Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم إجراء عمليا لتشريح وإجراء تحليلات التعبير النسيجي والجيني للأنسجة الدهنية البنية فوق الترقوة.

Abstract

يلعب التوليد الحراري بوساطة الأنسجة الدهنية البنية (BAT) دورا مهما في تنظيم عملية التمثيل الغذائي ، ويمكن أن يتأثر مورفولوجيته ووظيفته بشكل كبير بالمحفزات البيئية في الفئران والبشر. حاليا ، BAT بين كتفي الفئران (iBAT) ، والذي يقع بين اثنين من الكتفين في الجناح الظهري العلوي للفئران ، هو مستودع BAT الرئيسي الذي تستخدمه مختبرات الأبحاث لدراسة وظيفة BAT. في الآونة الأخيرة ، تم تحديد عدد قليل من مستودعات BAT غير المعروفة سابقا في الفئران ، بما في ذلك واحد مشابه للأنسجة الدهنية البنية فوق الترقوة البشرية. على عكس iBAT ، يقع النسيج الدهني البني فوق الترقوة (scBAT) في الطبقة المتوسطة من الرقبة وبالتالي لا يمكن الوصول إليه بسهولة.

لتسهيل دراسة scBAT للفأر الذي تم تحديده حديثا ، يظهر هنا بروتوكول يوضح بالتفصيل خطوات تشريح scBAT سليمة من الفئران بعد الولادة والبالغين. نظرا لصغر حجم scBAT بالنسبة إلى المستودعات الدهنية الأخرى ، فقد تم تعديل الإجراءات وتحسينها خصيصا لمعالجة scBAT. من بين هذه التعديلات استخدام مجهر تشريح أثناء جمع الأنسجة لزيادة دقة وتجانس عينات scBAT المجمدة لرفع كفاءة تحليل qPCR اللاحق. باستخدام هذه التحسينات ، يمكن تحديد المظهر المورفولوجي والتوصيف الجزيئي ل scBAT في الفئران.

Introduction

أثار الانتشار المتزايد للسمنة في الولايات المتحدة وجميع أنحاء العالم اهتماما كبيرا بفهم مسبباتها وتحديد العلاجات المحتملة 1,2. تلعب الأنسجة الدهنية دورا حيويا في عملية التمثيل الغذائي ، ويمكن أن يؤدي عدم تنظيم الأنسجة الدهنية إلى تطور السمنة. بشكل عام ، هناك نوعان من الأنسجة الدهنية ، الأنسجة الدهنية البيضاء والبنية. في حين أن الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT) يمكنها تخزين الطاقة الكيميائية وإفراز عوامل الغدد الصماء ، يمكن للأنسجة الدهنية البنية (BAT) استخدام الطاقة الكيميائية لتوليد الحرارة والحفاظ على درجة حرارة الجسم في البرد 3,4. بسبب هذه القدرة الفريدة ، يمكن أن يؤدي تنشيط BAT أيضا إلى زيادة نفقات الطاقة وتحسين حساسية الأنسولين5.

تمارس BAT وظيفتها من خلال توليد الحرارة غير المرتعش ، وهي عملية بوساطة فصل البروتين 1 (UCP1) 6. تمتلك الثدييات ، بما في ذلك الفئران والبشر ، كميات متفاوتة من BAT. وجهة النظر الكلاسيكية ل BAT هي أن هذه الأنسجة الدهنية أكثر وفرة في الفئران والرضع من البشر البالغين. iBAT ، الموجود في الجناح الظهري العلوي بين الكتف ، هو مستودع BAT الأكثر دراسة في الفئران. من خلال تطبيق التصوير بالنظائر المشعة واختبارات الخزعة ، حددت الدراسات الحديثة العديد من مستودعات BAT في البشر البالغين. بعضها ، بما في ذلك المستودعات الموجودة في الرقبة العميقة والمنطقة فوق الترقوة ، لم يتم تحديدها من قبل في الفئران أو غيرها من النموذجية7،8،9،10،11. من بين مستودعات BAT هذه ، يعد scBAT هو المستودع الأكثر شيوعا في البشر البالغين. لفهم الأصل والمساهمة الجزيئية لهذه المستودعات التي تم العثور عليها حديثا في البشر بشكل أفضل ، من الضروري تحديد المستودعات المكافئة في الفئران التي تسمح للتلاعب الجيني والجزيئي بتتبع واختبار الدور الوظيفي لهذه المستودعات. وهكذا ، حددنا نحن وآخرون عددا قليلا من مستودعات BAT غير المعروفة سابقا في مواقع تشريحية مختلفة في الفئران ، بما في ذلك scBAT12,13 ، BAT حول الأوعية الصدرية14,15 ، BAT حول الكلى 16 ، و BAT17 حول الأبهر. يشبه الفأر scBAT تشريحيا scBAT البشري ويشبه شكليا iBAT الكلاسيكي ، معبرا عن مستويات عالية من UCP112.

