווח מחייבים תוספת של גורם גדילה פיברובלסט 10 ו- R-Spondin 1 למדיום.

יתר על כן, אנו מדגישים את השלבים הקריטיים של עיכול רקמות ובידוד אבות ומצביעים על דוגמאות שבהן טיפוח קצר בדו-ממד על פלסטיק מועיל להיווצרות אורגנואידים לאחר מכן במטריצה מסוג 2 של תמצית קרום מרתף. בסך הכל, ביו-בנקאות אופטימלית דורשת בדיקה שיטתית של כל התנאים העיקריים במקביל כדי לזהות סביבת גידול נאותה עבור קווים בודדים. הפרוטוקול מתאר גם את הליך הטיפול בהטבעה, חתך וצביעה יעילים לקבלת תמונות ברזולוציה גבוהה של אורגנואידים, הנדרשת לפנוטיפ מקיף.

Introduction

הניהול הקליני של חולות עם סרטן שחלות אפיתל נותר מאתגר בשל הצגתו הקלינית ההטרוגנית בשלבים מתקדמים ושיעורי הישנות גבוהים1. שיפור הבנתנו את התפתחות סרטן השחלות וההתנהגות הביולוגית דורש גישות מחקריות המתייחסות לשונות הספציפית למטופלת במהלך המחלה, תגובה לטיפול ותכונות היסטופתולוגיות ומולקולריות2.

ביו-בנק, המאופיין באיסוף שיטתי ושימור ארוך טווח של דגימות גידול שמקורן בחולות סרטן השחלות, יחד עם המידע הקליני שלהן, מציע שימור של קבוצת חולים גדולה בשלבי מחלה שונים, כולל דגימות גידול מניתוחי דה-בולקציה ראשוניים, לאחר כימותרפיה ניאו-אדג'ובנטית וממחלות חוזרות. הוא טומן בחובו פוטנציאל רב ערך לקידום חקר הסרטן, ומשמש כמשאב של סמנים ביולוגיים פרוגנוסטיים מבטיחים ומטרות טיפוליות3. עם זאת, שיטות ביו-בנקאיות קונבנציונליות, כגון קיבוע פורמלין והקפאה, אינן מקובלות לביצוע מחקרים פונקציונליים על דגימות הגידול המקוריות בשל אובדן הכדאיות ושיבוש ארכיטקטורת הרקמה התלת-ממדית המקורית 4,5.

מחקרים על מנגנונים מולקולריים, באונקולוגיה ומחוצה לה, תלויים באופן מכריע בשימוש במודלים ניסיוניים מתאימים המשקפים נאמנה את הביולוגיה של המחלה ושומרים על תכונות חוץ גופיות של הרקמה שנצפתה in vivo. אורגנואידים שמקורם במטופל, המבוססים על שימור פוטנציאל ההתחדשות, משחזרים במעבדה את המבנה והתפקוד המקוריים של האפיתל ומאפשרים בדיקה בהקשר ספציפי למטופל. לכן, הם התגלו ככלים מבטיחים ביותר לחקר הסרטן ולרפואה מותאמת אישית, המגשרים על הפער בין מגוון קליני למחקר מעבדה 6,7,8,9. אסטרטגיות טיפוליות מותאמות אישית המבוססות על תגובות תרופתיות אינדיבידואליות של קווי אורגנואידים ובדיקת הרלוונטיות התפקודית של פרופילים מולקולריים, יכולות להיות מיושמות ישירות בטיפול בחולה10,11. האפשרות של טיפוח לטווח ארוך, כולל מאפיינים ספציפיים למטופל ואיסוף נתונים קליניים פרוספקטיביים רלוונטיים לאורך זמן, טומנת בחובה הבטחה גדולה לזיהוי גורמים פרוגנוסטיים ומנבאים חדשים המעורבים בהתקדמות המחלה ובמנגנוני התנגדות 3,9.

עם זאת, בניית ביובנק הכולל אורגנואידים מדגימות גידולים שונות דורשת שילוב של הקפדה על מתודולוגיה מורכבת וקביעת פרוטוקולים לתחזוקה קלה12. סטנדרטיזציה של תהליכים מבטיחה כי ניתן להקים ולתחזק את הביובנק ביעילות על ידי צוות מיומן גם בתחלופה גבוהה, תוך שמירה על תקני האיכות הגבוהים ביותר13. מספר מחקרים דיווחו על יצירה מוצלחת של קווי אורגנואידים יציבים של סרטן השחלות המתאימים לפרופיל המוטציוני והפנוטיפי של הגידול המקורי עם שיעורי יעילות משתנים. עם זאת, בנקאות ביולוגית שגרתית נותרה מאתגרת בפועל, במיוחד עבור צמיחה יציבה לטווח ארוך של קווים, שהיא תנאי מוקדם להרחבה בקנה מידה גדול או עריכה גנומית מוצלחת.

