쥐 쇄골 상갈색 지방 조직의 해부, 조직학적 처리 및 유전자 발현 분석

요약

여기에서는 쥐 쇄골 상부 갈색 지방 조직의 조직학적 및 유전자 발현 분석을 해부하고 수행하기 위한 실용적인 절차를 제공합니다.

초록

갈색 지방 조직(BAT)에 의한 열발생은 신진대사 조절에 중요한 역할을 하며, 그 형태와 기능은 생쥐와 인간의 환경 자극에 의해 크게 영향을 받을 수 있습니다. 현재 쥐의 상부 등쪽 측면에 있는 두 개의 견갑골 사이에 위치한 쥐 견갑간 BAT(iBAT)는 BAT 기능을 연구하기 위해 연구 실험실에서 사용하는 주요 BAT 저장소입니다. 최근에는 이전에 알려지지 않았던 몇 개의 BAT 저장소가 마우스에서 확인되었는데, 그 중 하나는 인간의 쇄골 상부 갈색 지방 조직과 유사합니다. iBAT와 달리 쥐 쇄골 상 갈색 지방 조직(scBAT)은 목의 중간층에 위치하므로 쉽게 접근할 수 없습니다.

새로 확인된 마우스 scBAT의 연구를 용이하게 하기 위해, 출생 후 및 성체 마우스로부터 온전한 scBAT를 해부하는 단계를 상세히 기술하는 프로토콜이 본 명세서에 제시되어 있다. scBAT는 다른 지방 저장소에 비해 크기가 작기 때문에 scBAT 처리를 위해 절차가 수정되고 최적화되었습니다. 이러한 수정 사항 중에는 조직 수집 중에 해부 현미경을 사용하여 냉동 scBAT 샘플의 정밀도와 균질화를 증가시켜 후속 qPCR 분석의 효율성을 높이는 것이 있습니다. 이러한 최적화를 통해 마우스에서 scBAT의 식별, 형태학적 외관 및 분자 특성을 결정할 수 있습니다.

서문

미국과 전 세계적으로 비만의 유병률이 증가함에 따라 비만의 원인을 이해하고 잠재적인 치료법을 식별하는 데 큰 관심이 높아지고 있습니다 ^1,2. 지방 조직은 신진대사에 중요한 역할을 하며, 지방 조직의 조절 장애는 비만의 발병으로 이어질 수 있습니다. 일반적으로 지방 조직에는 흰색과 갈색 지방 조직의 두 가지 유형이 있습니다. 백색 지방 조직(WAT)은 화학 에너지를 저장하고 내분비 인자를 분비할 수 있는 반면, 갈색 지방 조직(BAT)은 화학 에너지를 사용하여 열을 발생시키고 추위 속에서 체온을 유지할 수 있습니다 ^3,4. 이러한 독특한 능력으로 인해 BAT의 활성화는 에너지 소비를 증가시키고 인슐린 감수성을 향상시킬 수 있다⁵.

BAT는 비(非)떨림 열발생(uncoupling protein ^1, UCP1)6에 의해 매개되는 과정을 통해 기능을 발휘합니다. 생쥐와 인간을 포함한 포유류는 다양한 양의 BAT를 가지고 있습니다. BAT의 고전적 견해는 이....

프로토콜

동물 시술은 베일러 의과대학(Baylor College of Medicine)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 모든 시술은 생후 3주 및 3개월 된 C57BL/6J 수컷 마우스에 대해 수행하였다. 해부에 앞서, 모든 쥐는 승인된 설치류 이산화탄소 안락사 절차를 사용하여 안락사시켰다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 시약 및 기기와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. scBAT 해부

1. 쥐 사체를 작업대에 놓고 수술용 가위와 극세 포인트 집게를 70% 에탄올로 청소합니다.
2. 쥐의 복부 목에 70% 에탄올을 뿌려 털을 적시고 털 오염을 최소화합니다.
3. 쇄골을 따라 약 1.5cm의 양측 절개를 합니다.
4. 이전 절개 끝에서 귀를 향해 세로로 약 1cm 길이로 자릅니다. 이렇게 하면 목 주위에 사각형 U자형 절개가 형성됩니다(그림 1A,B).
   알림: scBAT는 목의 중간 층에 있습니다. 피부, 피하 지방 조직, 침샘으로 구성된 표층이 이 단계에서 노....

토론

이 프로토콜에서는 H&E 및 유전자 발현 분석을 위한 scBAT의 해부 및 처리 절차를 자세히 설명합니다. scBAT는 목의 중간층에 있고 큰 정맥을 따라 놓여 있기 때문에 이 저장소의 격리에는 정밀한 기술이 필요합니다. 특히, 창고를 명확하게 보려면 목을 연 후 해부 현미경 아래에 마우스를 놓는 것이 좋습니다. 한 쌍의 초미세 포인트 겸자를 사용하여 타액선과 주변 정맥에서 scBAT를 벗겨내고 정맥에 구.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
95% Dehydrant Alcohol (Flex 95)	Epredia	8201
100% Dehydrant Alcohol (Flex 100)	Epredia	8101
96-well PCR plate	Bio-Rad	MLL9601
Aurum Binding Mini Column	Bio-Rad	7326826
Aurum High Stringency Wash	Bio-Rad	7326803
Aurum Low Stringency Wash	Bio-Rad	7326804
Base Molds (for embedding)	Tissue-Tek	4122
BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2"	Becton Dickinson	305167
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad	1840148
Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL	Fisherbrand	02-681-453
Centrifuge	Eppendorf	5430R
CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument	Bio-Rad	12011319
Chloroform	Thermo Scientific Chemicals	383760010
Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium	Epredia	83104
DEPC-Treated Water	Ambion	AM 9906
Dissecting Microscope	Nikon	SMZ1500
DNase Dilution Solution	Bio-Rad	7326805
DNase I	Bio-Rad	7326828
dNTPs	Invitrogen	18427013
Elution solution	Bio-Rad	7326801
EM 400 embedding medium paraffin	Leica Biosystems	3801320
Eosin Y (0.5% w/v)	RICCA	2858-16
Formula R Infiltration medium paraffin	Leica Biosystems	3801470
Genemark Nutator Gyromixer 349	Bio Express	S-3200-2
Gill #3 Hematoxylin	Sigma-Aldrich	GHS332-1L
HCl (for HCL-Ethanol)	Fisher Chemical	A142212
IP VI Embedding Cassettes	Leica Biosystems	39LC-550-5-L
Koptec's Pure Ethanol - 200 Proof (for 70% Ethanol)	Decon Labs	V1001
MgCl2 (25 mM)	Thermo Fisher Scientific	R0971
Microcentrifuge Tubes 1.7 mL	Avantor	87003-294
Microseal 'B' Seals (adhseive seals)	Bio-Rad	MSB1001
Microtome	Leica Biosystems	RM2245
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CM
Mortar Coors Tek	Thomas Scientific	60310
NaCl (for 0.85% saline)	Fisher Bioreagents	BP358-212
NanoDrop Spectrophotometer	NanoDrop Technologies	ND-1000 UV/Vis
Oligo dT	Invitrogen	18418020
Paraffin Section Flotation Bath	Boekel Scientific	14792V
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148-500G
PCR Tube Strip	Avantor	76318-802
Pestle by Coors Tek	Thomas Scientific	60311
Pestle Pellet Motor	Kimble	749540-0000
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Precision Model 19 Vacuum Oven	Thermo Fisher Scientific	CAT# 51221162
Primer: 36B4  (forward) 10 μM 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’			Chen lab Oligo database
Primer: 36B4 (reverse) 10 μM 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (forward) 10 μM 5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM 5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM 5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM 5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’			Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (forward) 10 μM 5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’			Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (reserve) 10 μM 5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (forward) 10 μM 5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM 5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’			Chen lab Oligo database
RNA isolation solution (PureZol)	Bio-Rad	7326880
RNase Away (surface decontaminant)	Thermo Scientific	1437535
RNase H	NEB	M0297S
Rnase inhibitor (RNase Out)	Invitrogen	10777019
Scintillation Vial (glass)	Electron Microscopy Sciences	72632
Slide drying bench	Electrothermal (Cole-Parmer)	MH6616
Stainless staining rack	Electron Microscopy Sciences	70312-54
Stereo microscope (for embedding)	Olympus	SZ51
Sugical scissors	McKesson	43-1-104
Superfine point Straight Dissecting Forceps	Avantor	82027-402
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT)	Invitrogen	18080044
SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL	Terumo	100281
SYBR Green (qPCR enzyme master mixture)	Applied Biosystems	A25778
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars)	Electron Microscopy Sciences	SKU: 62540-01
Toluene	Fisher Chemical	T324-1
Transfer pipette	Avantor	414004-005
Xylene	Fisher Chemical	X3P-1GAL