على عكس iBAT للفأر ، والذي يمكن تشريحه بسهولة ، يقع scBAT في الطبقة المتوسطة من عنق الفأر ، أسفل الغدد اللعابية وعلى طول الوريد الوداجي الخارجي. قد يكون عزل هذا المستودع للتحليلات النسيجية والجزيئية أمرا صعبا. هنا ، نصف بالتفصيل الإجراء الخاص بتشريح scBAT من الفئران بعد الولادة والبالغين ومعالجة هذا المستودع لتحليل الأنسجة والتعبير الجيني.

Protocol

تمت الموافقة على إجراءات من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية في كلية بايلور للطب. تم تنفيذ جميع الإجراءات على الفئران الذكور C57BL / 6J الذين تتراوح أعمارهم بين 3 أسابيع و 3 أشهر من العمر. قبل التشريح ، تم القتل الرحيم لجميع الفئران باستخدام إجراء القتل الرحيم لثاني أكسيد الكربون القوارض المعتمد. راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. تشريح scBAT

  1. ضع جثة الفأر على طاولة العمل ونظف المقص الجراحي والملقط النقطي الدقيق بنسبة 70٪ من الإيثانول.
  2. رش الرقبة البطنية للفأر بنسبة 70٪ من الإيثانول لتبليل الفراء وتقليل تلوث الفراء.
  3. قم بعمل شق ثنائي ، حوالي 1.5 سم ، على طول الترقوة.
  4. من نهايات الشق السابق ، قطع طوليا نحو الأذنين ، بطول حوالي 1 سم. سيشكل هذا شقا مربعا على شكل حرف U حول الرقبة (الشكل 1 أ ، ب).
    ملاحظة: يقع scBAT في الطبقة المتوسطة من الرقبة. تتعرض الطبقة السطحية ، المكونة من الجلد والأنسجة الدهنية تحت الجلد والغدد اللعابية ، خلال هذه الخطوة. تحتوي الطبقة الوسيطة ، جنبا إلى جنب مع scBAT ، على الأوردة الوداجية وعضلات الرقبة. يتم الكشف عن الطبقة العميقة من الرقبة ، التي تحتوي على BAT عميق للرقبة والشريان والأوردة الوداجية ، عن طريق إزالة العضلات الهيكلية.
  5. ضع الماوس تحت مجهر تشريح وركز على الرقبة المكشوفة (الشكل 1C).
    ملاحظة: هذه الخطوة المضافة تزيد بشكل كبير من دقة جمع الأنسجة ، وهو أمر ضروري نظرا لصغر حجم scBAT.
  6. كشف الغدد اللعابية بالكامل عن طريق رفع أقسام الجلد المقطوعة بعيدا بالملقط.
  7. باستخدام المقص الجراحي والملقط ، افصل الأنسجة التي تربط الغدد اللعابية بالأنسجة المحيطة بالترقوة وببعضها البعض.
  8. فضح مستودعات scBAT عن طريق رفع الغدد اللعابية. ابحث عن BAT على طول الوريد الوداجي الخارجي وربما متصل بالجانب السفلي من الغدد اللعابية. تعرفه على لونه البرتقالي ، الذي يبرز ضد الأنسجة المحيطة.
  9. امسك الأنسجة الدهنية المستهدفة بالملقط وقشرها برفق بعيدا عن الغدد اللعابية.
  10. بمجرد فصله عن الغدد اللعابية ، استمر في فصل scBAT عن الوريد الوداجي الخارجي وعضلات الرقبة حتى يمكن إزالة المستودعات الموجودة على جانبي الرقبة بالكامل.
  11. افحص كل عينة من عينات scBAT المشرحة تحت مجهر التشريح (الشكل 1D ، E) ، باستخدام ملقط لإزالة أي نسيج ضام متبقي.
  12. ضع كل عينة في قنينة تلألؤ زجاجية تحتوي على 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وأخرج الماوس من تحت المجهر.

2. معالجة وتلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) ل scBAT (موضح في الشكل 2 أ)

  1. استبدل PBS (الخطوة 1.12) ب 10 مل من بارافورمالدهايد البارد 4٪ (PFA) وضع القارورة على نوتور ، وتأرجح عند 4 درجات مئوية طوال الليل لإصلاح scBAT.
    ملاحظة: يمكن تطبيق تثبيت التروية في مرحلة ما بعد الولادة ، وخاصة الفئران البالغة ، عند الحاجة إلى مزيد من المعالجة لتحليل الكيمياء الهيستولوجية المناعية.
  2. في اليوم التالي ، قم بإزالة محلول PFA من القارورة باستخدام ماصة نقل معقمة واستبدلها ب 10-15 مل من PBS. ضع القارورة على نوتور وصخرة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استبدل PBS بمحلول ملحي 0.85٪ واستمر في التأرجح لمدة 30 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: المحلول الملحي هو 0.85٪ محلول ملحي (NaCl) بدون وزن / فولت في المياه المعالجة ب DEPC (خالية من RNase). يمكن استبدال PBS بالمحلول الملحي في هذه الخطوة والخطوة التالية.
  3. قم بإزالة محلول ملحي 0.85٪ باستخدام ماصة نقل وأضف 10 مل من 70٪ إيثانول / 0.85٪ محلول ملحي إلى القارورة. خزن القارورة في ثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل أو حتى تصبح جاهزة لتضمين البارافين.
    ملاحظة: يمكن استخدام PBS في حالة عدم توفر 0.85٪ محلول ملحي. يجب معالجة scBAT في أقرب وقت ممكن لتسهيل التقسيم والحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة بشكل أفضل.
  4. قبل تضمين البارافين ، قم بتجفيف scBAT من خلال سلسلة من عمليات تبادل الإيثانول لإزالة الماء من الأنسجة.
    1. للبدء ، قم بإزالة 70٪ إيثانول / 0.85٪ محلول ملحي من القارورة باستخدام ماصة نقل وأضف 10-15 مل من 95٪ كحول مجفف ، مع هز القارورة على مغذي في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
      ملاحظة: يمكن استخدام الإيثانول بدلا من محاليل الكحول المجففة.
    2. بعد ذلك ، استبدل 95٪ كحول مجفف ب 10-15 مل من الكحول المجفف بنسبة 100٪ واستمر في التأرجح على مغذي لمدة 1 ساعة. أعد ملء الكحول المجفف الجديد بنسبة 100٪ واستمر في الصخور لعدة ساعات أو طوال الليل ، اعتمادا على كمية scBAT في القارورة.
  5. لإزالة scBAT للتضمين ، أضف 10 مل من التولوين إلى القارورة واستمر في التأرجح على المغذي حتى يصبح scBAT شفافا ، حوالي 6-8 ساعات.
    ملاحظة: تعتمد المدة الزمنية اللازمة لتحقيق المقاصة المرضية على حجم scBAT. يوصى بالبدء في التطهير فورا في الصباح حتى يمكن التسلل والتضمين في فترة ما بعد الظهر.
  6. لتضمين scBAT في شمع البارافين ، قم بإزالة التولوين وإضافة 10 مل من شمع البارافين المذاب إلى القارورة. ضع القارورة في فرن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. كرر هذه الخطوة مع الشمع الجديد.
    ملاحظة: ابدأ في إذابة كريات الشمع في الفرن طوال الليل قبل أن يبدأ التضمين للتأكد من أن الشمع سائل بالكامل.
