Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Temsili Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, murin supraklaviküler kahverengi yağ dokusunun diseksiyonu ve histolojik ve gen ekspresyon analizlerinin yapılması için pratik bir prosedür sunuyoruz.

Özet

Kahverengi yağ dokusu (BAT) aracılı termojenez, metabolizmanın düzenlenmesinde önemli bir rol oynar ve morfolojisi ve işlevi, farelerde ve insanlarda çevresel uyaranlardan büyük ölçüde etkilenebilir. Şu anda, farelerin üst dorsal kanadındaki iki kürek kemiği arasında bulunan murin interskapular BAT (iBAT), araştırma laboratuvarları tarafından BAT fonksiyonunu incelemek için kullanılan ana BAT deposudur. Son zamanlarda, farelerde, insan supraklaviküler kahverengi yağ dokusuna benzer bir tane de dahil olmak üzere, daha önce bilinmeyen birkaç BAT deposu tanımlandı. iBAT'tan farklı olarak, murin supraklaviküler kahverengi yağ dokusu (scBAT) boynun orta tabakasında bulunur ve bu nedenle kolayca erişilemez.

Yeni tanımlanan fare scBAT'ın çalışmasını kolaylaştırmak için, burada sunulan, bozulmamış scBAT'ı doğum sonrası ve yetişkin farelerden ayırma adımlarını detaylandıran bir protokoldür. scBAT'ın diğer yağ depolarına göre küçük boyutu nedeniyle, prosedürler özellikle scBAT'ı işlemek için değiştirilmiş ve optimize edilmiştir. Bu modifikasyonlar arasında, sonraki qPCR analizinin verimliliğini artırmak için donmuş scBAT örneklerinin hassasiyetini ve homojenizasyonunu artırmak için doku toplama sırasında bir diseksiyon mikroskobunun kullanılması yer almaktadır. Bu optimizasyonlar ile farelerde scBAT'ın tanımlanması, morfolojik görünümü ve moleküler karakterizasyonu belirlenebilir.

Giriş

ABD'de ve dünya çapında artan obezite prevalansı, etiyolojisini anlama ve potansiyel tedavileri belirleme konusunda büyük ilgi uyandırmıştır 1,2. Yağ dokusu metabolizmada hayati bir rol oynar ve yağ dokusunun düzensizliği obezite gelişimine yol açabilir. Genel olarak beyaz ve kahverengi yağ dokusu olmak üzere iki tip yağ dokusu vardır. Beyaz yağ dokusu (WAT) kimyasal enerjiyi depolayabilir ve endokrin faktörleri salgılayabilirken, kahverengi yağ dokusu (BAT) soğukta ısı üretmek ve vücut ısısını korumak için kimyasal enerji kullanabilir 3,4. Bu eşsiz ye....

Protokol

Hayvan prosedürleri, Baylor Tıp Fakültesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Tüm prosedürler 3 haftalık ve 3 aylık C57BL / 6J erkek fareler üzerinde gerçekleştirildi. Diseksiyondan önce, tüm farelere onaylanmış kemirgen karbondioksit ötenazi prosedürü kullanılarak ötenazi yapıldı. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve aletlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. scBAT diseksiyonu

  1. Fare karkasını tezgahın üzerine yerleştirin ve cerrahi makası ve ince uçlu forsepsleri %70 etanol ile temizleyin.
  2. Kürkü ıslatmak ve kürk kontaminasyonunu en ....

Temsili Sonuçlar

Sırtın deri altı tabakasında iki kürek kemiği arasında yer alan iBAT'tan farklı olarak, scBAT boynun orta tabakasında yer alır ve dış juguler ven boyunca büyüdükçe iskelet kası katmanları ile tükürük bezi arasında derinlere uzanır (Şekil 1A). scBAT'ı diseksiyon yapmak iBAT kadar kolay değildir. Burada, postnatal ve yetişkin farelerden sağlam scBAT'ın diseksiyonu için önemli adımları içeren ayrıntılı bir prosedür sunuyoruz.......

Tartışmalar

Bu protokolde, H&E ve gen ekspresyon analizleri için scBAT'ın diseksiyonu ve işlenmesi prosedürlerini ayrıntılı olarak sunuyoruz. scBAT boynun orta tabakasında bulunduğundan ve büyük damarlar boyunca uzandığından, bu deponun izolasyonu hassas bir teknik gerektirir. Özellikle, depoyu net bir şekilde görebilmek için, fareyi boyun açıldıktan sonra diseksiyon mikroskobu altına yerleştirmenizi öneririz. Tükürük bezinden ve çevresindeki damarlardan scBAT'ı soymak için bir çift süper ince nokta f.......

