نمذجة البيئات الدقيقة المهبلية الصحية وعسر التنشيط في مهبل بشري على رقاقة

Summary

توضح هذه المقالة بروتوكولا لإنشاء جهاز زراعة مهبل على رقاقة (Vagina Chip) يمكن من دراسة تفاعلات المضيف البشري مع ميكروبيوم مهبلي حي في ظل ظروف microaerophilic. يمكن استخدام هذه الشريحة كأداة للتحقيق في الأمراض المهبلية وكذلك لتطوير واختبار التدابير المضادة العلاجية المحتملة.

Abstract

لم تحظ صحة المرأة ، وخاصة أمراض الجهاز التناسلي للأنثى (FRT) ، بالاهتمام الذي تستحقه ، على الرغم من أن الجهاز التناسلي غير الصحي قد يؤدي إلى أمراض تهدد الحياة أو العقم أو نتائج سلبية أثناء الحمل. أحد العوائق في هذا المجال هو أنه كان هناك ندرة في النماذج التجريبية قبل السريرية التي تحاكي بأمانة علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية ل FRT. لا تلخص النماذج الحالية في المختبر بشكل كامل التغيرات الهرمونية والظروف الهوائية الدقيقة والتفاعلات مع الميكروبيوم المهبلي. إن ظهور تقنية زراعة الموائع الدقيقة Organ-on-a-Chip (Organ Chip) التي يمكن أن تحاكي واجهات الأنسجة والأنسجة ، والتروية الوعائية ، وتدفقات السوائل الخلالية ، والبيئة المكروية المادية لوحدة فرعية رئيسية من الأعضاء البشرية يمكن أن تكون بمثابة حل لهذه المشكلة. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير رقاقة مهبلية بشرية تدعم الثقافة المشتركة للاتحادات الميكروبية المهبلية البشرية مع ظهارة مهبلية بشرية أولية مرتبطة أيضا بسدى مهبلي وتشهد تدفق سائل ديناميكي. تكرر هذه الشريحة الاستجابات الفسيولوجية للمهبل البشري للميكروبيوم الصحي وعسر الحيوي. تم وصف بروتوكول مفصل لإنشاء رقائق المهبل البشرية في هذه المقالة.

Introduction

يلعب الميكروبيوم المهبلي الذي يهيمن عليه Lactobacillus spp. الذي يساعد في الحفاظ على البيئة المكروية الحمضية دورا مهما في الحفاظ على الصحة الإنجابية للإناث¹. ومع ذلك ، في بعض الأحيان يمكن أن يكون هناك تغيير في تكوين المجتمعات الميكروبية التي تشكل الميكروبيوم ، مما يؤدي إلى زيادة في تنوع البكتيريا المهبلية. ترتبط هذه التغيرات في خلل التخلق ، والتي غالبا ما تؤدي إلى التحول من حالة تهيمن عليها Lactobacillus إلى حالة تهيمن عليها أنواع بكتيرية لاهوائية أكثر تنوعا (على سبيل المثال ، Gardnerella vaginalis) ، بأمراض مختلفة في الجهاز التناسلي ، مثل التهاب المهبل الجرثومي ، التهاب المهبل الضموري ، عدوى المسالك البولية ، داء الم....

Protocol

تم إجراء هذا البحث وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لاستخدام الخلايا البشرية. تم الحصول على الخلايا تجاريا (انظر جدول المواد). يجب تنفيذ جميع الخطوات بشكل معقم في خزانة السلامة البيولوجية (BSC). استخدم فقط أطراف ماصة المرشح (أو الحاجز) لهذا البروتوكول.

1. زراعة الخلايا الظهارية المهبلية البشرية

1. يسخن 50 مل من الوسط الظهاري المهبلي (VEM ، انظر جدول المواد) إلى 37 درجة مئوية.
2. القسمة 9 مل من VEM إلى أنبوب 15 مل. ثم قم بإذابة قارورة من الخلايا الظهارية المهبلية البشرية (HVECs) ، وأضفها إلى الأنبوب الذي يحتوي على VEM.
3. قم بطرد الأنبوب سعة 15 مل عند 300 × جم لم....

النتائج

المهبل البشري مبطن بظهارة طبقية تغطي سدى كولاجينوس غني بالخلايا الليفية. لنمذجة ذلك ، تم إنشاء واجهة نسيجية عن طريق زراعة ظهارة مهبلية بشرية أولية وخلايا ليفية على جوانب متقابلة من غشاء مسامي شائع داخل جهاز رقاقة جهاز الموائع الدقيقة ثنائي القناة. تتم مراقبة تكوين ظهارة المهبل باستخدام ا.......

Discussion

النماذج السابقة في المختبر للمهبل البشري لا تكرر بأمانة هياكل الأنسجة المهبلية وتدفق السوائل والتفاعلات بين المضيف^{والممرض 19,22}. النماذج الحيوانية محدودة أيضا بسبب التباين بين الأنواع في الميكروبيوم والاختلافات في الدورة الشهرية^{أو الدورة ا?.......}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Steriflip	Millipore	SCGP00525	To degas media
2 channel chip	Emulate	BRK-S1-WER-24	Part of the two-channel Chip kit
200 μL barrier tips (or filter tips)	Thomas Scientific, SHARP	1159M40	Tips used for chip seeding
Activation Reagent 1 (or ER-1 powder)	Emulate	Chip S1 Basic Research kit-24PK	Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature -20 °C
Activation Reagent 2 (or ER-2 solution)	Emulate	Chip S1 Basic Research kit-24PK	Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature 4 °C
Adenine	Sigma Aldrich	A2786	Component of the Differentiation media
Brucella blood agar plates	VWR International Inc.	89405-032	with Hemin and Vitamin K; For the enumeration of Gardnerella vaginalis
Ca2+ and Mg2+ free DPBS (DPBS (-/-)	ScienCell	303	For washing cells
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C5670	Component of the Differentiation media
Calcium chloride (anhyd.)	Sigma Aldrich	499609	Component of HBSS (LB/+G)
Collagen I	Corning	354236	For the coating solution for HVEC
Collagen IV	Sigma Aldrich	C7521	For the coating solution for HVEC
Collagenase IV	Gibco	17104019	For the dissociation of cells from the Vagina Chips
Complete fibroblast medium	ScienCell	2301	Media for the culture of HUF
Complete vaginal epithelium medium	Lifeline	LL-0068	Media for the culture of HVEC
D-Glucose (dextrose)	Sigma Aldrich	158968	Component of HBSS (LB/+G)
DMEM (Low Glucose)	Thermofisher	12320-032	Component of the Differentiation media
Dynamic Flow Module (or Zoë)	Emulate	Zoë-CM1	Regulates the flow rate of the chips
Ham's F12	Thermofisher	11765-054	Component of the Differentiation media
Heat inactivated FBS	Thermofisher	10438018	Component of the Differentiation media
Human uterine fibroblasts	ScienCell	7040	HUF
Human vaginal epithelial cells	Lifeline	FC-0083	HVEC
Hydrocortisone	Sigma Aldrich	H0396	Component of the Differentiation media
ITES	Lonza	17-839Z	Component of the Differentiation media
L-glutamine	Thermofisher	25030081	Component of the Differentiation media
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	M2393	Component of HBSS (LB/+G)
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	M1880	Component of HBSS (LB/+G)
MRS agar plates	VWR International Inc.	89407-214	For enumeration of Lactobacillus
O-phosphorylethanolamine	Sigma Aldrich	P0503	Component of the Differentiation media
Pen/Strep	Thermofisher	15070063	Component of the Differentiation media
pH strips	Fischer-Scientific	13-640-520	For measurement of pH
Pods (1/chip)	Emulate	BRK-S1-WER-24	Part of the two-channel Chip kit
Poly-L-lysine	ScienCell	403	For the coating solution for HUFs
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911	Component of HBSS (LB/+G)
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P0662	Component of HBSS (LB/+G)
Sterile 80% glycerol	MP Biomedicals	113055034	For freezing bacterial samples
Triiodothyronine	Sigma Aldrich	T6397	Component of the Differentiation media
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma Aldrich	T8154	For counting live/dead cells
TrypLE Express	Thermofisher	12605010	For the dissociation of cells from the Vagina Chips
Trypsin Neutralizing Solution (TNS)	ScienCell	113	For neutralization of Trypsin
Trypsin/EDTA Solutiom (0.25%)	ScienCell	103	For cell dissociation
β-estradiol	Sigma Aldrich	E2257	Hormone for differentiation media