Modélisation de microenvironnements vaginaux sains et dysbiotiques dans un vagin humain sur puce

Résumé

Cet article décrit un protocole de création d’un dispositif de culture microfluidique de vagin sur puce (Vagina Chip) qui permet d’étudier les interactions de l’hôte humain avec un microbiome vaginal vivant dans des conditions microaérophiles. Cette puce peut être utilisée comme outil pour étudier les maladies vaginales ainsi que pour développer et tester des contre-mesures thérapeutiques potentielles.

Résumé

La santé des femmes, et en particulier les maladies de l’appareil reproducteur féminin, n’a pas reçu l’attention qu’elle mérite, même si un système reproducteur malsain peut entraîner des maladies potentiellement mortelles, l’infertilité ou des résultats défavorables pendant la grossesse. L’un des obstacles dans le domaine est qu’il y a eu une pénurie de modèles précliniques et expérimentaux qui imitent fidèlement la physiologie et la physiopathologie de la TRF. Les modèles in vitro et animaux actuels ne récapitulent pas entièrement les changements hormonaux, les conditions microaérobies et les interactions avec le microbiome vaginal. L’avènement de la technologie de culture microfluidique Organ-on-a-Chip (Organ Chip) qui peut imiter les interfaces tissu-tissu, la perfusion vasculaire, les flux de liquide interstitiel et le microenvironnement physique d’une sous-unité majeure d’organes humains peut potentiellement servir de solution à ce problème. Récemment, une puce vaginale humaine qui soutient la co-culture de consortiums microbiens vaginaux humains avec un épithélium vaginal humain primaire qui est également interfacé avec le stroma vaginal et connaît un flux de fluide dynamique a été développée. Cette puce reproduit les réponses physiologiques du vagin humain aux microbiomes sains et dysbiotiques. Un protocole détaillé pour la création de puces vaginales humaines a été décrit dans cet article.

Introduction

Un microbiome vaginal dominé par Lactobacillus spp. qui aide à maintenir un microenvironnement acide joue un rôle important dans le maintien de la santé reproductive féminine¹. Cependant, il peut parfois y avoir un changement dans la composition des communautés microbiennes qui composent le microbiome, ce qui entraîne une augmentation de la diversité des bactéries vaginales. Ces changements dysbiotiques, qui entraînent souvent le passage d’un état dominé par les Lactobacillus à un état dominé par des espèces bactériennes anaérobies plus diversifiées (par exemple, Gardnerella vaginalis), sont associés à diverses maladi....

Protocole

Cette recherche a été réalisée dans le respect des directives institutionnelles pour l’utilisation de cellules humaines. Les cellules ont été obtenues commercialement (voir Tableau des matériaux). Toutes les étapes doivent être effectuées de manière aseptique dans une enceinte de biosécurité (ESB). Utilisez uniquement des pointes de pipette à filtre (ou à barrière) pour ce protocole.

1. Culture de cellules épithéliales vaginales humaines

1. Chauffer 50 mL de milieu épithélial vaginal (VEM, voir le tableau des matières) à 37 °C.
2. Aliquote de 9 mL de VEM dans un tube de 15 mL.....

Discussion

Les modèles in vitro antérieurs du vagin humain ne reproduisent pas fidèlement les structures des tissus vaginaux, le flux de fluides et les interactions hôte-pathogène^19,22. Les modèles animaux sont également limités par les variations inter-espèces du microbiome et les différences dans le cycle œstral ou menstruel^19,22. Ce manuscrit décrit un protocole permettant de créer un modèl.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Steriflip	Millipore	SCGP00525	To degas media
2 channel chip	Emulate	BRK-S1-WER-24	Part of the two-channel Chip kit
200 μL barrier tips (or filter tips)	Thomas Scientific, SHARP	1159M40	Tips used for chip seeding
Activation Reagent 1 (or ER-1 powder)	Emulate	Chip S1 Basic Research kit-24PK	Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature -20 °C
Activation Reagent 2 (or ER-2 solution)	Emulate	Chip S1 Basic Research kit-24PK	Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature 4 °C
Adenine	Sigma Aldrich	A2786	Component of the Differentiation media
Brucella blood agar plates	VWR International Inc.	89405-032	with Hemin and Vitamin K; For the enumeration of Gardnerella vaginalis
Ca2+ and Mg2+ free DPBS (DPBS (-/-)	ScienCell	303	For washing cells
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C5670	Component of the Differentiation media
Calcium chloride (anhyd.)	Sigma Aldrich	499609	Component of HBSS (LB/+G)
Collagen I	Corning	354236	For the coating solution for HVEC
Collagen IV	Sigma Aldrich	C7521	For the coating solution for HVEC
Collagenase IV	Gibco	17104019	For the dissociation of cells from the Vagina Chips
Complete fibroblast medium	ScienCell	2301	Media for the culture of HUF
Complete vaginal epithelium medium	Lifeline	LL-0068	Media for the culture of HVEC
D-Glucose (dextrose)	Sigma Aldrich	158968	Component of HBSS (LB/+G)
DMEM (Low Glucose)	Thermofisher	12320-032	Component of the Differentiation media
Dynamic Flow Module (or Zoë)	Emulate	Zoë-CM1	Regulates the flow rate of the chips
Ham's F12	Thermofisher	11765-054	Component of the Differentiation media
Heat inactivated FBS	Thermofisher	10438018	Component of the Differentiation media
Human uterine fibroblasts	ScienCell	7040	HUF
Human vaginal epithelial cells	Lifeline	FC-0083	HVEC
Hydrocortisone	Sigma Aldrich	H0396	Component of the Differentiation media
ITES	Lonza	17-839Z	Component of the Differentiation media
L-glutamine	Thermofisher	25030081	Component of the Differentiation media
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	M2393	Component of HBSS (LB/+G)
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	M1880	Component of HBSS (LB/+G)
MRS agar plates	VWR International Inc.	89407-214	For enumeration of Lactobacillus
O-phosphorylethanolamine	Sigma Aldrich	P0503	Component of the Differentiation media
Pen/Strep	Thermofisher	15070063	Component of the Differentiation media
pH strips	Fischer-Scientific	13-640-520	For measurement of pH
Pods (1/chip)	Emulate	BRK-S1-WER-24	Part of the two-channel Chip kit
Poly-L-lysine	ScienCell	403	For the coating solution for HUFs
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911	Component of HBSS (LB/+G)
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P0662	Component of HBSS (LB/+G)
Sterile 80% glycerol	MP Biomedicals	113055034	For freezing bacterial samples
Triiodothyronine	Sigma Aldrich	T6397	Component of the Differentiation media
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma Aldrich	T8154	For counting live/dead cells
TrypLE Express	Thermofisher	12605010	For the dissociation of cells from the Vagina Chips
Trypsin Neutralizing Solution (TNS)	ScienCell	113	For neutralization of Trypsin
Trypsin/EDTA Solutiom (0.25%)	ScienCell	103	For cell dissociation
β-estradiol	Sigma Aldrich	E2257	Hormone for differentiation media