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, NIH'nin NIDDK tarafından R01DK116899 Numaralı Ödül altında, USDA/ARS Ödül Numarası 3092-51000-064-000D altında ve Baylor Tıp Fakültesi Kardiyovasküler Araştırma Enstitüsü'nden bir pilot ödül tarafından desteklenmektedir. Akış şemaları BioRender kullanılarak üretildi.

....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
95% Dehydrant Alcohol (Flex 95)Epredia8201
100% Dehydrant Alcohol (Flex 100)Epredia8101
96-well PCR plateBio-RadMLL9601
Aurum Binding Mini ColumnBio-Rad7326826
Aurum High Stringency WashBio-Rad7326803
Aurum Low Stringency WashBio-Rad7326804
Base Molds (for embedding)Tissue-Tek4122
BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2"Becton Dickinson305167
C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad1840148
Capless Microcentrifuge Tubes 2 mLFisherbrand02-681-453
Centrifuge Eppendorf5430R
CFX Opus 96 Real-Time PCR InstrumentBio-Rad12011319
ChloroformThermo Scientific Chemicals383760010
Cytoseal 60 Low-viscosity mounting mediumEpredia83104
DEPC-Treated WaterAmbionAM 9906
Dissecting MicroscopeNikonSMZ1500
DNase Dilution SolutionBio-Rad7326805
DNase IBio-Rad7326828
dNTPsInvitrogen18427013
Elution solutionBio-Rad7326801
EM 400 embedding medium paraffinLeica Biosystems3801320
Eosin Y (0.5% w/v)RICCA2858-16
Formula R Infiltration medium paraffinLeica Biosystems3801470
Genemark Nutator Gyromixer 349Bio ExpressS-3200-2
Gill #3 HematoxylinSigma-AldrichGHS332-1L
HCl (for HCL-Ethanol)Fisher ChemicalA142212
IP VI Embedding CassettesLeica Biosystems39LC-550-5-L
Koptec's Pure Ethanol - 200 Proof (for 70% Ethanol)Decon LabsV1001
MgCl2 (25 mM)Thermo Fisher ScientificR0971
Microcentrifuge Tubes 1.7 mLAvantor87003-294
Microseal 'B' Seals (adhseive seals)Bio-RadMSB1001
MicrotomeLeica BiosystemsRM2245
Molecular Biology Grade WaterCorning46-000-CM
Mortar Coors TekThomas Scientific60310
NaCl (for 0.85% saline)Fisher BioreagentsBP358-212
NanoDrop SpectrophotometerNanoDrop TechnologiesND-1000 UV/Vis
Oligo dTInvitrogen18418020
Paraffin Section Flotation BathBoekel Scientific14792V
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-AldrichP6148-500G
PCR Tube StripAvantor76318-802
Pestle by Coors TekThomas Scientific60311
Pestle Pellet MotorKimble749540-0000
Phosphate Buffer Saline (PBS)Sigma-AldrichD8537-500ML
Precision Model 19 Vacuum Oven Thermo Fisher ScientificCAT# 51221162
Primer: 36B4  (forward) 10 μM
5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’		Chen lab Oligo database
Primer: 36B4 (reverse) 10 μM
5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’		Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (forward) 10 μM
5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’		Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM
5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’		Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM
5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’		Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM
5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’		Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (forward) 10 μM
5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’		Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (reserve) 10 μM
5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’		Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM
5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’		Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM
5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’		Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (forward) 10 μM
5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’		Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM
5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’		Chen lab Oligo database
RNA isolation solution (PureZol)Bio-Rad7326880
RNase Away (surface decontaminant)Thermo Scientific1437535
RNase HNEBM0297S
Rnase inhibitor (RNase Out)Invitrogen10777019
Scintillation Vial (glass)Electron Microscopy Sciences72632
Slide drying bench Electrothermal (Cole-Parmer)MH6616
Stainless staining rackElectron Microscopy Sciences70312-54
Stereo microscope (for embedding)OlympusSZ51
Sugical scissorsMcKesson43-1-104
Superfine point Straight Dissecting ForcepsAvantor82027-402
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT) Invitrogen18080044
SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mLTerumo100281
SYBR Green (qPCR enzyme master mixture)Applied BiosystemsA25778
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars)Electron Microscopy SciencesSKU: 62540-01
TolueneFisher ChemicalT324-1
Transfer pipetteAvantor414004-005
XyleneFisher ChemicalX3P-1GAL

Referanslar

  1. Boutari, C., Mantzoros, C. S. A 2022 update on the epidemiology of obesity and a call to action: as its twin COVID-19 pandemic appears to be receding, the obesity and dysmetabolism pandemic continues to rage on. Metabolism. 133, 155217 (2022).
  2. Hales, C. M., Carroll, M. D., Fryar, C. D., Ogden, C. L.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 205

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır