Modelado de microambientes vaginales sanos y disbióticos en una vagina humana en un chip

Resumen

Este artículo describe un protocolo para crear un dispositivo de cultivo microfluídico de vagina en un chip (Vagina Chip) que permite el estudio de las interacciones del huésped humano con un microbioma vaginal vivo en condiciones microaerofílicas. Este chip se puede utilizar como herramienta para investigar enfermedades vaginales, así como para desarrollar y probar posibles contramedidas terapéuticas.

Resumen

La salud de la mujer, y en particular las enfermedades del tracto reproductivo femenino, no han recibido la atención que merecen, a pesar de que un sistema reproductivo poco saludable puede provocar enfermedades potencialmente mortales, infertilidad o resultados adversos durante el embarazo. Una barrera en el campo es que ha habido una escasez de modelos preclínicos y experimentales que imiten fielmente la fisiología y la fisiopatología de la FRT. Los modelos in vitro y animales actuales no recapitulan completamente los cambios hormonales, las condiciones microaeróbicas y las interacciones con el microbioma vaginal. El advenimiento de la tecnología de cultivo microfluídico Organ-on-a-Chip (Organ Chip) que puede imitar las interfaces tejido-tejido, la perfusión vascular, los flujos de líquido intersticial y el microambiente físico de una subunidad importante de órganos humanos puede servir potencialmente como una solución a este problema. Recientemente, se ha desarrollado un chip de vagina humana que admite el cocultivo de consorcios microbianos vaginales humanos con el epitelio vaginal humano primario que también está interconectado con el estroma vaginal y experimenta un flujo dinámico de fluidos. Este chip replica las respuestas fisiológicas de la vagina humana a microbiomas sanos y disbióticos. En este artículo se ha descrito un protocolo detallado para crear chips de vagina humana.

Introducción

Un microbioma vaginal dominado por Lactobacillus spp. que ayuda a mantener un microambiente ácido desempeña un papel importante en el mantenimiento de la salud reproductiva femenina¹. Sin embargo, a veces puede haber un cambio en la composición de las comunidades microbianas que componen el microbioma, lo que resulta en un aumento en la diversidad de bacterias vaginales. Estos cambios disbióticos, que a menudo resultan en un cambio de un estado dominado por Lactobacillus a uno dominado por especies bacterianas anaerobias más diversas (por ejemplo, Gardnerella vaginalis), se asocian con diversas enfermedades del sistem....

Protocolo

Esta investigación se realizó de acuerdo con los lineamientos institucionales para el uso de células humanas. Las células se obtuvieron comercialmente (ver Tabla de Materiales). Todos los pasos deben realizarse de forma aséptica en una cabina de bioseguridad (BSC). Utilice únicamente puntas de pipeta de filtro (o barrera) para este protocolo.

1. Cultivo de células epiteliales vaginales humanas

1. Calentar 50 mL de medio epitelial vaginal (VEM, ver Tabla de Materiales) a 37 °C.
2. Alícuota de 9 mL de VEM a un tubo de 15 mL. Luego, descongele un vial de células epiteliales vagin....

Discusión

Los modelos in vitro anteriores de la vagina humana no replican fielmente las estructuras del tejido vaginal, el flujo de fluidos y las interacciones huésped-patógeno^19,22. Los modelos animales también están limitados por la variación del microbioma entre especies y las diferencias en el ciclo estral o menstrual^19,22. Este manuscrito describe un protocolo para crear un modelo de chip de órg.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Steriflip	Millipore	SCGP00525	To degas media
2 channel chip	Emulate	BRK-S1-WER-24	Part of the two-channel Chip kit
200 μL barrier tips (or filter tips)	Thomas Scientific, SHARP	1159M40	Tips used for chip seeding
Activation Reagent 1 (or ER-1 powder)	Emulate	Chip S1 Basic Research kit-24PK	Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature -20 °C
Activation Reagent 2 (or ER-2 solution)	Emulate	Chip S1 Basic Research kit-24PK	Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature 4 °C
Adenine	Sigma Aldrich	A2786	Component of the Differentiation media
Brucella blood agar plates	VWR International Inc.	89405-032	with Hemin and Vitamin K; For the enumeration of Gardnerella vaginalis
Ca2+ and Mg2+ free DPBS (DPBS (-/-)	ScienCell	303	For washing cells
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C5670	Component of the Differentiation media
Calcium chloride (anhyd.)	Sigma Aldrich	499609	Component of HBSS (LB/+G)
Collagen I	Corning	354236	For the coating solution for HVEC
Collagen IV	Sigma Aldrich	C7521	For the coating solution for HVEC
Collagenase IV	Gibco	17104019	For the dissociation of cells from the Vagina Chips
Complete fibroblast medium	ScienCell	2301	Media for the culture of HUF
Complete vaginal epithelium medium	Lifeline	LL-0068	Media for the culture of HVEC
D-Glucose (dextrose)	Sigma Aldrich	158968	Component of HBSS (LB/+G)
DMEM (Low Glucose)	Thermofisher	12320-032	Component of the Differentiation media
Dynamic Flow Module (or Zoë)	Emulate	Zoë-CM1	Regulates the flow rate of the chips
Ham's F12	Thermofisher	11765-054	Component of the Differentiation media
Heat inactivated FBS	Thermofisher	10438018	Component of the Differentiation media
Human uterine fibroblasts	ScienCell	7040	HUF
Human vaginal epithelial cells	Lifeline	FC-0083	HVEC
Hydrocortisone	Sigma Aldrich	H0396	Component of the Differentiation media
ITES	Lonza	17-839Z	Component of the Differentiation media
L-glutamine	Thermofisher	25030081	Component of the Differentiation media
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	M2393	Component of HBSS (LB/+G)
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	M1880	Component of HBSS (LB/+G)
MRS agar plates	VWR International Inc.	89407-214	For enumeration of Lactobacillus
O-phosphorylethanolamine	Sigma Aldrich	P0503	Component of the Differentiation media
Pen/Strep	Thermofisher	15070063	Component of the Differentiation media
pH strips	Fischer-Scientific	13-640-520	For measurement of pH
Pods (1/chip)	Emulate	BRK-S1-WER-24	Part of the two-channel Chip kit
Poly-L-lysine	ScienCell	403	For the coating solution for HUFs
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911	Component of HBSS (LB/+G)
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P0662	Component of HBSS (LB/+G)
Sterile 80% glycerol	MP Biomedicals	113055034	For freezing bacterial samples
Triiodothyronine	Sigma Aldrich	T6397	Component of the Differentiation media
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma Aldrich	T8154	For counting live/dead cells
TrypLE Express	Thermofisher	12605010	For the dissociation of cells from the Vagina Chips
Trypsin Neutralizing Solution (TNS)	ScienCell	113	For neutralization of Trypsin
Trypsin/EDTA Solutiom (0.25%)	ScienCell	103	For cell dissociation
β-estradiol	Sigma Aldrich	E2257	Hormone for differentiation media