小鼠锁骨上棕色脂肪组织的解剖、组织学处理及基因表达分析

摘要

在这里，我们提供了一个实用的程序，用于解剖和执行小鼠锁骨上棕色脂肪组织的组织学和基因表达分析。

摘要

棕色脂肪组织（BAT）介导的产热在代谢的调节中起着重要作用，其形态和功能在小鼠和人类中受到环境刺激的影响很大。目前，小鼠肩胛间 BAT （iBAT） 位于小鼠上背侧的两个肩胛骨之间，是研究实验室用于研究 BAT 功能的主要 BAT 库。最近，在小鼠中发现了一些以前未知的BAT库，包括一种类似于人类锁骨上棕色脂肪组织的细胞库。与 iBAT 不同，小鼠锁骨上棕色脂肪组织 （scBAT） 位于颈部的中间层，因此不容易进入。

为了促进对新鉴定的小鼠scBAT的研究，本文介绍的方案详细说明了从出生后和成年小鼠中解剖完整scBAT的步骤。由于scBAT的尺寸相对于其他脂肪库较小，因此专门针对处理scBAT的程序进行了修改和优化。这些改进包括在组织采集过程中使用解剖显微镜来提高冷冻scBAT样品的精密度和均质化程度，从而提高后续qPCR分析的效率。通过这些优化，可以在小鼠中确定scBAT的鉴定、形态学外观和分子特征。

引言

肥胖症在美国和全球的患病率不断上升，引发了人们对了解其病因和确定潜在治疗方法的极大兴趣^1,2。脂肪组织在新陈代谢中起着至关重要的作用，脂肪组织的失调会导致肥胖的发展。一般来说，脂肪组织有两种类型，白色和棕色脂肪组织。白色脂肪组织 （WAT） 可以储存化学能并分泌内分泌因子，而棕色脂肪组织 （BAT） 可以利用化学能产生热量并在寒冷中保持体温 ^3,4。由于这种独特的能力，BAT 的激活还可以增加能量消耗并提高胰岛素敏感性⁵。

BAT 通过非颤抖产热发挥其功能，该过程由解偶联蛋白 1 （UCP1） ^介导6。哺乳动物，包括小鼠和人类，拥有不同数量的BAT。BAT的经典观点是，这些脂肪组织在小鼠和婴儿中比在成年人类中更丰富。iBAT位于肩胛骨之间的上背侧，是小鼠中研究最多的BAT库。通过应用放射性同位素成像和活检测试，最近的研究在成年人类中发现了几个BAT库。其中一些，包括在颈部深部和锁骨上区域发现的仓库，以前没有在小鼠或其他模式动物中鉴定出来7,8,9,10,11。在这些 BAT 仓库中，scBAT 是成年人中最常见的仓库。为了更好地了解这些新发现的BAT库在人类中的起源和分子贡献，必须确定小鼠体内的等效库，这些库允许遗传和分子操作来追踪和测试这些库的功能作用。因此，我们和其他人在小鼠的不同解剖位置发现了一些以前未知的 BAT 库，包括 scBAT^12,13、胸血管周围 BAT^14,15、肾周 BAT¹⁶ 和主动脉周围 BAT¹⁷。小鼠scBAT在解剖学上与人类scBAT相似，形态学上与经典iBAT相似，表达高水平的UCP1¹²。

与易于解剖的小鼠 iBAT 不同，scBAT 位于小鼠颈部的中间层、唾液腺下方和颈外静脉。分离该库进行组织学和分子分析可能具有挑战性。在这里，我们详细描述了从出生后和成年小鼠中解剖scBAT并处理该库进行组织学和基因表达分析的过程。

研究方案

动物程序已获得贝勒医学院机构动物护理和使用委员会的批准。所有程序均在3周龄和3个月大的C57BL / 6J雄性小鼠上进行。在解剖之前，所有小鼠都使用批准的啮齿动物二氧化碳安乐死程序进行安乐死。有关本协议中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参阅材料表。

1. scBAT的解剖

1. 将小鼠尸体放在工作台上，用70%乙醇清洁手术剪刀和超细尖镊子。
2. 用 70% 乙醇喷洒小鼠的腹颈，以润湿皮毛并最大限度地减少毛皮污染。
3. 沿着锁骨做一个约 1.5 厘米的双侧切口。
4. 从前一个切口的末端，向耳朵纵向切割，长约1厘米。这将在颈部周围形成一个方形的U形切口（图1A，B）。
   注意：scBAT位于颈部的中间层。在此步骤中，由皮肤、皮下脂肪组织和唾液腺组成的表层暴露在外。中间层与scBAT一起包含颈静脉和颈部肌肉。颈部深层，包含颈部深部 BAT 以及动脉和颈静脉，通过去除骨骼肌暴露出来。
5. 将小鼠置于解剖显微镜下，使暴露的颈部聚焦（图1C）。
   注意：这个增加的步骤大大提高了组织收集的精度，这是必要的，因为scBAT的尺寸很小。
6. 用镊子将切开的皮肤部分完全暴露唾液腺。
7. 使用手术剪刀和镊子，断开连接唾液腺与锁骨周围组织以及彼此之间的组织。
8. 通过抬起唾液腺暴露scBAT库。沿颈外静脉寻找 BAT，并可能连接到唾液腺的下侧。通过其橙色来识别它，在周围组织中脱颖而出。
9. 用镊子握住目标脂肪组织，轻轻地将其从唾液腺中剥离。
10. 一旦与唾液腺分离，继续断开scBAT与颈外静脉和颈部肌肉组织的连接，直到颈部两侧的仓库可以全部切除。
11. 在解剖显微镜下检查每个解剖的scBAT样品（图1D，E），使用镊子去除任何残留的结缔组织。
12. 将每个样品放入含有 10 mL 磷酸盐缓冲盐水溶液 （PBS） 的玻璃闪烁瓶中，然后从显微镜下取出小鼠。

2. scBAT的加工和苏木精和伊红（H&E）染色 （ 如图2A所示）

1. 用10mL冷的4%多聚甲醛（PFA）代替PBS（步骤1.12），并将小瓶放在螺纹器上，在4°C下摇动过夜以固定scBAT。
   注意：当需要进一步处理免疫组化分析时，灌注固定可用于出生后，特别是成年小鼠。
2. 第二天，用无菌移液管从小瓶中取出PFA溶液，并用10-15mLPBS代替。将小瓶放在螺纹器上，在室温下摇晃30分钟。用0.85%盐水溶液代替PBS，并在室温下继续摇动30分钟。
   注意：盐水溶液在DEPC处理的水（不含RNase）中为0.85%盐水（NaCl） w / v。PBS可以代替本步骤和后续步骤中的盐水溶液。
3. 用移液管除去 0.85% 生理盐水，并向小瓶中加入 10 mL 70% 乙醇/0.85% 生理盐水溶液。将小瓶存放在4°C冰箱中过夜或直到准备好嵌入石蜡。
   注意：如果没有 0.85% 盐水，则可以使用 PBS。scBAT应尽快处理，以便于切片和更好地保存组织形态。
4. 在石蜡包埋之前，通过一系列乙醇交换使scBAT脱水，以去除组织中的水分。
   1. 首先，用移液管从小瓶中除去70%乙醇/ 0.85%盐水，并加入10-15mL95%脱水酒精，在室温下在导向器上摇晃小瓶1小时。重复此步骤一次。
      注意：乙醇可用于代替脱水剂酒精溶液。
   2. 接下来，用10-15mL的100%脱水酒精代替95%脱水酒精，并继续在螺纹上摇摆1小时。重新装满新的 100% 脱水酒精并继续摇晃数小时或过夜，具体取决于小瓶中 scBAT 的数量。
5. 要清除scBAT进行嵌入，请向小瓶中加入10mL甲苯，并继续在导杆上摇摆，直到scBAT透明，大约6-8小时。
   注意：达到令人满意的清算所需的时间取决于 scBAT 的大小。建议在早上立即开始清理，以便在下午进行渗透和嵌入。
6. 要将 scBAT 包埋在石蜡中，请除去甲苯并向小瓶中加入 10 mL 熔化的浸润石蜡。将小瓶置于65°C的烤箱中1小时。用新蜡重复此步骤。
   注意： 在开始嵌入之前，开始在烤箱中熔化蜡颗粒过夜，以确保蜡是完全液态的。
7. 用嵌入石蜡代替渗透石蜡，并将小瓶置于相同温度下1小时。重复此步骤一次。
   注意：渗透阶段可以中断并在以后继续。从烤箱中取出小瓶并将其存放在室温下，直到准备好继续。
8. 首先将组织放入组织包埋模具中，将熔化的包埋蜡添加到模具中，然后在立体显微镜下重新定向组织。然后，将包埋盒放在蜡的顶部，并继续将包埋蜡倒在其顶部，直到它装满并将包埋盖固定在蜡块上。将块转移到4°C冰箱过夜，让蜡变硬并收缩，然后再取出金属模具。
9. 用切片机将scBAT切片至厚度为5-6μm18，每个显微镜载玻片三至四个切片，并置于~42°C的温石蜡切片浮浮浴中，以使组织切片平滑。
10. 将部分转移到载玻片上，并将载玻片直立放在漂浮浴上，让水从载玻片上滴落。
11. 将载玻片转移到不锈钢染色架上，然后将载玻片放在载玻片干燥台上晾干过夜。
    注意：在进行进一步加工之前，石蜡载玻片可以在室温下长期储存。
12. 进行 H&E 染色¹⁹.首先，将载玻片放入染色架中，然后将载玻片放入装有二甲苯的染色罐中40秒。重复此步骤一次。
    注意： 如果石蜡在两个阶段后仍然可见，请等到它完全溶解后再继续。
13. 要使组织再水化，请将载玻片架放入装有100%脱水酒精的染色罐中两个20秒阶段，然后在95%脱水酒精中进行15秒阶段，最后在ddH₂O中冲洗15秒。
14. 将载玻片置于装有苏木精溶液的染色皿中75秒以达到核染色，然后在用ddH₂O染色皿中冲洗载玻片45秒。
    注意： 时间可以根据所需的污渍颜色进行调整。
15. 通过将载玻片浸入装有HCl-乙醇溶液的染色皿中15秒来区分染色，然后将载玻片转移到另一个ddH₂O冲洗15秒。
    注：HCl-乙醇溶液根据已发表的方法¹⁹制备。
16. 对于细胞质染色，将载玻片置于曙红Y复染溶液中15秒。
17. 通过在三个连续的 95% 脱水酒精溶液阶段中将载玻片浸泡 15 秒来脱水组织，然后进行两个连续的 100% 脱水酒精浴 - 第一个 15 秒，第二个 45 秒 - 完成脱水。
18. 最后，将载玻片转移到二甲苯浴中45秒，以使组织重新适应有机溶剂。完成此步骤后，染色完成;从溶液中取出组织。
19. 将安装介质涂在每张载玻片上，并将其盖在化学通风橱内。成像前晾干过夜。成像结果如 图2B所示。

3. scBAT的基因表达分析

1. 组织收集（研磨）
   1. 解剖scBAT后，立即将组织放入微量离心管中，用无菌针头在管顶部戳一个孔，并在液氮中快速冷冻。
      注意： 图3A说明了此处概述的协议的主要步骤。在将管子放入液氮之前，在管子顶部戳一个孔，可以防止管子因压力突然变化而爆裂。
   2. 用液氮填充塑料烧杯，然后留下杵和薄刮刀浸泡。
      注意：在整个过程中，重要的是要保持所有工具和组织样品的温度尽可能低，接近液氮的温度，以防止组织解冻。解冻的脂肪组织具有很强的粘附性，使粉末化更具挑战性。仅在使用前立即从液氮浴中取出工具和样品。
   3. 一次取一个速冻组织样品，并将其从微量离心管倒入研钵中。
   4. 在研钵中加入少量液氮，然后用研杵研磨冷冻组织，直至完全粉碎。
      注意：如果组织在任何时候开始变软或变粘，则说明它正在解冻;将更多的液氮倒入研钵中。
   5. 用薄刮刀小心地刮擦粉碎的组织并将其转移回微量离心管中。在刮擦的同时将液氮倒入研钵中，以收集剩余的组织碎片，然后用刮刀转移。重复转移步骤，直到从研钵中取出所有组织。
   6. 在倾倒下一个样品进行研磨之前，用轻型纸巾擦拭器和 70% 乙醇清洁砂浆。将粉末组织长期储存在-80°C冰箱中。
2. 总RNA分离
   1. 制备
      1. 用 70% 乙醇和表面去污剂清洁工作台、移液器、吸头支架和试管架，以去除 RNase。
      2. 运行离心机达到4°C。
      3. 将洗脱液加热至70°C。
      4. 通过将 5 μL 复溶的 DNase I 与每个样品的 75 μL DNase 稀释溶液混合来稀释 DNase I。将 DNase I 溶液放在冰上直至使用。
   2. 程序
      1. 对于每个样品，标记两个微量离心管、两个色谱柱保持管（两个无盖刻度微量离心管）和一个结合迷你柱。
      2. 向每个样品中加入 500 μL RNA 分离溶液，并使用沉淀杵电机超声处理 30 秒。
      3. 为每个样品取一个注射器，上下移液 10 次以进一步裂解组织。确保注射后看不到固体。
      4. 加入 250 μL 氯仿并偶尔涡旋，同时等待 5 分钟，使样品在室温下孵育。
      5. 在4°C下以21,000× g 离心20分钟。
      6. 将顶部水性部分转移到新的微量离心管中，并加入等量的70%乙醇（~500μL）。
         注意：顶部水性部分应该是透明的，底部应该是红色RNA分离溶液，两层之间应该是一些不需要的固体。
      7. 将 500 μL 新裂解物转移到结合柱中。以18,000× g 离心60秒，然后弃去滤液。
      8. 对剩余的裂解物重复上一步，将所有RNA放入结合柱中。
      9. 向结合柱中加入700μL低严格洗涤液，离心30秒，弃去滤液。
      10. 向每个结合柱中加入 80 μL 稀释的 DNase I。在室温下孵育15分钟。
      11. 加入 700 μL 高严格洗涤液，离心 30 秒，弃去滤液。
      12. 加入 700 μL 低严格洗涤液，离心 60 秒，弃去滤液。
      13. 将结合柱移入第2^个 新的无盖柱保持管中，并离心2分钟，以确保所有液体都从结合柱中除去。
      14. 将结合柱移至新的微量离心管中，并加入 30 μL 温热的洗脱溶液。在室温下孵育 1 分钟。
      15. 离心2分钟，在微量离心管底部收集洗脱的RNA。
      16. 使用分光光度计测量总RNA浓度。
