Disección, procesamiento histológico y análisis de expresión génica del tejido adiposo marrón supraclavicular murino

Resumen

Aquí, proporcionamos un procedimiento práctico para diseccionar y realizar análisis histológicos y de expresión génica del tejido adiposo marrón supraclavicular murino.

Resumen

La termogénesis mediada por tejido adiposo marrón (BAT) desempeña un papel importante en la regulación del metabolismo, y su morfología y función pueden verse muy afectadas por los estímulos ambientales en ratones y humanos. En la actualidad, la MTD interescapular murina (iBAT), que se encuentra entre dos escápulas en el flanco dorsal superior de los ratones, es el principal depósito de MTD utilizado por los laboratorios de investigación para estudiar la función de las MTD. Recientemente, se identificaron algunos depósitos de MTD previamente desconocidos en ratones, incluido uno análogo al tejido adiposo marrón supraclavicular humano. A diferencia del iBAT, el tejido adiposo marrón supraclavicular murino (scBAT) está situado en la capa intermedia del cuello y, por lo tanto, no se puede acceder a él tan fácilmente.

Para facilitar el estudio de las scBAT de ratón recién identificadas, se presenta un protocolo que detalla los pasos para diseccionar scBAT intacto de ratones postnatales y adultos. Debido al pequeño tamaño de scBAT en relación con otros depósitos adiposos, los procedimientos se han modificado y optimizado específicamente para el procesamiento de scBAT. Entre estas modificaciones se encuentra el uso de un microscopio de disección durante la recolección de tejidos para aumentar la precisión y homogeneización de las muestras congeladas de scBAT para aumentar la eficiencia del análisis de qPCR posterior. Con estas optimizaciones, se puede determinar la identificación, el aspecto morfológico y la caracterización molecular de la scBAT en ratones.

Introducción

La creciente prevalencia de la obesidad en los Estados Unidos y en todo el mundo ha despertado un gran interés en comprender su etiología e identificar posibles tratamientos ^1,2. El tejido adiposo desempeña un papel vital en el metabolismo, y la desregulación del tejido adiposo puede conducir al desarrollo de obesidad. Generalmente, hay dos tipos de tejidos adiposos, el tejido adiposo blanco y el marrón. Mientras que el tejido adiposo blanco (WAT) puede almacenar energía química y secretar factores endocrinos, el tejido adiposo marrón (BAT) puede utilizar energía química para generar calor y mantener la temper....

Protocolo

Los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de Baylor. Todos los procedimientos se realizaron en ratones machos C57BL/6J de 3 semanas y 3 meses de edad. Antes de la disección, todos los ratones fueron sacrificados utilizando el procedimiento aprobado de eutanasia con dióxido de carbono para roedores. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos e instrumentos utilizados en este protocolo.

1. Disección de scBAT

1. Coloque la carcasa del ratón en el banco de trabajo y limpie....

Discusión

En este protocolo, presentamos en detalle los procedimientos para diseccionar y procesar scBAT para análisis de H&E y expresión génica. Debido a que scBAT reside en la capa intermedia del cuello y se encuentra a lo largo de las venas grandes, el aislamiento de este depósito requiere una técnica precisa. Específicamente, para obtener una visión clara del depósito, recomendamos colocar al ratón bajo un microscopio de disección después de que se haya abierto el cuello. Usando un par de pinzas de punta superfina p.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
95% Dehydrant Alcohol (Flex 95)	Epredia	8201
100% Dehydrant Alcohol (Flex 100)	Epredia	8101
96-well PCR plate	Bio-Rad	MLL9601
Aurum Binding Mini Column	Bio-Rad	7326826
Aurum High Stringency Wash	Bio-Rad	7326803
Aurum Low Stringency Wash	Bio-Rad	7326804
Base Molds (for embedding)	Tissue-Tek	4122
BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2"	Becton Dickinson	305167
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad	1840148
Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL	Fisherbrand	02-681-453
Centrifuge	Eppendorf	5430R
CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument	Bio-Rad	12011319
Chloroform	Thermo Scientific Chemicals	383760010
Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium	Epredia	83104
DEPC-Treated Water	Ambion	AM 9906
Dissecting Microscope	Nikon	SMZ1500
DNase Dilution Solution	Bio-Rad	7326805
DNase I	Bio-Rad	7326828
dNTPs	Invitrogen	18427013
Elution solution	Bio-Rad	7326801
EM 400 embedding medium paraffin	Leica Biosystems	3801320
Eosin Y (0.5% w/v)	RICCA	2858-16
Formula R Infiltration medium paraffin	Leica Biosystems	3801470
Genemark Nutator Gyromixer 349	Bio Express	S-3200-2
Gill #3 Hematoxylin	Sigma-Aldrich	GHS332-1L
HCl (for HCL-Ethanol)	Fisher Chemical	A142212
IP VI Embedding Cassettes	Leica Biosystems	39LC-550-5-L
Koptec's Pure Ethanol - 200 Proof (for 70% Ethanol)	Decon Labs	V1001
MgCl2 (25 mM)	Thermo Fisher Scientific	R0971
Microcentrifuge Tubes 1.7 mL	Avantor	87003-294
Microseal 'B' Seals (adhseive seals)	Bio-Rad	MSB1001
Microtome	Leica Biosystems	RM2245
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CM
Mortar Coors Tek	Thomas Scientific	60310
NaCl (for 0.85% saline)	Fisher Bioreagents	BP358-212
NanoDrop Spectrophotometer	NanoDrop Technologies	ND-1000 UV/Vis
Oligo dT	Invitrogen	18418020
Paraffin Section Flotation Bath	Boekel Scientific	14792V
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148-500G
PCR Tube Strip	Avantor	76318-802
Pestle by Coors Tek	Thomas Scientific	60311
Pestle Pellet Motor	Kimble	749540-0000
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Precision Model 19 Vacuum Oven	Thermo Fisher Scientific	CAT# 51221162
Primer: 36B4  (forward) 10 μM 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’			Chen lab Oligo database
Primer: 36B4 (reverse) 10 μM 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (forward) 10 μM 5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM 5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM 5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM 5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’			Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (forward) 10 μM 5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’			Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (reserve) 10 μM 5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (forward) 10 μM 5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM 5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’			Chen lab Oligo database
RNA isolation solution (PureZol)	Bio-Rad	7326880
RNase Away (surface decontaminant)	Thermo Scientific	1437535
RNase H	NEB	M0297S
Rnase inhibitor (RNase Out)	Invitrogen	10777019
Scintillation Vial (glass)	Electron Microscopy Sciences	72632
Slide drying bench	Electrothermal (Cole-Parmer)	MH6616
Stainless staining rack	Electron Microscopy Sciences	70312-54
Stereo microscope (for embedding)	Olympus	SZ51
Sugical scissors	McKesson	43-1-104
Superfine point Straight Dissecting Forceps	Avantor	82027-402
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT)	Invitrogen	18080044
SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL	Terumo	100281
SYBR Green (qPCR enzyme master mixture)	Applied Biosystems	A25778
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars)	Electron Microscopy Sciences	SKU: 62540-01
Toluene	Fisher Chemical	T324-1
Transfer pipette	Avantor	414004-005
Xylene	Fisher Chemical	X3P-1GAL