  7. استبدل شمع البارافين التسلل بشمع البارافين المضمن وضع القارورة في نفس درجة الحرارة لمدة 1 ساعة. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
    ملاحظة: يمكن مقاطعة مرحلة التسلل ومتابعتها لاحقا. أخرج القارورة من الفرن واحفظها في درجة حرارة الغرفة حتى تصبح جاهزة للمتابعة.
  8. قم بتضمين الأنسجة عن طريق وضعها أولا في قالب تضمين الأنسجة ، وإضافة شمع التضمين المذاب إلى القالب ، وإعادة توجيه الأنسجة تحت المجهر المجسم. بعد ذلك ، ضع شريط تضمين أعلى الشمع واستمر في صب شمع التضمين فوقه حتى يمتلئ ويتم تثبيت غطاء التضمين على كتلة الشمع. انقل الكتلة إلى ثلاجة 4 درجات مئوية طوال الليل للسماح للشمع بالتصلب والانكماش قبل إزالة القالب المعدني.
  9. قسم scBAT بميكروتوم بسمك 5-6 ميكرومتر18 ، ثلاثة إلى أربعة أقسام لكل شريحة مجهر ، وضعه في حمام طفو قسم البارافين الدافئ عند ~ 42 °C للسماح لأقسام الأنسجة بالتنعيم.
  10. انقل الأقسام إلى الشرائح وضع الشرائح في وضع مستقيم مقابل حمام الطفو للسماح للماء بالتنقيط من الشرائح.
  11. انقل الشرائح إلى رف تلطيخ غير قابل للصدأ وضع الرف على مقعد تجفيف منزلق حتى يجف طوال الليل.
    ملاحظة: يمكن تخزين شرائح البارافين على المدى الطويل في درجة حرارة الغرفة قبل تحقيق مزيد من المعالجة.
  12. أداء تلطيخ H& E19. للبدء ، ضع الشرائح في رف تلطيخ ، ثم ضع الرف في جرة تلطيخ مع الزيلين لمدة 40 ثانية. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
    ملاحظة: إذا كان البارافين لا يزال مرئيا بعد المرحلتين ، فانتظر حتى يذوب تماما قبل المتابعة.
  13. لإعادة ترطيب الأنسجة ، ضع رف الشرائح في وعاء ملطخ مملوء بالكحول المجفف بنسبة 100٪ لمدة مرحلتين مدة كل منهما 20 ثانية ، تليها مرحلة 15 ثانية في 95٪ كحول مجفف ، وشطف نهائي لمدة 15 ثانية في ddH2O.
  14. ضع الشرائح في طبق تلطيخ مملوء بمحلول الهيماتوكسيلين لمدة 75 ثانية لتحقيق تلطيخ نووي ، ثم اشطف الشرائح في طبق تلطيخ مع ddH2O لمدة 45 ثانية.
    ملاحظة: يمكن ضبط الوقت حسب لون البقعة المطلوب.
  15. قم بتمييز التلوين عن طريق غمس الشرائح في طبق تلطيخ مملوء بمحلول HCl-ethanol لمدة 15 ثانية ، ثم انقل الشرائح إلى شطف ddH2O آخر لمدة 15 ثانية.
    ملاحظة: يتم تحضير محلول حمض الهيدروكلوريك والإيثانول وفقا للطريقة المنشورة19.
  16. للتلطيخ السيتوبلازمي ، ضع الشريحة في محلول Eosin Y لمدة 15 ثانية.
  17. قم بتجفيف الأنسجة عن طريق غمس الشرائح لمدة 15 ثانية لكل منها في ثلاث مراحل متتالية من محلول الكحول المجفف بنسبة 95٪ ، ثم حمامين متتاليين من الكحول المجفف بنسبة 100٪ - الأول لمدة 15 ثانية والثاني لمدة 45 ثانية - لإنهاء الجفاف.
  18. أخيرا ، انقل الشرائح إلى حمام الزيلين لمدة 45 ثانية لإعادة تأقلم الأنسجة مع المذيبات العضوية. بعد هذه الخطوة ، يتم الانتهاء من تلطيخ. إزالة الأنسجة من الحل.
  19. ضع وسيط التثبيت على كل شريحة وقم بتغطيتها داخل غطاء دخان كيميائي. جفف طوال الليل قبل التصوير. تظهر نتائج التصوير في الشكل 2 ب.

3. تحليل التعبير الجيني ل scBAT

  1. جمع الأنسجة (طحن)
    1. بعد تشريح scBAT ، ضع الأنسجة على الفور في أنبوب طرد مركزي دقيق ، وقم بعمل ثقب في الجزء العلوي من الأنبوب بإبرة معقمة ، وقم بتجميده في النيتروجين السائل.
      ملاحظة: الخطوات الرئيسية للبروتوكول الموضحة هنا موضحة في الشكل 3A. يؤدي إحداث ثقب في الجزء العلوي من الأنبوب قبل إسقاطه في النيتروجين السائل إلى منع الأنبوب من الانفجار بسبب تغير الضغط المفاجئ.
    2. املأ دورق بلاستيكي بالنيتروجين السائل واترك ملعقة مدقة ورقيقة لينقع.
      ملاحظة: من المهم الحفاظ على درجة حرارة جميع الأدوات وعينات الأنسجة باردة قدر الإمكان ، بالقرب من درجة حرارة النيتروجين السائل ، أثناء الإجراء بأكمله لمنع ذوبان الأنسجة. الأنسجة الدهنية المذابة شديدة الالتصاق وتجعل المسحوق أكثر صعوبة. قم فقط بإزالة الأدوات والعينات من حمامات النيتروجين السائل مباشرة قبل الاستخدام.
    3. خذ عينة واحدة من الأنسجة المجمدة في كل مرة واسكبها من أنبوب الطرد المركزي الدقيق في الهاون.
    4. أضف كمية صغيرة من النيتروجين السائل إلى الهاون ، ثم استخدم المدقة لطحن الأنسجة المجمدة حتى يتم سحقها تماما.
      ملاحظة: إذا بدأت الأنسجة تصبح ناعمة أو لزجة في أي وقت ، فهي تذوب. صب المزيد من النيتروجين السائل في الهاون.
    5. استخدم الملعقة الرفيعة لكشط الأنسجة المسحوقة ونقلها بعناية إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. صب النيتروجين السائل في الهاون أثناء الكشط لجمع أجزاء الأنسجة المتبقية قبل نقلها باستخدام ملعقة. كرر خطوات النقل حتى تتم إزالة جميع الأنسجة من الهاون.
    6. نظف الملاط باستخدام ممسحة مناديل خفيفة و 70٪ إيثانول قبل تفريغ العينة التالية للطحن. قم بتخزين المناديل المسحوقة في فريزر -80 درجة مئوية على المدى الطويل.
  2. عزل الحمض النووي الريبي الكلي
    1. اعداد
      1. نظف طاولة العمل والماصات وحوامل الأطراف ورفوف الأنابيب باستخدام كل من الإيثانول بنسبة 70٪ ومطهر السطح لإزالة RNase.
      2. قم بتشغيل آلة الطرد المركزي للوصول إلى 4 درجات مئوية.
      3. قم بتسخين محلول الشطف إلى 70 درجة مئوية.
      4. قم بتخفيف DNase I عن طريق خلط 5 ميكرولتر من DNase I المعاد تكوينه مع 75 ميكرولتر من محلول تخفيف DNase لكل عينة. ضع محلول DNase I على الثلج حتى الاستخدام.
    2. إجراء
      1. لكل عينة ، قم بتسمية أنبوبي طرد مركزي دقيق ، وأنبوبين ممسكين بالعمود (أنبوبان للطرد المركزي متدرج بدون غطاء) ، وعمود صغير ملزم واحد.
      2. أضف 500 ميكرولتر من محلول عزل الحمض النووي الريبي إلى كل عينة وصوتنة باستخدام محرك مدقة الحبيبات لمدة 30 ثانية.
      3. احصل على حقنة لكل عينة وماصة لأعلى ولأسفل 10x لمزيد من تحلل الأنسجة. تأكد من عدم ظهور أي مواد صلبة بعد الحقن.
      4. أضف 250 ميكرولتر من الكلوروفورم والدوامة من حين لآخر أثناء الانتظار لمدة 5 دقائق حتى يتم احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة.
      5. جهاز طرد مركزي عند 21000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      6. انقل الجزء المائي العلوي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وأضف كمية مكافئة من الإيثانول بنسبة 70٪ (~ 500 ميكرولتر).
        ملاحظة: يجب أن يكون الجزء المائي العلوي واضحا ، ويجب أن يكون الجزء السفلي هو محلول عزل الحمض النووي الريبي الأحمر ، وبين الطبقتين يجب أن تكون بعض المواد الصلبة غير المرغوب فيها.
      7. نقل 500 ميكرولتر من المحللة الجديدة إلى عمود الربط. جهاز طرد مركزي عند 18000 × جم لمدة 60 ثانية ثم تخلص من المرشح.
      8. كرر الخطوة السابقة مع المحللة المتبقية للحصول على كل الحمض النووي الريبي في عمود الربط.
      9. أضف 700 ميكرولتر من الغسيل منخفض الصلابة إلى عمود الربط ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية ، وتخلص من الترشيح.
      10. أضف 80 ميكرولتر من DNase I المخفف إلى كل عمود ربط. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      11. أضف 700 ميكرولتر من الغسيل عالي الصرامة ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية ، وتخلص من الترشيح.
      12. أضف 700 ميكرولتر من الغسيل منخفض الصلابة ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 60 ثانية ، وتخلص من المرشح.
      13. انقل أعمدة الربط إلى الأنبوب الثاني الجديد القابض للعمود بدون غطاء وأجهزة الطرد المركزي لمدة دقيقتين لضمان إزالة جميع السوائل من عمود الربط.
      14. انقل أعمدة الربط إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وأضف 30 ميكرولتر من محلول الشطف الدافئ. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.
