Strategia per la biobanca degli organoidi del carcinoma ovarico: affrontare l'eterogeneità interpaziente tra sottotipi istologici e stadi di malattia

Riepilogo

Questo protocollo offre un quadro sistematico per la creazione di organoidi di carcinoma ovarico provenienti da diversi stadi di malattia e affronta le sfide della variabilità specifica del paziente per aumentare la resa e consentire una robusta espansione a lungo termine per le applicazioni successive. Include passaggi dettagliati per la lavorazione dei tessuti, la semina, la regolazione dei requisiti dei terreni e la colorazione in immunofluorescenza.

Abstract

Mentre la creazione di una biobanca per il cancro ovarico a partire da organoidi derivati da pazienti insieme alle loro informazioni cliniche di base promette progressi nella ricerca e nella cura dei pazienti, la standardizzazione rimane una sfida a causa dell'eterogeneità di questa neoplasia maligna letale, combinata con la complessità intrinseca della tecnologia degli organoidi. Questo protocollo adattabile fornisce un quadro sistematico per realizzare il pieno potenziale degli organoidi del carcinoma ovarico considerando una variabilità dei progenitori specifica per il paziente. Implementando un flusso di lavoro sperimentale strutturato per selezionare le condizioni di coltura e i metodi di semina ottimali, con test paralleli della semina 3D diretta rispetto a un percorso 2D/3D, otteniamo, nella maggior parte dei casi, robuste linee di espansione a lungo termine adatte a un'ampia gamma di applicazioni a valle.

In particolare, il protocollo è stato testato e si è dimostrato efficace in un gran numero di casi (N = 120) di materiale di partenza altamente eterogeneo, tra cui carcinoma ovarico di alto e basso grado e stadi della malattia con debulking primario, malattia ricorrente e campioni chirurgici post-neoadiuvanti. All'interno di un ambiente di segnalazione esogena a basso Wnt e alto BMP, abbiamo osservato che i progenitori sono diversamente suscettibili all'attivazione della via Heregulin 1 ß (HERß-1), con HERß-1 che promuove la formazione di organoidi in alcuni mentre la inibe in altri. Per un sottoinsieme dei campioni del paziente, la formazione ottimale di organoidi e la crescita a lungo termine richiedono l'aggiunta del fattore di crescita dei fibroblasti 10 e della R-Spondina 1 al terreno.

Inoltre, evidenziamo le fasi critiche della digestione tissutale e dell'isolamento dei progenitori e indichiamo esempi in cui una breve coltivazione in 2D su plastica è vantaggiosa per la successiva formazione di organoidi nella matrice di tipo 2 dell'estratto di membrana basale. Nel complesso, un biobanking ottimale richiede test sistematici di tutte le principali condizioni in parallelo per identificare un ambiente di crescita adeguato per le singole linee. Il protocollo descrive anche la procedura di gestione per l'inclusione, il sezionamento e la colorazione efficienti per ottenere immagini ad alta risoluzione degli organoidi, necessarie per una fenotipizzazione completa.

Introduzione

La gestione clinica delle pazienti con carcinoma ovarico epiteliale rimane impegnativa a causa della sua presentazione clinica eterogenea in stadi avanzati e degli alti tassi di recidiva¹. Migliorare la nostra comprensione dello sviluppo del carcinoma ovarico e del comportamento biologico richiede approcci di ricerca che affrontino la variabilità specifica del paziente durante il decorso della malattia, la risposta al trattamento e le caratteristiche istopatologiche e molecolari².

La biobanca, caratterizzata dalla raccolta sistematica e dalla conservazione a lungo termine di campioni tumorali derivati da pazienti con carcinoma ovarico insieme alle loro informazioni cliniche, offre la conservazione di un'ampia coorte di pazienti in diversi stadi di malattia, compresi campioni tumorali provenienti da interventi chirurgici primari di debulking, dopo chemioterapia neoadiuvante e da malattia ricorrente. Possiede un potenziale prezioso per far progredire la ricerca sul cancro, fungendo da risorsa di promettenti biomarcatori prognostici e bersagli terapeutici³. Tuttavia, i metodi convenzionali di biobanca, come la fissazione e il congelamento della formalina, non sono suscettibili di condurre studi funzionali sui campioni tumorali originali a causa della perdita di vitalità e della rottura dell'architettura tissutale tridimensionale nativa ^4,5.