בפרט, נושא יכולת ההתרחבות נותר מוגדר באופן מעורפל בתחום שכן אורגנואידים המראים פוטנציאל צמיחה איטי ומוגבל נספרים לעיתים כקווים מבוססים. כפי שהודגם לראשונה על ידי הופמן ועמיתיו, מחקר שממצאיו העיקריים היוו את הבסיס לפרוטוקול מפותח זה, טיפול אופטימלי ברקמת סרטן השחלות דורש אסטרטגיה ייחודית כדי להתאים להטרוגניות14. אפיון פנוטיפי של האורגנואידים המתקבלים בשיטה זו ודמיון הדוק לרקמת הגידול ההורית אושרו על ידי ריצוף DNA פאנל וניתוח שעתוק של תרביות בוגרות (4-10 חודשי טיפוח) המדגימים את יציבות המודל 8,9,12,14.

בניגוד לסביבה הפרקרינית המווסתת את ההומאוסטזיס בחצוצרות הבריאות, שכבת האפיתל, שככל הנראה מניבה סרטן שחלות סרוסי בדרגה גבוהה (HGSOC), פוטנציאל התחדשות סרטן ויכולת היווצרות אורגנואידים, תלויה פחות בתוספי Wnt אקסוגניים. יתר על כן, איתות חלבון מורפוגנטי עצם פעיל (BMP), המאופיין בהיעדר Noggin בתווך אורגנואידי, הוכח כמועיל להקמת תרביות ארוכות טווח ממשקעי רקמה מוצקה של סרטן השחלות14,15. במהלך ביו-בנקאות שיטתית של מרבצים מוצקים של סרטן השחלות, אישרנו ממצאים אלה והקמנו את הצינור, עם פרטים המתוארים בפרוטוקול זה המבטיחים התרחבות מתמשכת לטווח ארוך ברוב המקרים. אנו מוצאים כי בדיקות מקבילות של הרכבי מדיה שונים ושיטות זריעה בעת עבודה עם מבודדים ראשוניים חיוניות לשיפור הקמתם של קווי אורגנואידים יציבים ארוכי טווח ולהגדלת התשואות המאפשרות התפשטות והרחבה חזקות לפורמטים מרובי בארות הדרושים לניסויים במורד הזרם16.

יתר על כן, טוהר ואיכות הדגימות שנאספו במהלך הניתוח הם בעלי חשיבות מכרעת לפוטנציאל התרגומי של אורגנואידים של סרטן השחלות במחקר בסיסי ובאבחון מולקולרי. המורכבות של ההצגה הקלינית של HGSOC דורשת שיתוף פעולה הדוק בין המנתחים, האונקולוגים והמדענים במעבדה כדי להבטיח שהחומר הרלוונטי מזוהה נכון, תנאי ההובלה נשמרים קבועים, וקווי אורגנואידים נוצרים ביעילות גבוהה המייצגת את המאפיינים החשובים ביותר של המחלה של כל חולה. פרוטוקול זה מספק מסגרת סטנדרטית אך ניתנת להתאמה כדי ללכוד את מלוא הפוטנציאל של אורגנואידים של סרטן השחלות, בהתחשב בהטרוגניות המאפיינת את סרטן השחלות16,17. יש לציין כי פרוטוקול זה מאפשר ביו-בנק אמין של הספקטרום הרחב של ההצגה הקלינית של סרטן השחלות, כולל סוגים היסטולוגיים שונים (סרטן שחלות בדרגה גבוהה ובדרגה נמוכה, LGSOC), משקעים שונים מאותם חולים המציגים הבדלים בוויסות גזע, רקמות מניתוחים במצב פוסט-ניאו-אדג'ובנטי, חומר ביופסיה ודגימות מניתוחים בשלב החוזר של התקדמות המחלה.

Protocol

דגימות רקמת גידול מניתוחי סרטן השחלות נאספו ואורגנואידים שמקורם במטופל נוצרו בהתאם לוועדת האתיקה של אוניברסיטת LMU (17-471), תוך שמירה על התקנות הקיימות של האיחוד האירופי, הלאומי והמקומי. כל מטופל המעורב במחקר הסכים לכך בכתב. בעת עבודה עם דגימות רקמות טריות, נדרשים אישורי בטיחות ביולוגית ברמה 2 וארונות זרימה למינרית. בהתחשב באופי ההדבקה הפוטנציאלי של דגימות הרקמה, אשר לא ניתן לשלול בשל היעדר בדיקות שגרתיות של מחלות זיהומיות רלוונטיות, יש צורך להבטיח כי תקנות בטיחות ביולוגית מוסדיות נשמרות בקפידה וכי ציוד מגן אישי הולם זמין עבור הצוות המבצע את הניסויים.