      15. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة لجمع الحمض النووي الريبي الملتوي في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
      16. قياس تركيز الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
        ملاحظة: إذا كان إجمالي نقاء الحمض النووي الريبي منخفضا ، يشار إليه بقيمة 260/280 أقل من 2.0 أو 260/230 قيمة أقل من 1.8 ، ثم بعد الخطوة 3.2.2.12 ، يمكن غسل العينات مرة أخرى بغسل منخفض الصرامة متبوعا بغسلها بنسبة 80٪ من الإيثانول قبل الاستمرار في الخطوة 3.2.2.13.
      17. قم بتخزين الحمض النووي الريبي في فريزر -80 درجة مئوية.
    3. النسخ العكسي (RT)
      1. في شريط أنبوب PCR ، أضف 0.5-1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي المخفف في المياه المعالجة ب DEPC إلى ما مجموعه 8 ميكرولتر لكل عينة RNA إلى بئر مختلف.
        ملاحظة: يمكن زيادة أو تقليل كمية الحمض النووي الريبي المستخدمة في النسخ العكسي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      2. أضف 1 ميكرولتر Oligo dT و 1 ميكرولتر من dNTPs إلى كل عينة في أنبوب PCR. تأكد من أن الحجم الإجمالي هو 10 ميكرولتر لكل عينة.
      3. ضع شريط أنبوب PCR في جهاز تدوير حراري واضبطه على 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق متبوعا ب 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى.
      4. بعد 5 دقائق عند 65 درجة مئوية ، أخرج شريط أنبوب PCR وضع الأنبوب على الثلج لمدة 2 دقيقة على الأقل. بعد الحضانة على الجليد ، أضف خمسة كواشف: 4 ميكرولتر من 5x العازلة First-Strand ، 2 ميكرولتر من 25 mM MgCl2 ، 2 ميكرولتر من 0.1 M DTT ، 1 ميكرولتر من مثبط RNase ، و 1 ميكرولتر من النسخ العكسي لكل عينة. تأكد من أن الحجم الإجمالي الآن 20 ميكرولتر لكل عينة.
      5. ضع شريط أنبوب PCR مرة أخرى في جهاز التدوير الحراري واضبط البرنامج على 50 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة ، ثم 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى.
      6. بمجرد وصول البرنامج إلى 4 درجات مئوية ، أخرج الشريط وأضف 1 ميكرولتر من ريبونوكلياز H (RNase H).
        ملاحظة: يستخدم RNase H لإزالة أي قالب RNA متبقي في تفاعل RT ؛ من خلال هذه الخطوة ، يجب بالفعل تحويل الحمض النووي الريبي المطلوب إلى cDNA.
      7. ضع الشريط مرة أخرى في جهاز التدوير الحراري وقم بتشغيله 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ثم 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى.
      8. اكتمل النسخ العكسي ؛ قياس تركيز cDNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي
      9. تمييع cDNA إلى 250 نانوغرام / ميكرولتر ؛ قم بتخزين cDNA إما في الفريزر -80 درجة مئوية أو -20 درجة مئوية.
    4. تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)
      1. قم بعمل جدول بيانات لتنظيم موضع كل برايمر وعينة على لوحة qPCR ذات 96 بئرا.
        ملاحظة: يجب أن يكون أحد البادئات جينا مرجعيا لتطبيع التعبير عن جميع الجينات الأخرى ذات الأهمية ، مثل 36B4.
      2. اصنع مزيجا رئيسيا من التمهيدي لكل مجموعة "التمهيدي + العينة". لكل تفاعل qPCR جيدا ، أضف 3 ميكرولتر من الماء بدرجة البيولوجيا الجزيئية ، و 5 ميكرولتر من الخليط الرئيسي لإنزيم qPCR ، و 0.5 ميكرولتر من التمهيدي الأمامي ، و 0.5 ميكرولتر من التمهيدي العكسي ، مما يضيف ما يصل إلى 9 ميكرولتر لكل تفاعل. أضف 1 ميكرولتر من cDNA لكل تفاعل لتكوين إجمالي 10 ميكرولتر لكل تفاعل جيد.
        ملاحظة: المعيار هو أن يكون لديك ثلاث نسخ مكررة تقنية لكل مجموعة "التمهيدي + العينة" ، لذلك يجب أن يكون كل مزيج رئيسي 4x من الكميات المذكورة أعلاه.
      3. أضف 1 ميكرولتر من cDNA لكل نسخة مكررة إلى كل مزيج رئيسي من التمهيدي. إذا كان كل مزيج رئيسي هو 4x ، فقم بسحب 4 ميكرولتر من كل عينة cDNA في الأنبوب المسمى الخاص بها.
      4. أخيرا ، يتم خلط ماصة 10 ميكرولتر من كل تفاعل في لوحة qPCR المكونة من 96 بئرا في المواضع التي يحددها جدول البيانات.
      5. قم بإغلاق اللوحة بختم لاصق سميك ، ثم قم بطرد لوحة 96 بئرا عند 450 × جم عند 20 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
        ملاحظة: من الأهمية بمكان أن تكون اللوحة محكمة الغلق تماما لتجنب تبخر العينات أثناء الدورة الحرارية. استخدم مساحات مناديل خفيفة للضغط على الختم لأسفل على اللوحة ، وخاصة الحواف.
      6. قم بتشغيل اللوحة في أداة PCR في الوقت الفعلي. قم ببرمجة تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة: دقيقتان عند 50 درجة مئوية ، تليها دقيقتان أخريان عند 95 درجة مئوية ، وأخيرا 40 دورة من 15 ثانية عند 95 درجة مئوية و 30 ثانية عند 60 درجة مئوية. تظهر نتائج تحليل التعبير الجيني qPCR في الشكل 3B.