Gli studi sui meccanismi molecolari, in oncologia e non solo, dipendono in modo cruciale dall'utilizzo di opportuni modelli sperimentali che riflettano fedelmente la biologia della malattia e mantengano in vitro le proprietà del tessuto osservato in vivo. Gli organoidi derivati dal paziente, basati sulla conservazione del potenziale di rinnovamento, riproducono in laboratorio la struttura e la funzione originali dell'epitelio e consentono di eseguire test in un contesto specifico per il paziente. Pertanto, sono emersi come strumenti molto promettenti per la ricerca sul cancro e la medicina personalizzata, colmando il divario tra la diversità clinica e la ricerca di laboratorio 6,7,8,9. Strategie terapeutiche personalizzate basate sulle risposte farmacologiche individuali delle linee di organoidi e sulla verifica della rilevanza funzionale dei profili molecolari possono essere potenzialmente applicate direttamente alla cura del paziente^10,11. La possibilità di una coltivazione a lungo termine che includa le caratteristiche specifiche del paziente e la raccolta di dati clinici prospettici rilevanti nel tempo è molto promettente per identificare nuovi fattori prognostici e predittivi coinvolti nella progressione della malattia e nei meccanismi di resistenza ^3,9.

Ciononostante, la costruzione di una biobanca che includa organoidi provenienti da diversi campioni tumorali richiede una combinazione di stretta aderenza a una metodologia complessa e la creazione di protocolli per una facile manutenzione¹². La standardizzazione dei processi garantisce che la biobanca possa essere costituita e mantenuta in modo efficiente da personale qualificato anche in caso di elevato turnover, rispettando allo stesso tempo i più elevati standard di qualit๳. Diversi studi hanno riportato il successo della generazione di linee di organoidi stabili per carcinoma ovarico corrispondenti al profilo mutazionale e fenotipico del tumore originale con tassi di efficienza variabili. Tuttavia, la biobanca di routine rimane impegnativa nella pratica, in particolare per la crescita stabile a lungo termine delle linee, che è un prerequisito per l'espansione su larga scala o per il successo dell'editing genomico.

In particolare, la questione dell'espandibilità rimane vagamente definita nel campo in quanto gli organoidi che mostrano un potenziale di crescita lento e limitato sono occasionalmente conteggiati come linee stabilite. Come inizialmente dimostrato da Hoffmann et al., uno studio i cui principali risultati hanno fornito la base per questo protocollo ulteriormente sviluppato, la gestione ottimale del tessuto del carcinoma ovarico richiede una strategia unica per adattarsi all'eterogeneità¹⁴. La caratterizzazione fenotipica degli organoidi ottenuti con questo metodo e la stretta somiglianza con il tessuto tumorale parentale sono state confermate dal sequenziamento del DNA del pannello e dall'analisi trascrittomica di colture mature (4-10 mesi di coltivazione) dimostrando la stabilità del modello 8,9,12,14.

In contrasto con l'ambiente paracrino che regola l'omeostasi nelle tube di Falloppio sane, lo strato epiteliale, che probabilmente produce il carcinoma ovarico sieroso di alto grado (HGSOC), il potenziale di rigenerazione del cancro e la capacità di formazione di organoidi, è meno dipendente dall'integrazione esogena di Wnt. Inoltre, la segnalazione attiva della proteina morfogenetica ossea (BMP), caratterizzata dall'assenza di Noggin nel terreno organoide, si è dimostrata utile per la creazione di colture a lungo termine da depositi di tessuto solido del cancro ovarico^14,15. Durante il biobanking sistematico dei depositi solidi di carcinoma ovarico, abbiamo confermato questi risultati e impostato la pipeline, con i dettagli delineati in questo protocollo che garantisce un'espansione sostenuta a lungo termine nella maggior parte dei casi. Riteniamo che i test paralleli di diverse composizioni di terreni e modalità di semina quando si lavora con isolati primari siano essenziali per migliorare la creazione di linee di organoidi stabili a lungo termine e per aumentare le rese consentendo una propagazione robusta e l'espansione in formati multi-pozzetto necessari per gli esperimenti a valle¹⁶.

Inoltre, la purezza e la qualità dei campioni raccolti durante l'intervento chirurgico sono di fondamentale importanza per il potenziale traslazionale degli organoidi del carcinoma ovarico nella ricerca di base e nella diagnostica molecolare. La complessità della presentazione clinica dell'HGSOC richiede una stretta collaborazione tra i chirurghi, gli oncologi e gli scienziati in laboratorio per garantire che il materiale pertinente sia correttamente identificato, che le condizioni di trasporto siano mantenute costanti e che le linee di organoidi siano generate con elevata efficienza che rappresentano le caratteristiche più importanti della malattia di ciascun paziente. Questo protocollo fornisce un quadro standardizzato ma adattabile per catturare il pieno potenziale degli organoidi del carcinoma ovarico, considerando l'eterogeneità che caratterizza il carcinoma ovarico^16,17. In particolare, questo protocollo consente un biobanking affidabile dell'ampio spettro della presentazione clinica del carcinoma ovarico, compresi diversi tipi istologici (carcinoma ovarico di alto e basso grado, LGSOC), diversi depositi delle stesse pazienti che presentano differenze nella regolazione della staminalità, tessuti provenienti da interventi chirurgici in ambito post-neoadiuvante, materiale bioptico e campioni provenienti da interventi chirurgici nella fase ricorrente della progressione della malattia.

Protocollo

Sono stati raccolti campioni di tessuto tumorale provenienti da interventi chirurgici per il cancro ovarico e sono stati generati organoidi derivati da pazienti in conformità con il Comitato etico dell'Università LMU (17-471), aderendo alle normative UE, nazionali e locali vigenti. Ogni paziente coinvolto nello studio ha acconsentito in forma scritta. Quando si lavora con campioni di tessuto fresco, sono necessari il permesso di sicurezza di livello 2 di biosicurezza e gli armadi a flusso laminare. Data la natura potenzialmente infettiva dei campioni di tessuto, che non può essere esclusa a causa della mancanza di test di routine delle malattie infettive pertinenti, è necessario garantire che le norme istituzionali in materia di biosicurezza siano rigorosamente rispettate e che siano disponibili adeguati dispositivi di protezione individuale per il personale che conduce gli esperimenti.

1. Preparativi

1. Preparazione media
   1. Preparare i supporti 2D e 3D una volta alla settimana e conservarli a 4 °C.
      NOTA: L'esatta composizione degli ingredienti per ciascun mezzo è elencata nella Tabella 1. Sia il mezzo 1 (OCM1) che l'OCM2 possono essere ulteriormente integrati da HER1ß (concentrazione finale: 50 ng/mL), dando luogo a quattro diverse condizioni: OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß.
   2. Creare soluzioni madre dei reagenti del fattore di crescita e mantenerle a 20 °C e di A83-01 e nicotinamide (conservazione a +4 °C). A causa della sensibilità alla temperatura dei fattori di crescita, utilizzare immediatamente soluzioni madre scongelate per la preparazione del terreno ed evitare ripetuti cicli di scongelamento creando aliquote.
      NOTA: La preparazione dei supporti è una fase critica che deve essere rigorosamente controllata.
   3. Preparazione del terreno condizionato RSPO-1
      1. Scongelare rapidamente le cellule T HA-R-Spondin1-Fc 293 (conservazione a -80 °C) a 37 °C. Lavarli con 10 ml di terreno di coltura basale, integrato con il 10% di siero fetale di vitello (FCS), d'ora in poi denominato terreno di coltura basale++.
      2. Risospendere il pellet cellulare in 12 mL di terreno di coltura basale++ e seminarlo in un matraccio T75.
      3. Dividere le cellule in un rapporto di 1:6 con un reagente di dissociazione contenente tripsina (4 minuti a 37 °C) quando le cellule raggiungono la confluenza. Seminali in un nuovo pallone T75.
      4. Il giorno successivo, aggiungere la fleomicina D1 (1,25 μL/mL) al terreno.
      5. Dividere le cellule in un rapporto di 1:20 con tripsina (4 minuti a 37 °C) quando le cellule raggiungono la confluenza. Seminare le cellule in più matracci T75 (numero di matracci in base al volume finale desiderato) in 30 mL di terreno di coltura basale++ (contenente il 10 % di FCS) integrato con fleomicina D1.
      6. Iniziare la produzione di terreni condizionati quando le cellule raggiungono circa il 50% di confluenza: sostituire il terreno con 40 mL di terreno di coltura basale integrato con il 5% di FCS senza fleomicina D1.
      7. Raccogliere il primo surnatante dopo 3 giorni. Per rimuovere i detriti, centrifugare per 10 minuti a 1.200 × g. Conservare il surnatante in un contenitore sterile a 4 °C.
      8. Aggiungere alle cellule un nuovo terreno di coltura basale integrato con FCS al 5%. Raccogliere il secondo surnatante dopo 3-4 giorni. Centrifugare per 10 minuti a 1.200 × g. Aggiungere il secondo surnatante al primo surnatante.
      9. Filtrare il mezzo condizionato utilizzando un filtro per tappo di bottiglia da 0,2 μm.
      10. Per il controllo di qualità e la quantificazione di RSPO1, aggiungere il terreno prodotto a una linea cellulare 293T (293T WntR, 7xTcf-eGFP)¹⁴, trasdotta stabilmente con plasmide GFP portatrice di Wnt reporter¹⁸.
          NOTA: A seconda della quantità e dell'intensità del segnale GFP, l'attività di RSPO1 come agonista della via Wnt viene testata mediante la quantificazione della linea cellulare reporter Wnt.
      11. Conservare aliquote di 15 mL per l'uso immediato (entro 1 settimana) a 4 °C. Per una conservazione più lunga (6 mesi) mantenere il terreno condizionato a -20 °C.

2. Inizio di una coltura di organoidi per carcinoma ovarico

1. Isolamento di tessuti primari
   1. Trasportare il tessuto fresco e vitale, preferibilmente subito dopo l'intervento chirurgico ed eseguire l'isolamento entro un massimo di 20 ore dal prelievo. Garantire le corrette condizioni di trasporto nel mezzo di raccolta dei tessuti con una scatola di trasporto dotata di impacchi freddi a circa 4 °C.
   2. In laboratorio, preparare i reagenti e le attrezzature necessarie per facilitare l'elaborazione tempestiva dei campioni:
      1. Scongelare la matrice di tipo II dell'estratto di membrana basale (matrice BME 2) su ghiaccio (circa 2 ore).
      2. Preparare bisturi monouso, strumenti di dissezione sterilizzati (forbici e pinzette) e inserti filtranti da 400 μm per provette da 50 ml.
      3. Preparare un contenitore con una piccola quantità di azoto liquido per il congelamento rapido e un bagnomaria preriscaldato a 37 °C.
         NOTA: Lavorare all'interno di una cappa a flusso laminare per colture cellulari.
   3. Lavare accuratamente il tessuto fresco in una capsula di Petri in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (senza Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺). All'interno della capsula di Petri, frammentare il tessuto utilizzando i bisturi monouso e/o le forbici in piccoli pezzi di dimensioni 3-5 mm.
   4. Separare il tessuto ottenuto in tre sezioni per i seguenti scopi:
      1. Raccogliere il tessuto in provette criogeniche. Trasferire le provette criogeniche nel contenitore preparato riempito di azoto liquido per il surgelazione.
      2. Raccogliere il tessuto (2-3 mm) in un contenitore per campioni istologici riempito di formalina per la fissazione (24 h) e incorporarlo in paraffina a scopo di colorazione^19,20.
      3. Inoltre, omogeneizzare il tessuto prima della digestione enzimatica. Massimizzare la dissociazione meccanica con un bisturi e trasferirla in una provetta di tessuto da 50 ml.
         NOTA: Assicurarsi che il tessuto sia sempre imbevuto di PBS durante l'omogeneizzazione per evitare che si secchi il tessuto.
   5. Combinare il tessuto omogeneizzato con una miscela di digestione contenente PBS (senza Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺), collagenasi I (soluzione madre 5 U/μL, concentrazione finale 1 U/μL) e un inibitore selettivo ROCK1 e 2 (concentrazione finale 3 μM) (componenti elencati nella Tabella 1). Utilizzare 15 ml di miscela per la digestione in una provetta da 50 ml per ogni 2 cm³ del tumore.
      NOTA: Il materiale limitato (ad es. campioni bioptici) richiede solo piccole quantità (circa 2-3 ml) di miscela di digestione per garantire la dissociazione enzimatica.
   6. Per la dissociazione enzimatica, incubare la provetta per 1,5 ore a bagnomaria a 37 °C. Condurre vortici sporadici e vigorosi (circa ogni 20 minuti per 10-15 s) per supportare la dissociazione meccanica.
   7. Dopo l'incubazione, aggiungere 15 mL di terreno di coltura basale freddo++ alla provetta. Centrifugare 5 min a 300 × g.
   8. Dopo aver rimosso il surnatante, aggiungere 5 mL di terreno di coltura basale++. Filtrare la sospensione cellulare utilizzando un filtro da 400 μm in una nuova provetta da 50 ml.
   9. Centrifugare per 5 minuti a 300 × g. Rimuovere il surnatante e conservare il pellet cellulare.
   10. Per la rimozione degli eritrociti, aggiungere 5 ml di tampone per la lisi dei globuli rossi (RBC) al pellet cellulare. Incubare a bagnomaria per 5 minuti a 37 °C.
   11. Aggiungere 5 mL di terreno di coltura basale++ per l'inattivazione della lisi. Centrifugare per 5 minuti a 300 × g. Aggiungere 3 mL di terreno di coltura basale++ al pellet cellulare.
   12. Contare le cellule vitali dopo una diluizione 1:1 con una soluzione di colorante blu tripano (ad es. 10 μL del campione + 10 μL di soluzione di colorante blu tripano) in un contatore automatico di cellule o manualmente in una camera Neubauer.
   13. Calcola il numero di celle necessarie per la semina 3D diretta. Per ogni deposito tumorale, seminare in una piastra da 48 pozzetti almeno 2-3 pozzetti per mezzo di carcinoma ovarico, che corrisponde a un totale di 8-12 pozzetti in una matrice di semina (OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß). Calcolare 30.000 cellule per ogni pozzetto in una gocciolina di 25 μL di matrice BME di tipo 2. Facoltativamente, è possibile scegliere un formato a 24 pozzetti con 50 μL di matrice BME 2 e 50.000 cellule seminate per pozzetto.
   14. Inizializzare le celle rimanenti in 2D (vedere il passaggio 2.1.13).
   15. Pipettare la quantità di sospensione di terreno di coltura basale++ che contiene il numero totale di cellule necessarie in una nuova provetta e centrifugare per 5 minuti a 300 × g. Rimuovere il surnatante e conservare il pellet cellulare.
   16. Sul ghiaccio, aggiungere la quantità totale di matrice BME 2 fredda (25 μL per ogni pozzetto in una piastra formato a 48 pozzetti; quindi, 100 μL per 4 pozzetti) al pellet e mescolare bene per ottenere una distribuzione uniforme delle cellule per pozzetto pipettando delicatamente il pellet su e giù senza creare bolle.
   17. Seminare le cellule in goccioline di matrice BME 2 (25 μL) nella piastra vuota e preriscaldata a 48 pozzetti. Per ottenere una distribuzione uniforme tra i pozzetti, muovere delicatamente e lentamente la pipetta su e giù (3-4 volte) all'interno della provetta prima di trasferire la gocciolina della matrice BME 2 in ciascun pozzetto per evitare la precipitazione cellulare durante la distribuzione.
   18. Dopo aver incubato la piastra a 37 °C per almeno 30 minuti per consolidare le goccioline della matrice BME 2, pipettare 250 μL di ciascuno dei quattro terreni per il carcinoma ovarico (OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß) nei pozzetti corrispondenti.
   19. Parallelamente alla procedura di semina 3D diretta, preservare le cellule isolate rimanenti avviando una coltura 2D.
       1. Dopo la centrifugazione per 5 minuti a 300 × g, aggiungere il pellet al terreno 2D. Selezionare il formato (pallone T75 o pallone T25), a seconda del numero di celle disponibili dopo il seeding 3D.
       2. Incubare il matraccio per 3-5 giorni a 37 °C per l'adesione cellulare. Mantenere lo stesso mezzo per le prime 72 ore.
       3. Quando le cellule raggiungono la confluenza, trasferire la coltura nella matrice BME 2. Non espandere gli isolati primari nella coltura 2D dividendoli, poiché la propagazione a lungo termine su 2D è dannosa per il potenziale di staminalità.
2. Trasferimento da cultura 2D a cultura 3D
   1. Nel pallone T75 o T25, lavare il monostrato 2 volte con 5 mL di PBS per staccare le cellule dalla superficie inferiore. Incubare con 1 mL di tripsina per 10 minuti a 37 °C.
   2. Aggiungere 5 mL di terreno di coltura basale freddo++ per l'inattivazione del reagente di dissociazione. Centrifugare per 5 minuti a 300 × g.
   3. Aggiungere 3 mL di terreno di coltura basale++ al pellet. Contare le celle come descritto nei passaggi 2.1.12-2.1.13. Seme per le diverse composizioni dei terreni (cfr. figura 1) come descritto nei passaggi 2.1.16-2.1.18.
3. Valutazione della crescita degli organoidi
   1. Fotografare i pozzetti almeno una volta alla settimana per documentare la crescita degli organoidi. Realizza immagini comparabili di alta qualità di colture 2D/3D e piastre di semina diretta al microscopio a contrasto di fase. Prestare attenzione alla coerenza nell'ingrandimento e utilizzare 4x per una panoramica dei pozzetti (quantificazione) e 10x e 20x per documentare la morfologia degli organoidi.
   2. Organizza l'archiviazione delle immagini in cartelle dedicate alle singole righe.
   3. Selezionare la migliore linea di organoidi per la coltivazione a lungo termine mediante una valutazione comparativa della formazione di organoidi nelle diverse modalità di semina (2D seguita da semina 3D rispetto alla semina 3D diretta) e nelle diverse composizioni dei substrati (OCM1, OCM1+ HER1ß, OCM2 e OCM2+ HER1ß).
      1. In media, 14-21 giorni dopo l'isolamento, valutare il potenziale di formazione di organoidi (quantità), nonché le dimensioni e il fenotipo cellulare degli organoidi cresciuti in diverse condizioni. Cerca le seguenti caratteristiche: assenza di vacuoli, blebbing della membrana o perdita di adesione e arrotondamento delle cellule.

