Modelado de microambientes vaginales sanos y disbióticos en una vagina humana en un chip

Resumen

Este artículo describe un protocolo para crear un dispositivo de cultivo microfluídico de vagina en un chip (Vagina Chip) que permite el estudio de las interacciones del huésped humano con un microbioma vaginal vivo en condiciones microaerofílicas. Este chip se puede utilizar como herramienta para investigar enfermedades vaginales, así como para desarrollar y probar posibles contramedidas terapéuticas.

Resumen

La salud de la mujer, y en particular las enfermedades del tracto reproductivo femenino, no han recibido la atención que merecen, a pesar de que un sistema reproductivo poco saludable puede provocar enfermedades potencialmente mortales, infertilidad o resultados adversos durante el embarazo. Una barrera en el campo es que ha habido una escasez de modelos preclínicos y experimentales que imiten fielmente la fisiología y la fisiopatología de la FRT. Los modelos in vitro y animales actuales no recapitulan completamente los cambios hormonales, las condiciones microaeróbicas y las interacciones con el microbioma vaginal. El advenimiento de la tecnología de cultivo microfluídico Organ-on-a-Chip (Organ Chip) que puede imitar las interfaces tejido-tejido, la perfusión vascular, los flujos de líquido intersticial y el microambiente físico de una subunidad importante de órganos humanos puede servir potencialmente como una solución a este problema. Recientemente, se ha desarrollado un chip de vagina humana que admite el cocultivo de consorcios microbianos vaginales humanos con el epitelio vaginal humano primario que también está interconectado con el estroma vaginal y experimenta un flujo dinámico de fluidos. Este chip replica las respuestas fisiológicas de la vagina humana a microbiomas sanos y disbióticos. En este artículo se ha descrito un protocolo detallado para crear chips de vagina humana.

Introducción

Un microbioma vaginal dominado por Lactobacillus spp. que ayuda a mantener un microambiente ácido desempeña un papel importante en el mantenimiento de la salud reproductiva femenina¹. Sin embargo, a veces puede haber un cambio en la composición de las comunidades microbianas que componen el microbioma, lo que resulta en un aumento en la diversidad de bacterias vaginales. Estos cambios disbióticos, que a menudo resultan en un cambio de un estado dominado por Lactobacillus a uno dominado por especies bacterianas anaerobias más diversas (por ejemplo, Gardnerella vaginalis), se asocian con diversas enfermedades del sistema reproductivo, como vaginosis bacteriana, vaginitis atrófica, infección del tracto urinario, candidiasis vulvovaginal, uretritis y corioamnionitis 2,3,4,5 . Estas enfermedades, a su vez, aumentan las posibilidades de que la mujer adquiera enfermedades de transmisión sexual y enfermedad inflamatoria pélvica 6,7,8,9. También representan un mayor riesgo de parto prematuro y abortos espontáneos en mujeres embarazadas ^10,11,12 y también se han implicado en la infertilidad 13,14,15,16.

A pesar de que se han realizado esfuerzos para modelar la disbiosis vaginal utilizando células epiteliales vaginales cultivadas en sistemas de cultivo estáticos, bidimensionales (2D)^17,18, no imitan eficazmente la fisiología y complejidad del microambiente vaginal¹⁹. También se han utilizado modelos animales para estudiar la disbiosis vaginal; Sin embargo, sus fases menstruales y las interacciones huésped-microbioma difieren mucho de las de los humanos, por lo que la relevancia fisiológica de los resultados de estos estudios sigue sin estar clara 19,20,21. Para contrarrestar estos problemas, también se han utilizado organoides y modelos de insertos Transwell de tejido vaginal humano para estudiar las interacciones huésped-patógeno en la FRT 19,22,23,24. Pero debido a que estos son cultivos estáticos, solo pueden soportar el cocultivo de células humanas con microbios vivos durante un corto período de tiempo (<16-24 h), y carecen de muchas otras características físicas potencialmente importantes del microambiente vaginal humano, como la producción de moco y el flujo de fluidos²².

Los chips de órganos son sistemas de cultivo microfluídico tridimensionales (3D) que contienen uno o más microcanales huecos paralelos revestidos por células vivas cultivadas bajo flujo de fluido dinámico. Los chips de dos canales permiten la recreación de interfaces tejido-tejido a nivel de órgano mediante el cultivo de diferentes tipos de células (por ejemplo, epitelio y fibroblastos estromales o epitelio y endotelio vascular) en lados opuestos de una membrana porosa que separa los dos canales paralelos (Figura 1). Ambos tejidos pueden exponerse de forma independiente al flujo de fluidos, y también pueden experimentar condiciones microaeróbicas para permitir el cocultivo con un microbioma complejo 25,26,27,28. Este enfoque se aprovechó recientemente para desarrollar un chip de vagina humana revestido por epitelio vaginal primario sensible a las hormonas interconectado con fibroblastos estromales subyacentes, que mantiene una baja concentración fisiológica de oxígeno en la luz epitelial y permite el cocultivo con microbiomas sanos y disbióticos durante al menos 3 días in vitro²⁹. Se demostró que el Vagina Chip podría utilizarse para estudiar la colonización por consorcios óptimos (sanos) de L. crispatus y detectar la inflamación y las lesiones causadas por consorcios no óptimos (no sanos) que contienen G. vaginalis. Aquí, describimos en detalle los métodos que se utilizan para crear el chip de la vagina humana, así como para establecer comunidades bacterianas sanas y disbióticas en el chip.

Protocolo

Esta investigación se realizó de acuerdo con los lineamientos institucionales para el uso de células humanas. Las células se obtuvieron comercialmente (ver Tabla de Materiales). Todos los pasos deben realizarse de forma aséptica en una cabina de bioseguridad (BSC). Utilice únicamente puntas de pipeta de filtro (o barrera) para este protocolo.

1. Cultivo de células epiteliales vaginales humanas

1. Calentar 50 mL de medio epitelial vaginal (VEM, ver Tabla de Materiales) a 37 °C.
2. Alícuota de 9 mL de VEM a un tubo de 15 mL. Luego, descongele un vial de células epiteliales vaginales humanas (HVEC) y agréguelo al tubo que contiene VEM.
3. Centrifugar el tubo de 15 mL a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT) y aspirar el sobrenadante, dejando atrás el pellet.
4. Vuelva a suspender suavemente el pellet en 2 mL de VEM y agregue 1 mL a cada uno de los dos matraces T75 que contengan 14 mL de VEM.
5. Incubar los matraces a 37 °C con 5% de CO_2. Cambie el VEM cada 2 días hasta que los HVEC tengan aproximadamente un 70% de confluente (aproximadamente 5 días).

2. Cultivo de células de fibroblastos uterinos humanos

1. Prepare 10 mL de 15 μg/mL de solución de poli-L-lisina (PLL) en agua bidestilada (ddH₂O). Añadir 5 mL de solución de PLL a cada uno de los dos matraces T75 e incubar a 37 °C durante 1 h.
2. Calentar 50 mL de medio fibroblasto (FM, ver Tabla de Materiales) a 37 °C.
3. Aspirar la solución de PLL y lavar cada matraz con 5 mL de ddH₂O.
4. Alícuota de 9 mL de FM a un tubo de 15 mL y descongelar un vial de fibroblastos uterinos humanos (HUF).
5. Añada los HUF al tubo de 15 ml que contiene FM.
6. Centrifugar el tubo de 15 mL a 300 x g durante 5 min a RT y aspirar el sobrenadante, dejando atrás el pellet de la célula.
7. Vuelva a suspender suavemente el pellet en 2 mL de FM y agregue 1 mL a cada uno de los dos matraces T75 que contienen 14 mL de FM.
8. Incubar los matraces a 37 °C con 5% de CO₂ hasta que las células tengan aproximadamente un 70% de confluente mientras se cambia el medio cada 2 días.

3. Activación de virutas y recubrimiento de canales

1. Desgasificación de las virutas (obtenidas comercialmente, ver Tabla de Materiales) durante 30 min en un desecador al vacío.
2. Deje que el reactivo de activación 1 (AR-1) y el reactivo de activación 2 (AR-2) (consulte la tabla de materiales) se equilibren a RT durante 15 minutos sin quitar su embalaje.
3. Envuelva un tubo cónico de 15 ml en papel de aluminio para protegerlo de la luz. Agregue lentamente 1 mL de solución de AR-2 a las paredes del vial de AR-1 y mezcle bien. Transfiera la mezcla al tubo de 15 ml envuelto en papel de aluminio.
4. Agregue repetidamente la solución de AR-2 al vial de AR-1 en incrementos de 1 mL hasta que el polvo de AR-1 se haya lavado completamente del vial.
5. Rellene la solución reconstituida de AR-1 a 10 ml con la solución de AR-2.
6. Agregue 200 μL de esta solución a la entrada del canal apical de cada chip mientras aspira desde la salida (Figura 1A). Repita para el canal basal. Mantenga la pipeta perpendicular al chip mientras agrega la solución para mantener un sello hermético con un flujo sin obstrucciones.
7. Repita el paso 3.6 para todas las fichas.
8. Revisa todas las fichas en busca de burbujas. Elimine las burbujas añadiendo más solución a los canales afectados.
9. Aspire todo el exceso de solución AR-1 de la superficie del chip evitando las entradas y salidas de los canales.
10. Coloque las papas fritas en una placa de Petri de 150 mm e inserte esta placa descubierta en una caja de luz ultravioleta.
11. Coloque la caja de luz ultravioleta en la parte posterior del BSC y deje las fichas bajo luz ultravioleta constante durante 30 minutos. El color de la solución en las virutas cambiará de rosa oscuro a caoba.
12. Lave cada canal agregando 200 μL de solución AR-2 a la entrada mientras aspira simultáneamente desde la salida.
13. Lave cada canal dos veces añadiendo 200 μL de DPBS frío (-/-) a la entrada mientras aspira simultáneamente desde la salida.
14. Prepare el recubrimiento del canal apical (200 μg/mL de colágeno I y 30 μg/mL de colágeno IV en DMEM) (ver Tabla de Materiales). Mantener en hielo.
15. Prepare el recubrimiento del canal basal (15 μg/mL PLL y 200 μg/mL de mezcla de colágeno I en DMEM). Mantener en hielo.
16. Agregue 200 μL de recubrimiento de canal basal a la entrada del canal basal. Enchufe el tomacorriente con una punta P200 cuando aparezca la solución de recubrimiento en el tomacorriente. Dispense la solución hasta que los volúmenes de las puntas de entrada y salida sean iguales y, a continuación, suelte la punta de la pipeta de la pipeta, dejando la punta en la entrada.
17. Del mismo modo, agregue 200 μL de recubrimiento de canal apical al canal apical.
18. Aspire el exceso de solución de la superficie de la viruta.
19. Revisa todas las fichas en busca de burbujas. Elimine las burbujas agregando más recubrimiento de canal a los canales afectados.
20. Incubar las patatas fritas durante la noche en una placa de Petri de 150 mm a 37 °C con 5% de_CO2.

4. Canal basal del chip de siembra con HUF

1. Observe diariamente el crecimiento de HUF en el matraz bajo un microscopio.
2. Una vez que los cultivos de HUF tienen una confluente del 70%-90% (~3 días después de la siembra), se calientan 25 mL de FM, 5 mL de Ca²⁺/Mg²⁺ DPBS libres (DPBS (-/-), 10 mL de tripsina/EDTA y 15 mL de solución neutralizante de tripsina (TNS, ver Tabla de Materiales) a 37 °C.
3. Aspire el medio de los matraces. Lavar con 5 mL de DPBS (-/-) y volver a aspirar.
4. Añadir 4 mL de tripsina-EDTA a cada matraz e incubar a 37 °C durante 3-5 min hasta que las células se desprendan.
5. Agregue 6 mL de TNS a cada matraz y transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mL.
6. Mezcle bien la suspensión con una pipeta y tome una alícuota de 10 μL para el recuento de células. Mezcle 10 μL de suspensión celular con 10 μL de azul de tripán y cuente con un hemocitómetro.
7. Centrifugar la suspensión de la célula a 300 x g durante 5 min en RT. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en FM caliente hasta una concentración final de 7,5 x 10⁵ células/mL.
8. Lavar el canal basal con 200 μL de FM.
9. Calentar 15 mL de VEM a 37 °C. Lavar el canal apical con 200 μL de VEM.
10. Añada 200 μL de VEM completo a la entrada del canal apical mientras enchufa la salida con una punta de pipeta. Dispense el medio hasta que los volúmenes de las puntas de entrada y salida sean iguales y, a continuación, suelte la punta de la pipeta de la pipeta, dejando la punta en la entrada. Mantenga el canal superior lleno y taponado tanto en la entrada como en la salida.
11. Pipetear lentamente 50 μL de suspensión de células HUF en la entrada del canal basal mientras se aspira simultáneamente desde la salida. Retire la punta de la pipeta de la entrada cuando queden ~2 μL de la suspensión celular en la punta de la pipeta sin presionar ni soltar el émbolo de la pipeta para evitar la formación de burbujas. Tape la entrada y la salida con las puntas de las pipetas.
12. Revisa si hay burbujas bajo un microscopio. Si están presentes, lave el canal basal con FM y repita el paso 4.11.
13. Dé la vuelta a las patatas fritas obstruidas en una gradilla de tubos de 15 ml e incube a 37 °C con 5% de CO₂ durante 1 h. Observe las virutas después de la incubación y verifique la adhesión de las células.
14. Enchufe la salida del canal basal con una punta de pipeta. Añada 200 μL de FM a la entrada del canal basal sin empujar hacia abajo el émbolo de la pipeta. Suelte la punta de la pipeta y deje que el medio fluya libremente a través del canal hasta la punta de la pipeta de salida mediante flujo gravitacional.
15. Incubar las patatas fritas sembradas con HUF durante la noche a 37 °C con 5% de_CO2.

5. Chip de siembra del canal apical con células epiteliales vaginales

1. Calentar 50 mL de VEM a 37 °C.
2. Preparar el recubrimiento del canal apical (200 μg/mL de colágeno I en DMEM). Mantener en hielo.
3. Enchufe la salida del canal apical con una punta de pipeta.
4. Agregue 200 μL de recubrimiento de canal apical a la entrada del canal apical. Dispense la solución de recubrimiento apical hasta que los volúmenes de las puntas de entrada y salida sean iguales y, a continuación, suelte la punta de la pipeta de la pipeta, dejando la punta en la entrada.
5. Aspire el exceso de solución de la superficie del chip.
6. Incubar las patatas fritas a 37 °C con 5% de CO₂ durante 1 h.
7. Después de 1 h, lave el recubrimiento del canal apical agregando 200 μL de VEM a la entrada del canal apical mientras aspira desde la salida.
8. Verifique el crecimiento de HVEC bajo un microscopio para ver si hay una confluencia de ~70%-90%.
9. Si las células son 70%-90% confluentes, calentar 6 mL de medio de células epiteliales vaginales completas y 4 mL de tripsina/EDTA por matraz, a 37 °C.
10. Aspire el medio del matraz HVEC y lávese con 5 mL de DPBS (-/-), luego aspire.
11. Añadir 4 mL de tripsina a cada matraz e incubar a 37 °C con 5% de CO₂ durante 3-5 min hasta que las células se desprendan.
12. Añadir 6 mL de VEM al matraz para inactivar la tripsina y transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mL.
13. Mezcle bien la suspensión con una pipeta y tome una alícuota de 10 μL para el recuento de células. Mezcle 10 μL de suspensión celular con 10 μL de azul de tripán y cuente con un hemocitómetro.
14. Centrifugar la suspensión de la célula a 300 x g durante 5 min en RT. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en VEM hasta una concentración final de 3,5-4 millones de células/mL.
15. Calentar 25 mL de FM a 37 °C.
16. Enchufe la salida del canal apical con una punta de pipeta. Pipetear lentamente al menos 40 μL de suspensión de células HVEC en la entrada del canal apical. Dispense la suspensión celular hasta que los volúmenes de las puntas de entrada y salida sean iguales y, a continuación, suelte la punta de la pipeta de la pipeta, dejando la punta en la entrada. Mantenga el canal basal lleno de FM y enchufado tanto en la entrada como en la salida.
17. Aspire con cuidado el exceso de medio en la superficie de las virutas y verifique si hay burbujas bajo un microscopio. Si están presentes, repita el paso 5.16.
18. Coloque las patatas fritas en una placa de Petri grande e incube a 37 °C con 5% de_CO2 durante la noche.
19. Al día siguiente, observe los chips bajo un microscopio para la unión de células.
20. Retire las puntas de pipeta de las entradas y salidas de los canales apical y basal.
21. Conecte la salida del canal basal con una punta de pipeta y añada 200 μL de FM a la entrada del canal basal sin empujar hacia abajo el émbolo de la pipeta. Suelte la punta de la pipeta y permita que el medio fluya libremente a través del canal hasta la punta de la pipeta de salida mediante flujo gravitacional.
22. Repita el paso 5.21 para el canal apical utilizando VEM.
23. Incubar las patatas fritas de doble siembra a 37 °C con 5% de CO₂ durante 24 h.

6. Conectar chips a vainas y diferenciar células epiteliales vaginales

1. Alícuota 50 mL de FM y VEM para separar tubos cónicos de 50 mL y calentar a 37 °C.
2. Desgasifique los medios FM y VEM calentados a 37 °C bajo un vacío estéril durante 5 min.
3. Desinfecte y limpie las bandejas para el Módulo de Flujo Dinámico (DFM, consulte la Tabla de Materiales). Retire las vainas del empaque y colóquelas en las bandejas.
4. Añadir 2 mL de VEM desgasificado al depósito de entrada apical (depósito superior derecho; Figura 1B). Agregue medio a lo largo de las paredes del depósito para evitar la formación de burbujas.
5. Agregue 3 mL de FM desgasificado al depósito de entrada basal (depósito superior izquierdo, Figura 1B). Agregue medio a lo largo de las paredes del depósito para evitar la formación de burbujas.
6. Añadir 500 μL de VEM desgasificado al depósito de salida apical (depósito inferior derecho, Figura 1B). Incline la cápsula de modo que el medio cubra toda la superficie inferior del depósito.
7. Añadir 500 μL de FM desgasificado al depósito de salida basal (depósito inferior izquierdo, Figura 1B). Incline la cápsula de modo que el medio cubra toda la superficie inferior del depósito.
8. Deslice las bandejas que contienen pods en DFM y ejecute el ciclo Prime dos veces. Compruebe si hay gotas que salgan de los puertos de la parte inferior de cada cápsula.
9. Si no se forma una gota después de 4 ciclos "Prime", haga contacto directo con el puerto dentro del depósito de salida de la cápsula (Figura 1B) y pipetee 200 μL del medio respectivo para permitir que el medio fluya entre el depósito y el canal. A esto se le llama "cebado manual".
10. Retire las puntas de pipeta de las virutas y coloque una gota del medio correspondiente sobre todos los puertos de cada viruta.
11. Deslice las papas fritas en las vainas y colóquelas en bandejas.
12. Aspire cualquier medio en la superficie de las virutas y deslice cada bandeja en un DFM.
13. Establezca los siguientes parámetros en el DFM como: Superior e Inferior - Líquido; Flujo apical (canal superior): 15 μL/h; Flujo basal (canal inferior): 30 μL/h; Estiramiento = 0%; Frecuencia = 0 Hz.
14. Ejecute el ciclo de regulación en el DFM y permita el flujo durante la noche.
15. Después de 24 h, cambie la configuración de flujo a 0 μL/h para el canal apical y mantenga el canal basal a un caudal de 30 μL/h durante otras 24 h.
16. Prepare 500 mL de medio de diferenciación (MS) agregando 4 mM de L-glutamina, 20 mM de hidrocortisona, 1x ITES, 20 nM de triyodotironina, 100 μM de O-fosforil etanolamina, 180 μM de adenina, 3,2 mM de cloruro de calcio, 2% de FBS inactivado por calor, 1% de Pen-estreptococo y 120 mL de medio F-12 de Ham a DMEM de baja glucosa (ver Tabla de materiales) y filtro-esterilización.
17. Calentar 50 mL de MS a 37 °C.
18. Añadir 20 μL de 10 μM de estradiol (ver Tabla de Materiales) a los 50 mL de MS, mezclar bien y desgasificar bajo un vacío estéril durante 5 min.
19. Calentar 50 mL de VEM a 37 °C en un baño de agua y desgasificar bajo un vacío estéril durante 5 min.
20. Retire las bandejas del DFM, colóquelas en un BSC y aspire los medios de las cápsulas, evitando los puertos de los depósitos (Figura 1A). A continuación, agregue 2 mL de VEM al reservorio de entrada del canal apical y 3 mL de MS al reservorio de entrada del canal basal.
21. Regrese las bandejas al DFM y ajuste el flujo del canal apical a 15 μL/h y el flujo del canal basal a 30 μL/h.
22. Deje que el DFM fluya durante 4-7 h. A continuación, detenga el flujo del canal apical ajustándolo a 0 μL/h. Deje que el flujo del canal basal continúe a 30 μL/h.
23. Cambie el medio siguiendo los pasos 6.16-6.19 cada 48 h.
24. Fluya el medio de forma intermitente en el canal apical durante 4-7 h cada día durante 5 días adicionales siguiendo los pasos 6.20-6.21.
25. Prepare la solución salina equilibrada de Hanks con baja capacidad tampón con medios de glucosa (HBSS (LB/+G)) añadiendo 1,26 mM de cloruro de calcio, 0,49 mM de cloruro de magnesio hexahidratado, 0,406 mM de sulfato de magnesio, 5,33 mM de cloruro de potasio, 137,93 mM de cloruro de sodio, 0,441 mM de fosfato de potasio monobásico y 5,55 mM de D-glucosa a dd H₂O (ver Tabla de Materiales); pH 4,8.
26. Prepare 500 mL de MS libre de estreptococos agregando 4 mM de L-glutamina, 20 mM de hidrocortisona, 1x ITES, 20 nM de triyodotironina, 100 μM de O-fosforilo etanolamina, 180 μM de adenina, 3.2 mM de cloruro de calcio, 2% de FBS inactivado por calor y 120 mL de medios F-12 de Ham a DMEM de baja glucosa y filtro-esterilización.
27. En el día 6, reemplace el medio del canal apical con (HBSS (LB/+G)) y el medio del canal basal con DM sin estreptococos en Pluma siguiendo los pasos 6.16-6.19.
28. Ajuste el flujo en el DFM a 15 μL/h para el canal apical y 30 μL/h para el canal basal durante 24 h antes de proceder con la inoculación bacteriana.

7. Inoculación bacteriana de chips diferenciados

NOTA: Realice los siguientes pasos en un laboratorio y BSC que cumplan con las regulaciones para el manejo de microbios.

1. Calcular las UFC/mL de cada cepa bacteriana a incluir en el inóculo. Mezcle la cantidad requerida de cada cepa bacteriana para totalizar hasta ~ 5 x 10⁶ UFC / mL.
2. Centrifugar la mezcla a 7.000 x g durante 7 min a 4 °C y retirar con cuidado el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en (HBSS (LB/+G)). Este será el inóculo bacteriano.
3. Separe las fichas de las vainas. Tape la salida del canal basal con una punta de pipeta y añada 200 μL de DM sin estreptococos en pluma a la entrada del canal basal sin empujar hacia abajo el émbolo de la pipeta. Suelte la punta de la pipeta y deje que el medio fluya libremente a través del canal hasta la salida mediante flujo gravitacional.
4. Añadir 37 μL del inóculo bacteriano a la entrada del canal apical, mientras se aspira desde la salida. Cuando queden unos 2 μL en la punta de la pipeta, extraiga la punta y tape la entrada y salida del canal apical con las puntas de la pipeta.
5. Para los chips de control (no inoculados), repita el paso 7.4 con 37 μL de (HBSS (LB/+G)).
6. Aspire cualquier medio en la superficie del chip. Coloque las fichas en una placa de Petri de 150 mm e incube a 37 °C con 5% de CO₂ durante 24 h.
7. Coloque las cápsulas (sin virutas) en las bandejas y colóquelas en la incubadora a 37 °C con 5% de CO₂ durante 24 h.
8. Calentar 50 mL de (HBSS (LB/+G)) y 50 mL de MS libre de estreptococos en pluma a 37 °C.
9. Añadir 20 μL de 10 μM de estradiol a los 50 mL de MS sin estreptococos Pen, mezclar bien y desgasificar al vacío estéril durante 5 min. Desgasifique el (HBSS (LB/+G)) al vacío durante 5 min.
10. Aspire con cuidado los medios en las cápsulas evitando los puertos de entrada y salida del depósito.
11. Añadir 3 mL de desgasificado (HBSS (LB/+G)) al depósito de la cápsula de entrada apical y 500 μL de desgasificado (HBSS (LB/+G)) al depósito de la cápsula de salida apical.
12. Añadir 3 mL de MS sin estreptococos en pluma desgasificado al depósito de la cápsula de entrada basal y 500 μl de MS sin antibióticos desgasificado al depósito de la cápsula de salida basal.
13. Deslice las bandejas con los pods (sin los chips) en el DFM y ejecute el ciclo Prime dos veces. Compruebe si salen gotas de cada puerto en la parte inferior del pod.
    NOTA: Si no se forma una gota después de 4 ciclos "Prime", haga contacto directo con el puerto dentro del depósito de salida de la cápsula (Figura 1B) y pipetee 200 μL del medio respectivo para permitir que el medio fluya entre el depósito y el canal.
14. Retire las puntas de pipeta de las virutas y coloque una gota del medio correspondiente sobre todas las entradas y salidas de los canales.
15. Deslice las papas fritas en las vainas y colóquelas en bandejas.
16. Aspire los medios en los depósitos de las vainas de salida apical y basal y cualquier medio en la superficie de las virutas. A continuación, deslice las bandejas en el DFM.
17. Configure los siguientes parámetros en el DFM: Superior e inferior - Líquido; Flujo apical (superior) - 40 μL/h; Flujo basal (inferior): 40 μL/h; Estiramiento - 0%; Frecuencia - 0 Hz. Ejecute el ciclo Regular.
18. Detener el flujo después de 4 h y recoger el efluente, es decir, los medios en los depósitos de salida apical y basal.
19. Mida y registre los volúmenes de efluentes.
20. Vuelva a colocar las virutas en el DFM y ajuste el caudal apical a 0 μL/h y el flujo basal a 30 μL/h. Inicie el flujo para que se ejecute durante la noche.
21. Alícuota el efluente recolectado para varios ensayos planificados y almacenarlos a temperaturas adecuadas.
    NOTA: Para la medición de UFC, agregue glicerol hasta una concentración final del 16% y almacene inmediatamente a -80 °C.
22. Aspire el medio solo en los depósitos de salida basal y ajuste los caudales apical y basal a 40 μL/h en el DFM. Inicie el flujo durante 4 h y repita los pasos 7.18-7.21. Esta será la recolección de efluentes durante 48 h.
23. Repita el paso 7.22 durante 72 h o hasta que finalice el experimento.
24. Al final del experimento, recoja los efluentes siguiendo los pasos 7.18-7.19.
25. Prepare la solución de digestión añadiendo 1 mg/mL de colagenasa IV en TrypLE express. Calentar 10 mL de solución de digestión a 37 °C.
26. Conecte el puerto de salida del canal basal con una punta de pipeta. Añadir 100 μL de solución de digestión al canal basal. Mezclar bien y, con una pipeta, recoger toda la solución del canal en un tubo etiquetado como 'Tubo B'.
27. Enchufe el orificio de salida del canal apical con una punta de pipeta. Añadir 100 μL de solución de digestión al canal apical. Mezcle bien y, con una pipeta, recoja toda la solución del canal en un tubo etiquetado como 'Tubo A'.
28. Añada otros 100 μL de la solución de digestión a las entradas de los canales apical y basal mientras tapa las salidas con las puntas de las pipetas. Incubar las virutas y los tubos A y B a 37 °C durante 1-1,5 h.
29. Mezcle bien el contenido de la digestión dentro de los canales utilizando las puntas taponadas ya colocadas en las entradas y salidas. Recoger el contenido de los canales apical y basal a los tubos A y B, respectivamente. Se trata de los digieres apical y basal.
30. Cuente las células en el tubo A usando un hemocitómetro. Además, elimine una alícuota de los resúmenes de chip para la medición de UFC siguiendo el paso 7.21.

8. Análisis de efluentes y digestos de virutas

1. Para la enumeración de bacterias de los efluentes y digeridos, diluir en serie los efluentes o digerentes en DPBS estériles (-/-) y placa en una placa de medio adecuada, incubar a 37 °C durante 24-48 h y contar las colonias en la placa.
2. Para la medición del pH, tome 10 μL del efluente de 72 h inmediatamente después de la recolección y use una tira de pH para medir el pH del efluente.
3. Para el análisis de las citocinas, utilice los efluentes para detectar citocinas específicas utilizando el ensayo basado en Luminex, ELISA o cualquier otra técnica aplicable^29,30.

Resultados

La vagina humana está revestida por un epitelio estratificado que se superpone a un estroma colágeno rico en fibroblastos. Para modelar esto, se creó una interfaz de tejido mediante el cultivo de epitelio vaginal humano primario y fibroblastos en lados opuestos de una membrana porosa común dentro de un dispositivo Organ Chip microfluídico de dos canales. La formación del epitelio vaginal se controla mediante imágenes microscópicas de campo claro, que revelan la formación de una lámina continua de células que f...

Discusión

Los modelos in vitro anteriores de la vagina humana no replican fielmente las estructuras del tejido vaginal, el flujo de fluidos y las interacciones huésped-patógeno^19,22. Los modelos animales también están limitados por la variación del microbioma entre especies y las diferencias en el ciclo estral o menstrual^19,22. Este manuscrito describe un protocolo para crear un modelo de chip de órg...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Steriflip	Millipore	SCGP00525	To degas media
2 channel chip	Emulate	BRK-S1-WER-24	Part of the two-channel Chip kit
200 μL barrier tips (or filter tips)	Thomas Scientific, SHARP	1159M40	Tips used for chip seeding
Activation Reagent 1 (or ER-1 powder)	Emulate	Chip S1 Basic Research kit-24PK	Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature -20 °C
Activation Reagent 2 (or ER-2 solution)	Emulate	Chip S1 Basic Research kit-24PK	Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature 4 °C
Adenine	Sigma Aldrich	A2786	Component of the Differentiation media
Brucella blood agar plates	VWR International Inc.	89405-032	with Hemin and Vitamin K; For the enumeration of Gardnerella vaginalis
Ca2+ and Mg2+ free DPBS (DPBS (-/-)	ScienCell	303	For washing cells
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C5670	Component of the Differentiation media
Calcium chloride (anhyd.)	Sigma Aldrich	499609	Component of HBSS (LB/+G)
Collagen I	Corning	354236	For the coating solution for HVEC
Collagen IV	Sigma Aldrich	C7521	For the coating solution for HVEC
Collagenase IV	Gibco	17104019	For the dissociation of cells from the Vagina Chips
Complete fibroblast medium	ScienCell	2301	Media for the culture of HUF
Complete vaginal epithelium medium	Lifeline	LL-0068	Media for the culture of HVEC
D-Glucose (dextrose)	Sigma Aldrich	158968	Component of HBSS (LB/+G)
DMEM (Low Glucose)	Thermofisher	12320-032	Component of the Differentiation media
Dynamic Flow Module (or Zoë)	Emulate	Zoë-CM1	Regulates the flow rate of the chips
Ham's F12	Thermofisher	11765-054	Component of the Differentiation media
Heat inactivated FBS	Thermofisher	10438018	Component of the Differentiation media
Human uterine fibroblasts	ScienCell	7040	HUF
Human vaginal epithelial cells	Lifeline	FC-0083	HVEC
Hydrocortisone	Sigma Aldrich	H0396	Component of the Differentiation media
ITES	Lonza	17-839Z	Component of the Differentiation media
L-glutamine	Thermofisher	25030081	Component of the Differentiation media
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	M2393	Component of HBSS (LB/+G)
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	M1880	Component of HBSS (LB/+G)
MRS agar plates	VWR International Inc.	89407-214	For enumeration of Lactobacillus
O-phosphorylethanolamine	Sigma Aldrich	P0503	Component of the Differentiation media
Pen/Strep	Thermofisher	15070063	Component of the Differentiation media
pH strips	Fischer-Scientific	13-640-520	For measurement of pH
Pods (1/chip)	Emulate	BRK-S1-WER-24	Part of the two-channel Chip kit
Poly-L-lysine	ScienCell	403	For the coating solution for HUFs
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911	Component of HBSS (LB/+G)
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P0662	Component of HBSS (LB/+G)
Sterile 80% glycerol	MP Biomedicals	113055034	For freezing bacterial samples
Triiodothyronine	Sigma Aldrich	T6397	Component of the Differentiation media
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma Aldrich	T8154	For counting live/dead cells
TrypLE Express	Thermofisher	12605010	For the dissociation of cells from the Vagina Chips
Trypsin Neutralizing Solution (TNS)	ScienCell	113	For neutralization of Trypsin
Trypsin/EDTA Solutiom (0.25%)	ScienCell	103	For cell dissociation
β-estradiol	Sigma Aldrich	E2257	Hormone for differentiation media