النتائج

على عكس iBAT ، الذي يقع في الطبقة تحت الجلد من الظهر بين كتفين ، يقع scBAT في الطبقة المتوسطة من الرقبة ، ويمتد بعمق بين طبقات العضلات الهيكلية والغدة اللعابية أثناء نموها على طول الوريد الوداجي الخارجي (الشكل 1 أ). تشريح scBAT ليس سهلا مثل iBAT. هنا ، نقدم إجراء مفصل?...

Discussion

في هذا البروتوكول ، نقدم بالتفصيل إجراءات تشريح ومعالجة scBAT لتحليلات H& E والتعبير الجيني. نظرا لأن scBAT موجود في الطبقة المتوسطة من الرقبة ويقع على طول الأوردة الكبيرة ، فإن عزل هذا المستودع يتطلب تقنية دقيقة. على وجه التحديد ، للحصول على رؤية واضحة للمستودع ، نوصي بوضع الماوس تحت مجهر تشريح ...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

يتم دعم هذا العمل من قبل NIDDK من المعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم R01DK116899 ، وزارة الزراعة الأمريكية / ARS تحت رقم الجائزة 3092-51000-064-000D ، وجائزة تجريبية من معهد أبحاث القلب والأوعية الدموية بكلية بايلور للطب. تم إنتاج المخططات الانسيابية باستخدام BioRender.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
95% Dehydrant Alcohol (Flex 95)Epredia8201
100% Dehydrant Alcohol (Flex 100)Epredia8101
96-well PCR plateBio-RadMLL9601
Aurum Binding Mini ColumnBio-Rad7326826
Aurum High Stringency WashBio-Rad7326803
Aurum Low Stringency WashBio-Rad7326804
Base Molds (for embedding)Tissue-Tek4122
BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2"Becton Dickinson305167
C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad1840148
Capless Microcentrifuge Tubes 2 mLFisherbrand02-681-453
Centrifuge Eppendorf5430R
CFX Opus 96 Real-Time PCR InstrumentBio-Rad12011319
ChloroformThermo Scientific Chemicals383760010
Cytoseal 60 Low-viscosity mounting mediumEpredia83104
DEPC-Treated WaterAmbionAM 9906
Dissecting MicroscopeNikonSMZ1500
DNase Dilution SolutionBio-Rad7326805
DNase IBio-Rad7326828
dNTPsInvitrogen18427013
Elution solutionBio-Rad7326801
EM 400 embedding medium paraffinLeica Biosystems3801320
Eosin Y (0.5% w/v)RICCA2858-16
Formula R Infiltration medium paraffinLeica Biosystems3801470
Genemark Nutator Gyromixer 349Bio ExpressS-3200-2
Gill #3 HematoxylinSigma-AldrichGHS332-1L
HCl (for HCL-Ethanol)Fisher ChemicalA142212
IP VI Embedding CassettesLeica Biosystems39LC-550-5-L
Koptec's Pure Ethanol - 200 Proof (for 70% Ethanol)Decon LabsV1001
MgCl2 (25 mM)Thermo Fisher ScientificR0971
Microcentrifuge Tubes 1.7 mLAvantor87003-294
Microseal 'B' Seals (adhseive seals)Bio-RadMSB1001
MicrotomeLeica BiosystemsRM2245
Molecular Biology Grade WaterCorning46-000-CM
Mortar Coors TekThomas Scientific60310
NaCl (for 0.85% saline)Fisher BioreagentsBP358-212
NanoDrop SpectrophotometerNanoDrop TechnologiesND-1000 UV/Vis
Oligo dTInvitrogen18418020
Paraffin Section Flotation BathBoekel Scientific14792V
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-AldrichP6148-500G
PCR Tube StripAvantor76318-802
Pestle by Coors TekThomas Scientific60311
Pestle Pellet MotorKimble749540-0000
Phosphate Buffer Saline (PBS)Sigma-AldrichD8537-500ML
Precision Model 19 Vacuum Oven Thermo Fisher ScientificCAT# 51221162
Primer: 36B4  (forward) 10 μM
5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’		Chen lab Oligo database
Primer: 36B4 (reverse) 10 μM
5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’		Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (forward) 10 μM
5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’		Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM
5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’		Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM
5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’		Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM
5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’		Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (forward) 10 μM
5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’		Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (reserve) 10 μM
5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’		Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM
5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’		Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM
5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’		Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (forward) 10 μM
5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’		Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM
5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’		Chen lab Oligo database
RNA isolation solution (PureZol)Bio-Rad7326880
RNase Away (surface decontaminant)Thermo Scientific1437535
RNase HNEBM0297S
Rnase inhibitor (RNase Out)Invitrogen10777019
Scintillation Vial (glass)Electron Microscopy Sciences72632
Slide drying bench Electrothermal (Cole-Parmer)MH6616
Stainless staining rackElectron Microscopy Sciences70312-54
Stereo microscope (for embedding)OlympusSZ51
Sugical scissorsMcKesson43-1-104
Superfine point Straight Dissecting ForcepsAvantor82027-402
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT) Invitrogen18080044
SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mLTerumo100281
SYBR Green (qPCR enzyme master mixture)Applied BiosystemsA25778
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars)Electron Microscopy SciencesSKU: 62540-01
TolueneFisher ChemicalT324-1
Transfer pipetteAvantor414004-005
XyleneFisher ChemicalX3P-1GAL

References

  1. Boutari, C., Mantzoros, C. S. A 2022 update on the epidemiology of obesity and a call to action: as its twin COVID-19 pandemic appears to be receding, the obesity and dysmetabolism pandemic continues to rage on. Metabolism. 133, 155217 (2022).
  2. Hales, C. M., Carroll, M. D., Fryar, C. D., Ogden, C. L. Prevalence of obesity and severe obesity among adults: United States, 2017-2018. NCHS Data Brief. (360), 1-8 (2020).
  3. Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. The developmental origins of adipose tissue. Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).
  4. Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (11), 691-702 (2016).
  5. Maliszewska, K., Kretowski, A. Brown adipose tissue and its role in insulin and glucose homeostasis. Int J Mol Sci. 22 (4), 1530 (2021).
  6. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
  7. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).
  8. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N Engl J Med. 360 (15), 1500-1508 (2009).
  9. Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N Engl J Med. 360 (15), 1518-1525 (2009).
  10. Cypess, A. M., et al. Anatomical localization, gene expression profiling and functional characterization of adult human neck brown fat. Nat Med. 19 (5), 635-639 (2013).
  11. Leitner, B. P., et al. Mapping of human brown adipose tissue in lean and obese young men. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (32), 8649-8654 (2017).
  12. Mo, Q., et al. Identification and characterization of a supraclavicular brown adipose tissue in mice. JCI Insight. 2 (11), e93166 (2017).
  13. Shi, Y., et al. Gene Expression Analysis of Environmental Temperature and High-Fat Diet-Induced Changes in Mouse Supraclavicular Brown Adipose Tissue. Cells. 10 (6), 1370 (2021).
  14. Chang, L., et al. Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-gamma deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis. Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).
  15. Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cell Mol Life Sci. 76 (4), 777-789 (2019).
  16. de Jong, J. M., Larsson, O., Cannon, B., Nedergaard, J. A stringent validation of mouse adipose tissue identity markers. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (12), E1085-E1105 (2015).
  17. Fu, M., et al. Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 39 (8), 1629-1644 (2019).
  18. Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning mammary gland whole mounts for lesion identification. J Vis Exp. (125), e55796 (2017).
  19. Berry, R., et al. Imaging of adipose tissue. Methods Enzymol. 537, 47-73 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 205

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved