تشريح ، المعالجة النسيجية ، وتحليل التعبير الجيني للأنسجة الدهنية البنية فوق الترقوة

Summary

هنا ، نقدم إجراء عمليا لتشريح وإجراء تحليلات التعبير النسيجي والجيني للأنسجة الدهنية البنية فوق الترقوة.

Abstract

يلعب التوليد الحراري بوساطة الأنسجة الدهنية البنية (BAT) دورا مهما في تنظيم عملية التمثيل الغذائي ، ويمكن أن يتأثر مورفولوجيته ووظيفته بشكل كبير بالمحفزات البيئية في الفئران والبشر. حاليا ، BAT بين كتفي الفئران (iBAT) ، والذي يقع بين اثنين من الكتفين في الجناح الظهري العلوي للفئران ، هو مستودع BAT الرئيسي الذي تستخدمه مختبرات الأبحاث لدراسة وظيفة BAT. في الآونة الأخيرة ، تم تحديد عدد قليل من مستودعات BAT غير المعروفة سابقا في الفئران ، بما في ذلك واحد مشابه للأنسجة الدهنية البنية فوق الترقوة البشرية. على عكس iBAT ، يقع النسيج الدهني البني فوق الترقوة (scBAT) في الطبقة المتوسطة من الرقبة وبالتالي لا يمكن الوصول إليه بسهولة.

لتسهيل دراسة scBAT للفأر الذي تم تحديده حديثا ، يظهر هنا بروتوكول يوضح بالتفصيل خطوات تشريح scBAT سليمة من الفئران بعد الولادة والبالغين. نظرا لصغر حجم scBAT بالنسبة إلى المستودعات الدهنية الأخرى ، فقد تم تعديل الإجراءات وتحسينها خصيصا لمعالجة scBAT. من بين هذه التعديلات استخدام مجهر تشريح أثناء جمع الأنسجة لزيادة دقة وتجانس عينات scBAT المجمدة لرفع كفاءة تحليل qPCR اللاحق. باستخدام هذه التحسينات ، يمكن تحديد المظهر المورفولوجي والتوصيف الجزيئي ل scBAT في الفئران.

Introduction

أثار الانتشار المتزايد للسمنة في الولايات المتحدة وجميع أنحاء العالم اهتماما كبيرا بفهم مسبباتها وتحديد العلاجات المحتملة ^1,2. تلعب الأنسجة الدهنية دورا حيويا في عملية التمثيل الغذائي ، ويمكن أن يؤدي عدم تنظيم الأنسجة الدهنية إلى تطور السمنة. بشكل عام ، هناك نوعان من الأنسجة الدهنية ، الأنسجة الدهنية البيضاء والبنية. في حين أن الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT) يمكنها تخزين الطاقة الكيميائية وإفراز عوامل الغدد الصماء ، يمكن للأنسجة الدهنية البنية (BAT) استخدام الطاقة الكيميائية لتوليد الحرارة والحفاظ على درجة حرارة الجسم في البرد ^3,4. بسبب هذه القدرة الفريد....

Protocol

تمت الموافقة على إجراءات من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية في كلية بايلور للطب. تم تنفيذ جميع الإجراءات على الفئران الذكور C57BL / 6J الذين تتراوح أعمارهم بين 3 أسابيع و 3 أشهر من العمر. قبل التشريح ، تم القتل الرحيم لجميع الفئران باستخدام إجراء القتل الرحيم لثاني أكسيد الكربون القوارض المعتمد. راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. تشريح scBAT

1. ضع جثة الفأر على طاولة العمل ونظف المقص الجراحي والملقط النقطي الدقيق بنسبة 70٪ من الإيثانول.
2. رش الرقبة البطنية للفأر بنسبة 70٪ من الإيثانول لتبليل الفراء وتقليل تلوث الفراء.
3. قم بعمل....

النتائج

على عكس iBAT ، الذي يقع في الطبقة تحت الجلد من الظهر بين كتفين ، يقع scBAT في الطبقة المتوسطة من الرقبة ، ويمتد بعمق بين طبقات العضلات الهيكلية والغدة اللعابية أثناء نموها على طول الوريد الوداجي الخارجي (الشكل 1 أ). تشريح scBAT ليس سهلا مثل iBAT. هنا ، نقدم إجراء مفصل?.......

Discussion

في هذا البروتوكول ، نقدم بالتفصيل إجراءات تشريح ومعالجة scBAT لتحليلات H& E والتعبير الجيني. نظرا لأن scBAT موجود في الطبقة المتوسطة من الرقبة ويقع على طول الأوردة الكبيرة ، فإن عزل هذا المستودع يتطلب تقنية دقيقة. على وجه التحديد ، للحصول على رؤية واضحة للمستودع ، نوصي بوضع الماوس تحت مجهر تشريح .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
95% Dehydrant Alcohol (Flex 95)	Epredia	8201
100% Dehydrant Alcohol (Flex 100)	Epredia	8101
96-well PCR plate	Bio-Rad	MLL9601
Aurum Binding Mini Column	Bio-Rad	7326826
Aurum High Stringency Wash	Bio-Rad	7326803
Aurum Low Stringency Wash	Bio-Rad	7326804
Base Molds (for embedding)	Tissue-Tek	4122
BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2"	Becton Dickinson	305167
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad	1840148
Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL	Fisherbrand	02-681-453
Centrifuge	Eppendorf	5430R
CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument	Bio-Rad	12011319
Chloroform	Thermo Scientific Chemicals	383760010
Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium	Epredia	83104
DEPC-Treated Water	Ambion	AM 9906
Dissecting Microscope	Nikon	SMZ1500
DNase Dilution Solution	Bio-Rad	7326805
DNase I	Bio-Rad	7326828
dNTPs	Invitrogen	18427013
Elution solution	Bio-Rad	7326801
EM 400 embedding medium paraffin	Leica Biosystems	3801320
Eosin Y (0.5% w/v)	RICCA	2858-16
Formula R Infiltration medium paraffin	Leica Biosystems	3801470
Genemark Nutator Gyromixer 349	Bio Express	S-3200-2
Gill #3 Hematoxylin	Sigma-Aldrich	GHS332-1L
HCl (for HCL-Ethanol)	Fisher Chemical	A142212
IP VI Embedding Cassettes	Leica Biosystems	39LC-550-5-L
Koptec's Pure Ethanol - 200 Proof (for 70% Ethanol)	Decon Labs	V1001
MgCl2 (25 mM)	Thermo Fisher Scientific	R0971
Microcentrifuge Tubes 1.7 mL	Avantor	87003-294
Microseal 'B' Seals (adhseive seals)	Bio-Rad	MSB1001
Microtome	Leica Biosystems	RM2245
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CM
Mortar Coors Tek	Thomas Scientific	60310
NaCl (for 0.85% saline)	Fisher Bioreagents	BP358-212
NanoDrop Spectrophotometer	NanoDrop Technologies	ND-1000 UV/Vis
Oligo dT	Invitrogen	18418020
Paraffin Section Flotation Bath	Boekel Scientific	14792V
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148-500G
PCR Tube Strip	Avantor	76318-802
Pestle by Coors Tek	Thomas Scientific	60311
Pestle Pellet Motor	Kimble	749540-0000
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Precision Model 19 Vacuum Oven	Thermo Fisher Scientific	CAT# 51221162
Primer: 36B4  (forward) 10 μM 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’			Chen lab Oligo database
Primer: 36B4 (reverse) 10 μM 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (forward) 10 μM 5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM 5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM 5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM 5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’			Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (forward) 10 μM 5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’			Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (reserve) 10 μM 5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (forward) 10 μM 5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM 5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’			Chen lab Oligo database
RNA isolation solution (PureZol)	Bio-Rad	7326880
RNase Away (surface decontaminant)	Thermo Scientific	1437535
RNase H	NEB	M0297S
Rnase inhibitor (RNase Out)	Invitrogen	10777019
Scintillation Vial (glass)	Electron Microscopy Sciences	72632
Slide drying bench	Electrothermal (Cole-Parmer)	MH6616
Stainless staining rack	Electron Microscopy Sciences	70312-54
Stereo microscope (for embedding)	Olympus	SZ51
Sugical scissors	McKesson	43-1-104
Superfine point Straight Dissecting Forceps	Avantor	82027-402
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT)	Invitrogen	18080044
SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL	Terumo	100281
SYBR Green (qPCR enzyme master mixture)	Applied Biosystems	A25778
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars)	Electron Microscopy Sciences	SKU: 62540-01
Toluene	Fisher Chemical	T324-1
Transfer pipette	Avantor	414004-005
Xylene	Fisher Chemical	X3P-1GAL