3. Coltivazione di organoidi a lungo termine

1. Passaggio di organoidi
   1. Evitare di scindere gli organoidi troppo frequentemente e durante la fase proliferativa. Eseguire procedure di digestione meccanica ed enzimatica con intervalli superiori a 10 giorni.
   2. Per interrompere ogni gocciolina della matrice BME 2, aggiungere 250 μL (formato a 48 pozzetti) o 500 μL (formato a 24 pozzetti) di terreno di coltura basale ghiacciato++. Assicurarsi che la gocciolina e la pipetta si dissolvano completamente su e giù in modo intermittente e raschiare il fondo della piastra. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL e posizionarla su ghiaccio. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura basale ghiacciato++.
      NOTA: L'efficienza di rimozione della matrice BME 2 dipende fortemente dalla temperatura del fluido, poiché la migliore dissoluzione si ottiene al di sotto di 4 °C.
   3. Pool 2-3 pozzetti tecnici replicati per un'espansione uniforme. Centrifugare per 5 minuti a 300 × g. Ispezionare il contenuto della sospensione rispetto alla fonte di luce per vedere se il gel BME 2 è ancora visibile. Rimuovere il surnatante e ripetere il lavaggio con un mezzo ghiacciato se la matrice BME 2 è ancora visibile.
   4. Incubare con 1 mL di tripsina (conservata a 20-25 °C) a bagnomaria a 37 °C per 7-10 min. Vortice sporadicamente per 10 s per aumentare la dissociazione. Ispezionare periodicamente visivamente il tubo per vedere se la dissociazione sta progredendo.
   5. Tirare la sospensione cellulare su e giù con una siringa attraverso un ago di dimensioni comprese tra 23 G e 27 G. Controllare se sono ancora presenti grumi cellulari di grandi dimensioni e ripetere la procedura se necessario.
      NOTA: La frammentazione attraverso una siringa è facoltativa e la dimensione dell'ago dipende dall'efficacia di dissociazione richiesta. Una sospensione cellulare omogenea porta a una distribuzione uniforme tra i pozzetti.
   6. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura basale freddo++ per inattivare la reazione.
   7. FACOLTATIVO: Contare le celle come descritto nei passaggi 2.1.12-2.1.13 e decidere il rapporto di divisione al passaggio parentale (ad esempio, pozzetti 1:3).
   8. Centrifugare per 5 minuti a 300 × g. Rimuovere il surnatante.
   9. Eseguire la semina come descritto nei passaggi 2.1.16-2.1.18 e applicare il rispettivo terreno organoide ottimale per il cancro ovarico in base alla coltura a lungo termine già stabilita. Cambiare il terreno di mezzo del cancro ovarico ogni 3-4 giorni.
   10. In caso di interruzione della gocciolina della matrice BME 2 durante il cambio del terreno, prendere in considerazione la risemina senza digestione enzimatica. Per evitare l'interruzione della gocciolina, eseguire con attenzione la procedura di cambio del fluido senza pipettaggio diretto sulla gocciolina della matrice BME 2. Inoltre, evitare di lasciare una quantità eccessiva di terreno di coltura basale residuo++ sul pellet prima della diluizione con la matrice BME 2 al punto 2.1.16 in quanto potrebbe influire sulla fragilità delle goccioline.
2. Crioconservazione di organoidi
   NOTA: Eseguire la crioconservazione degli organoidi durante la fase di proliferazione nella prima settimana dopo il passaggio.
   1. Interrompere la gocciolina della matrice BME 2 con terreno di coltura basale ghiacciato++ secondo il passaggio 3.1.2. Dopo la centrifugazione e l'eliminazione del surnatante come descritto al punto 3.1.3., lavorare sul ghiaccio e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno di crioconservazione ghiacciato. Trasferire la sospensione cellulare in provette criogeniche da 1,8 ml preetichettate.
   2. Conservare le provette in un contenitore per congelamento contenente alcol isopropilico preraffreddato e porle a -80 °C per una notte.
   3. Conservare le provette di serie a -80 °C per un massimo di 2 mesi. Trasferimento in azoto liquido per una conservazione stabile a lungo termine.
3. Scongelamento degli stock di organoidi
   1. Preriscaldare 9 mL di terreno di coltura basale++ a bagnomaria a 37 °C in una provetta da 15 mL etichettata.
   2. Trasferire il flaconcino di riserva desiderato dalla conservazione a -80 °C o all'azoto liquido in un contenitore di trasporto riempito di azoto liquido.
   3. Trasferire il criotubo a bagnomaria a 37 °C e agitarlo delicatamente fino a quando il materiale congelato vicino alle pareti del tubo inizia a scongelarsi.
   4. Distribuire lentamente la sospensione di organoidi nella provetta etichettata riempita con 9 ml di terreno. Agitare delicatamente il tubo. Centrifugare per 5 minuti a 300 × g e rimuovere il surnatante.
   5. Eseguire la semina come descritto nelle fasi 2.1.16-2.1.18 e applicare il rispettivo terreno organoide ottimale per il carcinoma ovarico in base alle condizioni di coltura a lungo termine già determinate per la singola linea.
4. Fissazione degli organoidi
   1. Eseguire la raccolta degli organoidi come descritto nei passaggi 3.1.2-3.1.3.
   2. Aggiungere 3 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% in PBS (pH 7,4) e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
   3. Lavare 2 volte con 5 mL di PBS, centrifugare per 3 minuti a 300 × g e rimuovere il surnatante. Aggiungere 4 mL di PBS fresco al pellet e mantenerlo a 4 °C fino all'incorporazione.
      NOTA: Gli organoidi fissi sono stabili e la conservazione a 4 °C è possibile per 1 mese prima dell'inclusione.
   4. Riscaldare il gel istologico (conservato a -20 °C) a 65 °C fino a quando non si liquefa.
   5. Rileva gli organoidi fissi depositati e visibili sul fondo del tubo. Rimuovere il surnatante. In caso di pellet cellulare danneggiato, centrifugare per 3 minuti a 300 × g ed eliminare il PBS surnatante.
   6. Sospendere il pellet in 100 μL di gel caldo pipettando delicatamente verso l'alto e verso il basso. Trasferire la goccia su un pezzo di pellicola sigillante e lasciare che si solidifichi dopo ~15 minuti a temperatura ambiente.
   7. Spostare la gocciolina di gel fissa sulla cassetta di paraffina tissutale. Eseguire protocolli standard di inclusione tissutale^19,20.
   8. Tagliare fette spesse 5-10 μm con un utensile da taglio per microsezionamento. Trasferire i tagli sui vetrini istologici. Asciugare i vetrini per 1 h a 65 °C; Conservali in un luogo asciutto.
5. Colorazione in immunofluorescenza di sezioni di organoidi
   1. Spostare i vetrini preparati attraverso vassoi di vetro con la seguente serie di diluizione: 2 x 15 min di agente di pulizia per istologia; 15 min 100% etanolo; 1 min 100% etanolo; 10 min Etanolo al 96%; 5 min etanolo al 70%; 5 min Etanolo al 50%.
   2. Aggiungere PBS e tenere 5 minuti sullo shaker a 100 giri/min. Ripetere il lavaggio 2 volte.
   3. Aggiungere la soluzione di recupero dell'antigene (Tris(idrossimetil)amminometano-acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)-tampone [pH 9,0] o citrato [pH 6,0]) ai vetrini che vengono posti nella camera termostabile. In una vaporiera, tenere il contenitore con i vetrini per 30 minuti, quindi raffreddare a temperatura ambiente.
   4. Ripetere il passaggio 3.5.2.
   5. Trasferire la camera contenente i vetrini per 15 minuti in una soluzione detergente di permeabilizzazione all'1% (in PBS).
   6. Ripetere il passaggio 3.5.2.
   7. Contorna la posizione degli organoidi sui vetrini con una penna di cera immunocolorante per mantenere la gocciolina durante i passaggi successivi.
   8. Aggiungere su ciascun vetrino 100 μL di siero al 10% in un mezzo di diluizione, a seconda della specie dell'anticorpo secondario.
   9. Ripetere il passaggio 3.5.2.
   10. Diluire gli anticorpi primari in un terreno, fino ad ottenere un volume finale di 100 μL. Conservare a 4 °C per almeno 16 ore in un vassoio di incubazione/camera di umidità.
   11. Ripetere il passaggio 3.5.2.
   12. Diluire gli anticorpi secondari in un terreno, ottenendo goccioline da 100 μL, e conservare per 2 ore a temperatura ambiente in un vassoio di incubazione.
   13. Ripetere il passaggio 3.5.2.
   14. Aggiungere la soluzione di controcolorante nucleare DAPI (4',6-diamidina-2-fenilindolo, dicloridrato) diluita in un mezzo di diluizione 1:1.000. Conservare per 10 minuti a temperatura ambiente per l'incubazione.
   15. Ripetere il passaggio 3.5.2.
   16. Aggiungere il mezzo di montaggio e coprire con il vetrino coprioggetti. Fissare i vetrini con smalto trasparente una volta asciutti (indicativamente dopo 8-12 h).
   17. Immagine con un microscopio confocale o un altro microscopio a fluorescenza. Realizza immagini panoramiche e immagini dettagliate delle strutture subcellulari che catturano le principali caratteristiche della morfologia degli organoidi.

Risultati

Dopo la dissociazione iniziale dei tessuti, la filtrazione e il conteggio, le cellule vengono seminate in parallelo direttamente in formato 3D, come spiegato sopra, così come la sospensione nel pallone per una breve espansione 2D. In alcuni casi, l'espansione 2D transitoria influenza positivamente la formazione dell'organoide e la linea a lungo termine viene stabilita con successo attraverso questa via, mentre la semina 3D parallela comparativa può provocare l'arresto della crescita (Figura 1

Discussione

Il protocollo progettato affronta le precedenti sfide del biobanking degli organoidi del cancro ovarico per quanto riguarda la formazione di organoidi e il potenziale di passaggio a lungo termine e garantisce la generazione di linee completamente espandibili dalla maggior parte dei depositi di tumori solidi. Il processo chirurgico di raccolta dei campioni tumorali da utilizzare per la generazione di organoidi ha un impatto significativo sulla resa e sul potenziale di espansione. I campioni di tessuto tumorale possono ess...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 Sterican 26 G	Braun, Melsungen, Germany	4657683
100 Sterican 27 G	Braun, Melsungen, Germany	4657705
293T HA Rspo1-Fc	R&D systems, Minneapolis, USA	3710-001-01	Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111
A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV)	Merck, Darmstadt, Germany	616454
Advanced DMEM/F-12 Medium	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	12634028
Anti-p53 antibody (DO1)	Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA	sc-126
Anti-PAX8 antibody	Proteintech, Manchester, UK	10336-1-AP
B-27 Supplement (50x)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	17504-044
Bottle-top vacuum filter 0.2 µm	Corning, Berlin, Germany	430049
CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2	Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria	661175
CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2	Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria	690160
CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2	Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria	658175
Collagenase I	Thermo Scientific, Waltham, USA	17018029
Costar 48-well Clear TC-treated	Corning, Berlin, Germany	3548
Cryo SFM	PromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, Germany	C-29912
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear	R&D systems, Minneapolis, USA	3533-005-02	Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix  Corning, 356231
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG	Jackson Immuno	715-175-151
DAKO  Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	C9999-1000ML
DAPI	Thermo Scientific, Waltham, USA	62248
Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555	Thermo Scientific, Waltham, USA	A32794
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488	Thermo Scientific, Waltham, USA	A32814
Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	14190-094
Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel	Thermo Scientific, Waltham, USA	Epredia HG-4000-012
Falcon 24-well Polystyrene	Corning, Berlin, Germany	351447
Feather scalpel	Pfm medical, Cologne, Germany	200130010
Fetal Bovine Serum	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	10270106
Formalin 37% acid free, stabilized	Morphisto, Offenbach am Main, Germany	1019205000
GlutaMAX	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	35050038
HEPES (1 M)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	156630080
Human EpCAM/TROP-1 Antibody	R&D systems, Minneapolis, USA	AF960
Human FGF10	Peprotech, NJ, USA	100-26
Human recombinant BMP2	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	PHC7146
Human recombinant EGF	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	PHG0311L
Human recombinant Heregulin beta-1	Peprotech, NJ, USA	100-03
LAS X core Software	Leica Microsystems		https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/
Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal Microscope	Leica Microsystems
N-2 Supplement (100x)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	17502-048
Nicotinamide	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	N0636
Omnifix 1 mL	Braun, Melsungen, Germany	3570519
Paraffin
Parafilm	Omnilab, Munich, Germany	5170002
Paraformaldehyd	Morphisto, Offenbach am Main, Germany	1176201000
Pen Strep	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	15140-122
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	P4333-100
PluriStrainer 400 µm	PluriSelect, Leipzig, Germany	43-50400-01
Primocin	InvivoGen, Toulouse, France	ant-pm-05
Red Blood Cell Lysing Buffer	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	11814389001
Roticlear	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	A538.5
Surgipath Paraplast	Leica, Wetzlar, Germany	39602012
Thermo Scientific Nunc Cryovials	Thermo Scientific, Waltham, USA	375418PK
Triton X-100	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	T8787
Trypan Blue Stain	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	T8154
TrypLE Express Enzyme	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	12604-013
Tween-20	PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany	A4974-0100
Y-27632	TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany	1254
Zeocin	Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA	R25001