          注意：如果总RNA纯度较低，则由260/280值低于2.0或260/230值低于1.8表示，则在步骤3.2.2.12.之后，样品可以再次用低严格洗涤液洗涤，然后用80%乙醇洗涤，然后继续步骤3.2.2.13。
      17. 将RNA储存在-80°C冰箱中。
   3. 逆转录 （RT）
      1. 在PCR管条中，将0.5-1μg在DEPC处理的水中稀释的总RNA加入到不同的孔中，每个RNA样品总共8μL。
         注意：用于逆转录的RNA量可以根据制造商的说明放大或缩小。
      2. 向PCR管中的每个样品中加入1μL寡核苷酸dT和1μLdNTP。确保每个样品的总体积为 10 μL。
      3. 将PCR管条置于热循环仪中，并将其设置为65°C5分钟，然后无限期地设置4°C。
      4. 在65°C下5分钟后，取出PCR管条并将管放在冰上至少2分钟。在冰上孵育后，向每个样品中加入五种试剂：4 μL 5x 第一链缓冲液、2 μL 25 mM MgCl₂、2 μL 0.1 M DTT、1 μL RNase 抑制剂和 1 μL 逆转录酶。确保每个样品的总体积现在为 20 μL。
      5. 将PCR管条放回热循环仪中，并将程序设置为50°C50分钟，然后85°C5分钟，然后无限期地4°C。
      6. 程序达到4°C后，取出试纸条并加入1μL核糖核酸酶H（RNase H）。
         注意：RNase H用于去除RT反应中任何剩余的RNA模板;通过此步骤，所需的RNA应该已经转化为cDNA。
      7. 将条带放回热循环仪中，在37°C下运行20分钟，然后无限期地在4°C下运行。
      8. 逆转录完成;使用分光光度计测量cDNA浓度。
      9. 将 cDNA 稀释至 250 ng/μL;将cDNA储存在-80°C或-20°C冰箱中。
   4. 定量PCR（qPCR）
      1. 制作一个电子表格，以组织每个引物和样品在 96 孔 qPCR 板上的位置。
         注意：其中一个引物需要是参考基因，以使所有其他目标基因（如 36B4）的表达正常化。
      2. 为每个“引物+样品”组合制作引物预混液。向每个qPCR反应孔中加入3 μL分子生物学级水、5 μL qPCR酶预混液、0.5 μL正向引物和0.5 μL反向引物，每次反应加起来为9 μL。每个反应加入 1 μL cDNA，使每个反应孔总共 10 μL。
         注意：标准是每个“引物+样品”组合有三个技术重复，因此每个预混液应为上述数量的 4 倍。
      3. 向每个引物预混液中加入 1 μL cDNA。如果每个预混液为 4 倍，则将每个样品 cDNA 的 4 μL 移液到它们自己标记的试管中。
      4. 最后，将每种反应混合物的 10 μL 移液到电子表格确定的位置的 96 孔 qPCR 板中。
      5. 用厚厚的粘性密封板密封板，然后在20°C下将96孔板在450× g 离心2分钟。
         注意： 至关重要的是，板必须完全密封，以避免样品在热循环过程中蒸发。使用轻型纸巾擦拭器将密封件向下压在板上，尤其是边缘。
      6. 在实时荧光定量PCR仪器中运行板。根据制造商的说明对PCR反应进行编程：在50°C下2分钟，然后在95°C下再2分钟，最后在95°C下进行40个循环，在95°C下进行15秒，在60°C下进行30秒。 qPCR基因表达分析的结果如 图3B所示。

结果

与位于两个肩胛骨之间的背部皮下层的 iBAT 不同，scBAT 位于颈部的中间层，在骨骼肌和唾液腺层之间延伸深处，因为它沿着颈外静脉生长（图 1A）。剖析 scBAT 并不像 iBAT 那么简单。在这里，我们提供了一个详细的程序，包括从出生后和成年小鼠中解剖完整scBAT的关键步骤（图1B，C）。使用提供的方案打开颈部后，?...

讨论

在该方案中，我们详细介绍了用于H&E和基因表达分析的解剖和处理scBAT的程序。由于scBAT位于颈部的中间层，并位于大静脉中，因此该库的分离需要精确的技术。具体来说，为了获得仓库的清晰视图，我们建议在颈部打开后将小鼠置于解剖显微镜下。使用一对超细尖镊子从唾液腺和周围静脉剥离 scBAT，应注意避免刺穿静脉。出血过多会使 scBAT 更难定位。为了处理用于 H&E 染色的 scBAT，我们调整了已...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
95% Dehydrant Alcohol (Flex 95)	Epredia	8201
100% Dehydrant Alcohol (Flex 100)	Epredia	8101
96-well PCR plate	Bio-Rad	MLL9601
Aurum Binding Mini Column	Bio-Rad	7326826
Aurum High Stringency Wash	Bio-Rad	7326803
Aurum Low Stringency Wash	Bio-Rad	7326804
Base Molds (for embedding)	Tissue-Tek	4122
BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2"	Becton Dickinson	305167
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad	1840148
Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL	Fisherbrand	02-681-453
Centrifuge	Eppendorf	5430R
CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument	Bio-Rad	12011319
Chloroform	Thermo Scientific Chemicals	383760010
Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium	Epredia	83104
DEPC-Treated Water	Ambion	AM 9906
Dissecting Microscope	Nikon	SMZ1500
DNase Dilution Solution	Bio-Rad	7326805
DNase I	Bio-Rad	7326828
dNTPs	Invitrogen	18427013
Elution solution	Bio-Rad	7326801
EM 400 embedding medium paraffin	Leica Biosystems	3801320
Eosin Y (0.5% w/v)	RICCA	2858-16
Formula R Infiltration medium paraffin	Leica Biosystems	3801470
Genemark Nutator Gyromixer 349	Bio Express	S-3200-2
Gill #3 Hematoxylin	Sigma-Aldrich	GHS332-1L
HCl (for HCL-Ethanol)	Fisher Chemical	A142212
IP VI Embedding Cassettes	Leica Biosystems	39LC-550-5-L
Koptec's Pure Ethanol - 200 Proof (for 70% Ethanol)	Decon Labs	V1001
MgCl2 (25 mM)	Thermo Fisher Scientific	R0971
Microcentrifuge Tubes 1.7 mL	Avantor	87003-294
Microseal 'B' Seals (adhseive seals)	Bio-Rad	MSB1001
Microtome	Leica Biosystems	RM2245
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CM
Mortar Coors Tek	Thomas Scientific	60310
NaCl (for 0.85% saline)	Fisher Bioreagents	BP358-212
NanoDrop Spectrophotometer	NanoDrop Technologies	ND-1000 UV/Vis
Oligo dT	Invitrogen	18418020
Paraffin Section Flotation Bath	Boekel Scientific	14792V
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148-500G
PCR Tube Strip	Avantor	76318-802
Pestle by Coors Tek	Thomas Scientific	60311
Pestle Pellet Motor	Kimble	749540-0000
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Precision Model 19 Vacuum Oven	Thermo Fisher Scientific	CAT# 51221162
Primer: 36B4  (forward) 10 μM 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’			Chen lab Oligo database
Primer: 36B4 (reverse) 10 μM 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (forward) 10 μM 5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM 5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM 5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM 5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’			Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (forward) 10 μM 5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’			Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (reserve) 10 μM 5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (forward) 10 μM 5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM 5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’			Chen lab Oligo database
RNA isolation solution (PureZol)	Bio-Rad	7326880
RNase Away (surface decontaminant)	Thermo Scientific	1437535
RNase H	NEB	M0297S
Rnase inhibitor (RNase Out)	Invitrogen	10777019
Scintillation Vial (glass)	Electron Microscopy Sciences	72632
Slide drying bench	Electrothermal (Cole-Parmer)	MH6616
Stainless staining rack	Electron Microscopy Sciences	70312-54
Stereo microscope (for embedding)	Olympus	SZ51
Sugical scissors	McKesson	43-1-104
Superfine point Straight Dissecting Forceps	Avantor	82027-402
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT)	Invitrogen	18080044
SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL	Terumo	100281
SYBR Green (qPCR enzyme master mixture)	Applied Biosystems	A25778
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars)	Electron Microscopy Sciences	SKU: 62540-01
Toluene	Fisher Chemical	T324-1
Transfer pipette	Avantor	414004-005
Xylene	Fisher Chemical	X3P-1GAL