1. הכנות

  1. הכנה בינונית
    1. הכן את המדיה הדו-ממדית והתלת-ממדית טרי פעם בשבוע ואחסן אותם בטמפרטורה של 4°C.
      הערה: ההרכב המדויק של המרכיבים עבור כל מדיום מופיע בטבלה 1. גם סרטן השחלות בינוני 1 (OCM1) וגם OCM2 יכולים להיות בתוספת HER1ß (ריכוז סופי: 50 ng/mL), וכתוצאה מכך ארבעה מצבים שונים: OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß.
    2. צור פתרונות מלאי של ריאגנטים גורם גדילה ולשמור אותם ב 20 ° C ושל A83-01 ו nicotinamide (אחסון ב +4 ° C). בשל רגישות הטמפרטורה של גורמי הגדילה, השתמש בתמיסות מלאי מופשרות באופן מיידי להכנה בינונית והימנע ממחזורי הפשרה חוזרים ונשנים על ידי יצירת aliquots.
      הערה: הכנת מדיה היא שלב קריטי שיש לשלוט בו בקפדנות.
    3. הכנת מדיום מותנה RSPO-1
      1. הפשיר HA-R-Spondin1-Fc 293 תאי T (אחסון ב-80°C-) במהירות ב-37°C. שטפו אותם עם 10 מ"ל של מדיום תרבית בסיסית, בתוספת 10% נסיוב עגל עובר (FCS), המכונה מעתה מדיום תרבית בסיסית ++.
      2. יש להשהות מחדש את גלולת התא ב-12 מ"ל של תרבית בסיסית בינונית++ ולזרוע אותה בצלוחית T75.
      3. לפצל את התאים ביחס של 1:6 עם מגיב דיסוציאציה המכיל טריפסין (4 דקות ב 37 ° C) כאשר התאים מגיעים למפגש. זרעו אותם בצלוחית T75 חדשה.
      4. למחרת, הוסף phleomycin D1 (1,25 μL / mL) למדיום.
      5. לפצל את התאים ביחס של 1:20 עם טריפסין (4 דקות ב 37 ° C) כאשר התאים מגיעים למפגש. זרעו את התאים לצלוחיות T75 מרובות (מספר צלוחיות בהתאם לנפח הסופי המיועד) ב-30 מ"ל של תרבית בסיסית בינונית++ (המכילה 10% FCS) בתוספת פלאומיצין D1.
      6. התחל את ייצור המדיה המותנית כאשר התאים מגיעים לכ -50% מהמפגש: החלף את המדיום עם 40 מ"ל של מדיום תרבית בסיסית בתוספת 5% FCS ללא פלאומיצין D1.
      7. לאסוף את supernatant הראשון לאחר 3 ימים. כדי להסיר את הפסולת, צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 1,200 × גרם. שמור את supernatant במיכל סטרילי ב 4 ° C.
      8. הוסף מדיום תרבית בסיסי חדש בתוספת 5% FCS לתאים. לאסוף את supernatant השני לאחר 3-4 ימים. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-1,200 × גרם. הוסף את הסופרנאטנט השני לסופרנאטנט הראשון.
      9. מסננים את המדיום הממוזג באמצעות מסנן עליון של בקבוק 0.2 מיקרומטר.
      10. לבקרת איכות וכימות RSPO1, הוסף את המדיום המיוצר לקו תאים 293T (293T WntR, 7xTcf-eGFP)14, המומר ביציבות עם כתב Wnt18 הנושא פלסמיד GFP.
        הערה: בהתאם לכמות ולעוצמה של אות GFP, הפעילות של RSPO1 כאגוניסט של מסלול Wnt נבדקת על ידי כימות קו התאים של כתב Wnt.
      11. שמור aliquots של 15 מ"ל לשימוש מיידי (בתוך 1 שבוע) ב 4 °C. לאחסון ארוך יותר (6 חודשים) שמור על התווך הממוזג בטמפרטורה של -20°C.

2. ייזום תרבית אורגנואידים לסרטן השחלות

  1. בידוד רקמות ראשוני
    1. יש להעביר רקמות טריות ובנות קיימא, רצוי מיד לאחר הניתוח ולבצע בידוד תוך 20 שעות לכל היותר לאחר האיסוף. להבטיח מצב הובלה תקין במדיום איסוף רקמות עם תיבת הובלה מצויד חבילות קרות כ 4 ° C.
    2. במעבדה, להכין את הריאגנטים הדרושים ואת הציוד כדי להקל על עיבוד הדגימה בזמן:
      1. הפשרה תמצית קרום מרתף סוג II מטריצה (BME 2 מטריצה) על קרח (כ 2 שעות).
      2. הכינו אזמלים חד פעמיים, כלי דיסקציה מעוקרים (מספריים ופינצטה) ותוספות מסנן בגודל 400 מיקרומטר עבור צינורות 50 מ"ל.
      3. הכינו מיכל עם כמות קטנה של חנקן נוזלי להקפאת בזק ואמבט מים שחומם מראש ב 37 מעלות צלזיוס.
        הערה: עבודה בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית של תרבית תאים.
    3. שטפו היטב את הרקמה הטרייה בצלחת פטרי במי מלח חוצצי פוספט (PBS) (ללא Ca++ ו-Mg++). בתוך צלחת הפטרי, שברו את הרקמה באמצעות אזמלים חד פעמיים ו / או מספריים לחתיכות קטנות בגודל 3-5 מ"מ.
    4. הפרד את הרקמה המתקבלת לשלושה חלקים למטרות הבאות:
      1. לאסוף רקמות בצינורות קריוגניים. העבירו את הצינורות הקריוגניים למיכל המוכן המלא בחנקן נוזלי להקפאת זעזועים.
      2. לאסוף רקמות (2-3 מ"מ) לתוך מיכל דגימה היסטולוגי מלא פורמלין לקיבוע (24 שעות) ולהטמיע אותם בפרפין למטרות צביעה19,20.
      3. יתר על כן, הומוגניזציה של הרקמה לפני העיכול האנזימטי. למקסם את הדיסוציאציה המכנית עם אזמל ולהעביר אותו לתוך צינור רקמה 50 מ"ל.
        הערה: ודא כי הרקמה תמיד ספוגה PBS במהלך הומוגניזציה כדי למנוע התייבשות של הרקמה.
    5. שלב את הרקמה ההומוגנית עם תערובת עיכול המכילה PBS (ללא Ca++ ו- Mg++), Collagenase I (תמיסת מלאי 5 U/μL, ריכוז סופי 1 U/μL), ומעכב ROCK1 ו- 2 סלקטיבי (ריכוז סופי של 3 מיקרומטר) (רכיבים המפורטים בטבלה 1). השתמש 15 מ"ל של תערובת העיכול בצינור 50 מ"ל עבור כל 2 ס"מ3 של הגידול.
      הערה: חומר מוגבל (למשל, דגימות ביופסיה) דורש רק כמויות קטנות (בערך 2-3 מ"ל) של תערובת עיכול כדי להבטיח דיסוציאציה אנזימטית.
    6. עבור דיסוציאציה אנזימטית, לדגור על הצינור במשך 1.5 שעות באמבט מים ב 37 ° C. בצע מערבולות ספורדיות ונמרצות (בערך כל 20 דקות במשך 10-15 שניות) כדי לתמוך בדיסוציאציה מכנית.
    7. לאחר הדגירה, להוסיף 15 מ"ל של תרבית בסיסית קרה בינוני++ לצינור. צנטריפוגה 5 דקות ב 300 × גרם.
    8. לאחר הסרת supernatant, להוסיף 5 מ"ל של מדיום תרבית בסיסית חדשה ++. מסננים את מתלה התא באמצעות מסנן 400 מיקרומטר לתוך צינור טרי של 50 מ"ל.
    9. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 300 × גרם. הסר את supernatant ולשמור את גלולת התא.
    10. להסרת אריתרוציטים, הוסף 5 מ"ל של חיץ תאי דם אדומים (RBC) לגלולת התא. יש לדגור באמבט מים למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    11. הוסף 5 מ"ל של מדיום תרבית בסיסית ++ להפעלת ליזיס. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 300 × גרם. הוסף 3 מ"ל של תרבית בסיסית בינוני++ לגלולת התא.
    12. ספירת תאים ברי קיימא לאחר דילול 1:1 עם תמיסת כתמים כחולים טריפאן (למשל, 10 μL של הדגימה + 10 μL של תמיסת כתמים כחולים טריפאן) במונה תאים אוטומטי או ידנית בתא נויבאואר.
    13. חשב את מספר התאים הדרושים לזריעה תלת-ממדית ישירה. עבור כל מרבץ גידול, זרע לתוך צלחת בפורמט 48 בארות לפחות 2-3 בארות לכל מדיום סרטן השחלות, אשר מתאים בסך הכל 8-12 בארות במטריצה זריעה (OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß). חשב 30,000 תאים עבור כל באר בטיפה של 25 μL של מטריצה מסוג BME 2. לחלופין, בחר פורמט של 24 בארות עם 50 μL של מטריצת BME 2 ו- 50,000 תאי זרע לכל באר.
    14. זרעו את התאים הנותרים בדו-ממד (ראו שלב 2.1.13).
    15. פיפטה: כמות תרחיף תרבית בסיסית בינוני++ המכיל את המספר הכולל של התאים הדרושים לתוך צינור חדש וצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 × גרם. הסר את supernatant ולשמור את גלולת התא.
    16. על הקרח, הוסף את הכמות הכוללת של מטריצת BME 2 קרה (25 μL עבור כל באר בצלחת בפורמט 48 בארות; ומכאן, 100 μL עבור 4 בארות) לגלולה ולערבב היטב כדי להשיג פיזור שווה של תאים לכל באר על ידי pipeting בעדינות את הגלולה למעלה ולמטה מבלי ליצור בועות.
    17. זרעו את התאים בטיפות של מטריצת BME 2 (25 μL) לצלחת הריקה והמחוממת מראש של 48 בארות. כדי להשיג פיזור אחיד בין הבארות, הזז בעדינות ובאיטיות את הפיפטה למעלה ולמטה (3-4x) בתוך הצינור לפני העברת טיפת המטריצה BME 2 לכל באר כדי למנוע משקעים בתאים במהלך הפיזור.
    18. לאחר דגירה על הצלחת בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות לפחות כדי לאחד את הטיפות של מטריצת BME 2, פיפטה 250 μL של כל אחת מארבע מדיות סרטן השחלות (OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß) לתוך הבארות המתאימות.
    19. במקביל להליך הזריעה התלת-ממדי הישיר, שמרו על התאים המבודדים הנותרים על ידי התחלת תרבית דו-ממדית.
      1. לאחר צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 × גרם, להוסיף את הגלולה למדיום 2D. בחר את התבנית (בקבוק T75 או בקבוק T25), בהתאם למספר התאים הזמינים לאחר הזריעה התלת-ממדית.
      2. לדגור על הבקבוק במשך 3-5 ימים ב 37 ° C להידבקות התא. שמור על אותו מדיום במשך 72 השעות הראשונות.
      3. כאשר התאים מגיעים למפגש, מעבירים את התרבית למטריצת BME 2. אל תרחיבו את המבודדים הראשוניים בתרבות הדו-ממדית על ידי פיצול מכיוון שהתפשטות ארוכת טווח בדו-ממד מזיקה לפוטנציאל הגבעול.
  2. מעבר מתרבות דו-ממדית לתרבות תלת-ממדית
    1. בבקבוק T75 או T25, שטפו את השכבה החד-שכבתית 2x עם 5 מ"ל PBS כדי לנתק את התאים מהמשטח התחתון. לדגור עם 1 מ"ל של טריפסין במשך 10 דקות ב 37 ° C.
    2. הוסף 5 מ"ל של תרבית בסיסית קרה בינוני++ לנטרול מגיב הדיסוציאציה. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 300 × גרם.
    3. הוסף 3 מ"ל של מדיום תרבית בסיסית ++ לכדור. ספור את התאים כמתואר בשלבים 2.1.12-2.1.13. זרעים להרכבי המדיה השונים (ראה איור 1) כמתואר בשלבים 2.1.16-2.1.18.
  3. הערכת צמיחת אורגנואידים
    1. דמיינו את הבארות לפחות פעם בשבוע כדי לתעד את צמיחת האורגנואידים. צור תמונות דומות באיכות גבוהה של תרבית דו-ממדית/תלת-ממדית ולוחות זריעה ישירים במיקרוסקופ ניגודיות פאזה. דאג לעקביות בהגדלה והשתמש 4x לסקירה כללית של הבארות (כימות) ו- 10x ו- 20x לתיעוד המורפולוגיה של אורגנואידים.
    2. ארגן אחסון של תמונות בתיקיות המוקדשות לשורות בודדות.
    3. בחר את קו האורגנואידים הטוב ביותר לגידול לטווח ארוך על ידי הערכה השוואתית של היווצרות אורגנואידים בשיטות הזריעה השונות (דו-ממד ואחריו זריעה תלת-ממדית לעומת זריעה תלת-ממדית ישירה) ובהרכבי מדיה שונים (OCM1, OCM1+ HER1ß, OCM2 ו-OCM2+ HER1ß).
      1. בממוצע, 14-21 ימים לאחר הבידוד, להעריך את הפוטנציאל ליצירת אורגנואידים (כמות), כמו גם את הגודל ואת הפנוטיפ התאי של אורגנואידים שגדלו בתנאים שונים. חפש את התכונות הבאות: היעדר vacuoles, blebbing קרום או אובדן הידבקות, ועיגול של תאים.

3. טיפוח אורגנואידים לטווח ארוך

  1. מעבר אורגנואיד
    1. הימנע מפיצול אורגנואידים בתדירות גבוהה מדי ובמהלך שלב השגשוג. לנהל הליכי עיכול מכניים ואנזימטיים עם מרווחים של יותר מ -10 ימים.
    2. כדי לשבש כל טיפת מטריצה BME 2, הוסף 250 μL (פורמט 48 באר) או 500 μL (פורמט 24 בארות) של תרבית בסיסית קרה כקרח בינוני++. הקפידו על המסה מלאה של הטיפה והפיפטה לסירוגין למעלה ולמטה וגרדו את תחתית הצלחת. מעבירים את תרחיף התא לצינור של 15 מ"ל ומניחים אותו על קרח. הוסף 1 מ"ל של תרבית בסיסית קרה כקרח בינוני++.
      הערה: יעילות ההסרה של מטריצת BME 2 תלויה מאוד בטמפרטורה הבינונית מכיוון שההמסה הטובה ביותר מושגת מתחת ל- 4 °C.
    3. בריכה 2 - 3 בארות טכניות משכפלות להרחבה אפילו. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 300 × גרם. בדוק את תוכן התרחיף מול מקור האור כדי לראות אם ג'ל BME 2 עדיין גלוי. הסירו את הסופרנאטנט וחזרו על השטיפה עם מדיום קר כקרח אם מטריצת BME 2 עדיין גלויה.
    4. לדגור עם 1 מ"ל של טריפסין (מאוחסן ב 20-25 ° C) באמבט מים ב 37 ° C במשך 7-10 דקות. מערבולת באופן ספורדי במשך 10 שניות כדי להגביר את הדיסוציאציה. בדוק את הצינור מעת לעת חזותית כדי לראות אם הדיסוציאציה מתקדמת.
    5. משוך את מתלה התא למעלה ולמטה עם מזרק דרך מחט בגודל הנע בין 23 G ל 27 G. בדוק אם גושי תאים גדולים עדיין קיימים וחזור על ההליך במידת הצורך.
      הערה: פיצול באמצעות מזרק הוא אופציונלי, וגודל המחט תלוי ביעילות הדיסוציאציה הנדרשת. תרחיף תאים הומוגני מוביל לפיזור שווה בין הבארות.
    6. הוסף 1 מ"ל של תרבית בסיסית קרה בינוני++ כדי להשבית את התגובה.
    7. אופציונלי: ספור את התאים כמתואר בשלבים 2.1.12-2.1.13 וקבע את יחס הפיצול למעבר ההורים (לדוגמה, בארות 1:3).
    8. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 300 × גרם. הסר את supernatant.
    9. לבצע זריעה כמתואר בשלבים 2.1.16-2.1.18 וליישם את המדיום האורגנואידי האופטימלי לסרטן השחלות בהתאם לתרבות ארוכת הטווח שכבר נקבעה. שנה את המדיום סרטן השחלות כל 3-4 ימים.
    10. במקרה של הפרעה בטיפת המטריצה BME 2 במהלך שינוי בינוני, שקול זריעה מחדש ללא עיכול אנזימטי. כדי למנוע הפרעה של טיפה, בזהירות לבצע את הליך שינוי בינוני ללא pipetting ישיר על טיפת מטריצה BME 2. בנוסף, הימנע מהשארת כמות מוגזמת של תרבית בסיסית שיורית בינוני++ על הגלולה לפני דילול עם מטריצת BME 2 בשלב 2.1.16 מכיוון שזה עלול להשפיע על שבריריות הטיפות.
  2. שימור בהקפאה של אורגנואידים
    הערה: בצע שימור בהקפאה של האורגנואידים במהלך שלב ההתפשטות בשבוע הראשון לאחר המעבר.
    1. לשבש את טיפת מטריצת BME 2 עם תרבית בסיסית קרה כקרח בינוני++ לפי שלב 3.1.2. לאחר צנטריפוגה והשלכת הסופרנאטנט כמתואר בשלב 3.1.3, יש לעבוד על קרח ולהשהות מחדש את כדורית התא ב-1 מ"ל של מדיום שימור קריוגני קר כקרח. העבר את תרחיף התא לצינורות קריוגניים מסומנים מראש של 1.8 מ"ל.
    2. אחסנו את הצינורות במיכל הקפאה מקורר מראש המכיל אלכוהול איזופרופיל והניחו אותם בטמפרטורה של -80°C למשך הלילה.
    3. שמור את צינורות המניות ב -80 ° C למשך מקסימום של חודשיים. העברה לחנקן נוזלי לאחסון יציב לטווח ארוך.
  3. הפשרת מניות אורגנואידים
    1. חימום מראש של 9 מ"ל של תרבית בסיסית בינונית ++ באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס בצינור מסומן 15 מ"ל.
    2. העבירו את בקבוקון המלאי הרצוי מהאחסון בטמפרטורה של -80°C או לחנקן נוזלי למיכל הובלה מלא בחנקן נוזלי.
    3. מעבירים את צינור ההקפאה לאמבט מים ב -37 מעלות צלזיוס ומסעירים אותו בעדינות עד שהחומר הקפוא ליד קירות הצינור מתחיל להפשיר.
    4. מפזרים את מתלה האורגנואיד באיטיות לתוך הצינור המסומן מלא 9 מ"ל של מדיום. נערו בעדינות את הצינור. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 × גרם ולהסיר את supernatant.
    5. יש לבצע זריעה כמתואר בשלבים 2.1.16-2.1.18 וליישם את המדיום האורגנואידי האופטימלי המתאים לסרטן השחלות, בהתאם לתנאי התרבית ארוכי הטווח שכבר נקבעו עבור השושלת הבודדת.
  4. קיבוע אורגנואידים
    1. בצע איסוף אורגנואידים כמתואר בשלבים 3.1.2-3.1.3.
    2. יש להוסיף 3 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-PBS (pH 7.4) ולדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    3. יש לשטוף 2x עם 5 מ"ל PBS, צנטריפוגה למשך 3 דקות ב 300 × גרם, ולהסיר את supernatant. הוסף 4 מ"ל של PBS טרי לגלולה ולשמור אותו על 4 ° C עד הטבעה.
      הערה: אורגנואידים קבועים יציבים ואחסון ב-4°C אפשרי למשך חודש אחד לפני ההטבעה.
    4. מחממים את הג'ל ההיסטולוגי (מאוחסן ב-20°C-) ב-65°C עד לנוזל.
    5. זהה את האורגנואידים הקבועים מיושבים ונראים בתחתית הצינור. הסר את supernatant. במקרה של כדורית תא משובשת, בצע צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 300 × גרם והשליך את PBS supernatant.
    6. להשהות את הגלולה ב 100 μL של ג'ל חם על ידי pipeting בעדינות למעלה ולמטה. מעבירים את הטיפה לחתיכת סרט איטום ומאפשרים התמצקות לאחר ~15 דקות בטמפרטורת החדר.
    7. העבר את טיפת הג'ל הקבועה לקסטת פרפין הרקמה. ביצוע פרוטוקולי הטמעת רקמות סטנדרטיים19,20.
    8. חותכים פרוסות בעובי 5-10 מיקרומטר בעזרת כלי חיתוך מיקרו-חתך. העבירו את החיתוכים לשקופיות היסטולוגיה. יבש את המגלשות במשך 1 שעה ב 65 ° C; שמור אותם במקום יבש.
  5. צביעה אימונופלואורסצנטית של קטעי אורגנואידים
    1. העבר את השקופיות המוכנות דרך מגשי זכוכית עם סדרת הדילול הבאה: 2 x 15 דקות חומר ניקוי עבור היסטולוגיה; 15 דקות 100% אתנול; 1 דקות 100% אתנול; 10 דקות 96% אתנול; 5 דקות 70% אתנול; 5 דקות 50% אתנול.
    2. מוסיפים PBS ושומרים 5 דקות על השייקר ב-100 סל"ד. חזרו על הכביסה 2x.
    3. הוסף תמיסת אחזור אנטיגן (Tris(hydroxymethyl)aminomethane-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)-buffer [pH 9.0] או Citrate [pH 6.0]) לשקופיות הממוקמות בתא thermostable . בסיר אידוי, שמרו את המיכל עם המגלשות למשך 30 דקות, ולאחר מכן התקררו לטמפרטורת החדר.
    4. חזור על שלב 3.5.2.
    5. העבירו את התא המכיל את המגלשות למשך 15 דקות לתמיסת דטרגנט חדירה 1% (ב-PBS).
    6. חזור על שלב 3.5.2.
    7. קונטרו את מיקום האורגנואידים על המגלשות בעזרת עט שעווה מוכתם חיסון כדי לשמור על הטיפה במהלך השלבים הבאים.
    8. מוסיפים בכל שקופית 100 μL של 10% סרום במדיום דילול, בהתאם למין הנוגדן המשני.
    9. חזור על שלב 3.5.2.
    10. יש לדלל את הנוגדנים הראשוניים בתווך, המוביל לנפח סופי של 100 μL. יש לשמור בטמפרטורה של 4°C למשך 16 שעות לפחות במגש דגירה/תא לחות.
    11. חזור על שלב 3.5.2.
    12. לדלל את הנוגדנים המשניים בתווך, המוביל טיפות 100 μL, ולשמור במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר במגש הדגירה.
    13. חזור על שלב 3.5.2.
    14. הוסף תמיסת נגד גרעינית DAPI (4',6-Diamidin-2-phenylindol, Dihydrochloride) מדולל בתווך דילול 1:1,000. יש לשמור למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לדגירה.
    15. חזור על שלב 3.5.2.
    16. מוסיפים אמצעי הרכבה ומכסים בכיסוי. הדקו את המגלשות עם לק שקוף לאחר ייבוש (בערך לאחר 8-12 שעות).
    17. תמונה עם מיקרוסקופ קונפוקלי או מיקרוסקופ פלואורסצנטי אחר. צור תמונות סקירה וכן תמונות מפורטות של מבנים תת-תאיים הלוכדים את המאפיינים העיקריים של מורפולוגיה אורגנואידית.

תוצאות

לאחר דיסוציאציה ראשונית של רקמות, סינון וספירה, תאים נזרעים במקביל ישירות בפורמט תלת ממדי, כפי שהוסבר לעיל, כמו גם את התרחיף בבקבוק להרחבה דו-ממדית קצרה. במקרים מסוימים, ההתפשטות הדו-ממדית הארעית משפיעה באופן חיובי על היווצרות האורגנואידים, והקו ארוך הטווח נקבע בהצלחה באמצעות מסלול זה, בעו...

Discussion

הפרוטוקול המתוכנן מתייחס לאתגרים קודמים של ביו-בנקאות אורגנואידית של סרטן השחלות ביחס להיווצרות אורגנואידים ופוטנציאל מעבר ארוך טווח ומבטיח יצירת קווים הניתנים להרחבה מלאה מרוב משקעי הגידול המוצקים. תהליך האיסוף הכירורגי של דגימות גידול שישמשו לייצור אורגנואידים משפיע באופן משמעותי ע...

Disclosures

מ.ק. רשום כממציא על פטנט הקשור למדיום לאורגנואידים של סרטן השחלות. F.T. קיבלה מימון מחקר, מועצה מייעצת, כבוד והוצאות נסיעה מ-AstraZeneca, Clovis, Eisai, ImmunoGen, Medac, MSD, PharmaMar, Roche, SAGA diagnostics ו-Tesaro/GSK. S.M. קיבלה מימון מחקר, מועצה מייעצת, הוצאות כבוד או נסיעות: AbbVie, AstraZeneca, Clovis, Eisai, GlaxoSmithKline, Hubro, Medac, MSD, Novartis, Nykode, Olympus, PharmaMar, Pfizer, Roche, Sensor Kinesis, טבע, Tesaro.

Acknowledgements

המחקר ממומן על ידי המרכז הגרמני לחקר הסרטן DKTK, אתר שותף מינכן, שותפות בין DKFZ ובית החולים האוניברסיטאי LMU מינכן. המחקר נתמך גם על ידי מענק הסיוע הגרמני לסרטן (#70113426 ו- #70113433). הטבעה של פרפין של רקמות ואורגנואידים בוצעה במתקן הליבה של המכון לאנטומיה, הפקולטה לרפואה, LMU מינכן, מינכן. הדמיה קונפוקלית בוצעה במתקן הליבה הדמיה ביולוגית במרכז הביו-רפואי (BMC). המחברים רוצים להודות לסימון הופמן, מריה פישר, קורנליה הרבסט, סבין פינק ומרטינה רחמה, על העזרה הטכנית.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 Sterican 26 GBraun, Melsungen, Germany4657683
100 Sterican 27 GBraun, Melsungen, Germany4657705
293T HA Rspo1-FcR&D systems, Minneapolis, USA3710-001-01Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111
A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV)Merck, Darmstadt, Germany616454
Advanced DMEM/F-12 Medium Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA12634028
Anti-p53 antibody (DO1)Santa Cruz Biotechnology, Texas, USAsc-126
Anti-PAX8 antibodyProteintech, Manchester, UK 10336-1-AP
B-27 Supplement (50x)Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA17504-044
Bottle-top vacuum filter 0.2 µmCorning, Berlin, Germany 430049
CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria661175
CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria690160
CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria658175
Collagenase IThermo Scientific, Waltham, USA17018029
Costar 48-well Clear TC-treated Corning, Berlin, Germany 3548
Cryo SFMPromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, GermanyC-29912
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, PathclearR&D systems, Minneapolis, USA3533-005-02Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix  Corning, 356231 
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgGJackson Immuno715-175-151
DAKO  Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen RetrieverSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyC9999-1000ML
DAPIThermo Scientific, Waltham, USA62248
Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555Thermo Scientific, Waltham, USAA32794
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Scientific, Waltham, USAA32814
Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA14190-094
Epredia Richard-Allan Scientific HistoGelThermo Scientific, Waltham, USAEpredia HG-4000-012
Falcon 24-well Polystyrene Corning, Berlin, Germany 351447
Feather scalpel Pfm medical, Cologne, Germany200130010
Fetal Bovine SerumGibco, Thermo Scientific, Waltham, USA10270106
Formalin 37% acid free, stabilizedMorphisto, Offenbach am Main, Germany1019205000
GlutaMAXGibco, Thermo Scientific, Waltham, USA35050038
HEPES (1 M)Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA156630080
Human EpCAM/TROP-1 AntibodyR&D systems, Minneapolis, USAAF960
Human FGF10Peprotech, NJ, USA100-26
Human recombinant BMP2Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USAPHC7146
Human recombinant EGFGibco, Thermo Scientific, Waltham, USAPHG0311L
Human recombinant Heregulin beta-1Peprotech, NJ, USA100-03
LAS X core SoftwareLeica Microsystemshttps://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/
Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal MicroscopeLeica Microsystems
N-2 Supplement (100x)Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA17502-048
NicotinamideSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyN0636
Omnifix 1 mLBraun, Melsungen, Germany3570519
Paraffin
ParafilmOmnilab, Munich, Germany5170002
Paraformaldehyd Morphisto, Offenbach am Main, Germany1176201000
Pen StrepGibco, Thermo Scientific, Waltham, USA15140-122
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyP4333-100
PluriStrainer 400 µmPluriSelect, Leipzig, Germany43-50400-01
PrimocinInvivoGen, Toulouse, Franceant-pm-05
Red Blood Cell Lysing BufferSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany11814389001
RoticlearCarl Roth, Karlsruhe, GermanyA538.5
Surgipath ParaplastLeica, Wetzlar, Germany39602012
Thermo Scientific Nunc CryovialsThermo Scientific, Waltham, USA375418PK
Triton X-100Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyT8787
Trypan Blue StainSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyT8154
TrypLE Express Enzyme Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA12604-013
Tween-20PanReac AppliChem, Darmstadt, GermanyA4974-0100
Y-27632TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany1254
ZeocinInvitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USAR25001

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 72 (1), 7-33 (2022).
  2. Berger, A. C., et al. A comprehensive pan-cancer molecular study of gynecologic and breast cancers. Cancer Cell. 33 (4), 690-705 (2018).
  3. Watson, R. W. G., Kay, E. W., Smith, D. Integrating biobanks: addressing the practical and ethical issues to deliver a valuable tool for cancer research. Nat Rev Cancer. 10 (9), 646-651 (2010).
  4. Coppola, L., et al. Biobanking in health care: evolution and future directions. J Transl Med. 17 (1), 172 (2019).
  5. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
  6. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  7. Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discov. 8 (11), 1404-1421 (2018).
  8. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
  9. Larsen, B. M., et al. A pan-cancer organoid platform for precision medicine. Cell Rep. 36 (4), 109429 (2021).
  10. Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. J Mol Med (Berl). 95 (7), 729-738 (2017).
  11. Larsen, B. M., Cancino, A., Shaxted, J. M., Salahudeen, A. A. Protocol for drug screening of patient-derived tumor organoids using high-content fluorescent imaging. STAR Protoc. 3 (2), 101407 (2022).
  12. Senkowski, W., et al. A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids. Dev Cell. 58 (12), 1106-1121 (2023).
  13. LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. Next-generation cancer organoids. Nat Mater. 21 (2), 143-159 (2022).
  14. Hoffmann, K., et al. Stable expansion of high-grade serous ovarian cancer organoids requires a low-Wnt environment. EMBO J. 39 (6), e104013 (2020).
  15. Kessler, M., et al. The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids. Nat Commun. 6, 8989 (2015).
  16. Trillsch, F., et al. Protocol to optimize the biobanking of ovarian cancer organoids by accommodating patient-specific differences in stemness potential. STAR Protoc. 4 (3), 102484 (2023).
  17. Maenhoudt, N., et al. Developing organoids from ovarian cancer as experimental and preclinical models. Stem Cell Reports. 14 (4), 717-729 (2020).
  18. Fuerer, C., Nusse, R. Lentiviral vectors to probe and manipulate the Wnt signaling pathway. PLoS One. 5 (2), e9370 (2010).
  19. . Leica ASP300S - Advanced smart processor vacuum tissue processor, instructions for use, V 2.1 Available from: https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/media_product-download/2022-01/Leica_ASP300S_IFU_2v1N_en.pdf (2021)
  20. Thermo Scientific. . Microm EC350 Modular tissue embedding center Instruction manual. , (2009).
  21. Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Sci Rep. 10 (1), 12581 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved