인간 Vagina-on-a-Chip에서 건강하고 dysbiotic 질 미세환경 모델링

요약

이 기사에서는 미세공기성 조건에서 살아있는 질 마이크로바이옴과 인간 숙주의 상호 작용을 연구할 수 있는 미세유체 질 온 칩(Vagina Chip) 배양 장치를 만들기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 칩은 질 질환을 조사하고 잠재적인 치료 대책을 개발 및 테스트하는 도구로 사용할 수 있습니다.

초록

여성의 건강, 특히 여성 생식관 질환(FRT)은 건강하지 않은 생식기관이 생명을 위협하는 질병, 불임 또는 임신 중 부정적인 결과를 초래할 수 있음에도 불구하고 마땅히 받아야 할 관심을 받지 못했습니다. 이 분야의 한 가지 장벽은 FRT의 생리학 및 병태생리학을 충실하게 모방하는 전임상 실험 모델이 부족하다는 것입니다. 현재의 체외 및 동물 모델은 호르몬 변화, 미세 호기성 조건 및 질 마이크로바이옴과의 상호 작용을 완전히 요약하지 못합니다. 조직-조직 계면, 혈관 관류, 간질액 흐름 및 인간 장기의 주요 하위 단위의 물리적 미세환경을 모방할 수 있는 Organ-on-a-Chip(Organ Chip) 미세유체 배양 기술의 출현은 잠재적으로 이 문제에 대한 해결책이 될 수 있습니다. 최근에는 인간 질 기질과 연결되어 역동적인 유체 흐름을 경험하는 원발성 인간 질 상피와 인간 질 미생물 컨소시엄의 공동 배양을 지원하는 human Vagina Chip이 개발되었습니다. 이 칩은 건강하고 불균형한 미생물 군집에 대한 인간 질의 생리적 반응을 복제합니다. 인간 질 칩을 만들기위한 자세한 프로토콜이이 기사에 설명되어 있습니다.

서문

산성 미세환경을 유지하는 데 도움이 되는 Lactobacillus spp.가 지배하는 질 마이크로바이옴은 여성의 생식 건강을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다¹. 그러나 때때로 마이크로바이옴을 구성하는 미생물 군집의 구성에 변화가 있을 수 있으며, 이로 인해 질 박테리아의 다양성이 증가할 수 있습니다. 이러한 불균형적 변화는 종종 락토바실러스가 지배하는 상태에서 보다 다양한 혐기성 박테리아 종(예: Gardnerella vaginalis)이 지배하는 상태로 전환되는 결과를 낳으며, 세균성 질염, 위축성 질염, 요로 감염, 외음부 칸디다증, 요도염 및 융모막염과 같은 생식계의 다양한 질병과 관련이 있습니다 2,3,4,5 . 이러한 질병은 여성이 성병과 골반 염증성 질환에 걸릴 가능성을 높입니다 ^6,7,8,9

프로토콜

이 연구는 인간 세포 사용에 대한 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 세포는 상업적으로 얻어졌다( 재료 표 참조). 모든 단계는 생물안전 작업대(BSC)에서 무균 상태로 수행해야 합니다. 이 프로토콜에는 필터(또는 배리어) 피펫 팁만 사용하십시오.

1. 인간 질 상피 세포 배양

1. 50mL의 질 상피 배지(VEM, 재료 표 참조)를 37°C로 데웁니다.
2. 9mL의 VEM을 15mL 튜브에 분취합니다. 그런 다음 인간 질 상피 세포(HVEC)의 바이알을 해동하고 VEM이 들어 있는 튜브에 추가합니다.
3. 15mL 튜브를 실온(RT)에서 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 펠릿을 남겨두고 상층액을 흡입합니다.
4. 펠릿을 VEM 2mL에 부드럽게 재현탁시키고 14mL의 VEM이 들어 있는 두 개의 T75 플라스크 각각에 1mL를 추가합니다.
5. 플라스크를 37 ° C에서 5 % CO 2 로 배양_합니다. HVEC가 약 70%(약 5일) 합류할 때까지 2일마다 VEM을 변경합니다.

토론

과거의 인간 질의 체외 모델은 질 조직 구조, 유체 흐름 및 숙주-병원체 상호 작용을 충실하게 복제하지 못했다^19,22. 동물 모델은 또한 미생물군집의 종간 변이와 발정기 또는 월경 주기의 차이에 의해 제한된다^19,22. 이 원고는 건강하고 불균형한 미생물 군집에 대한 인간의 반응을 효과적으로 모방할 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Steriflip	Millipore	SCGP00525	To degas media
2 channel chip	Emulate	BRK-S1-WER-24	Part of the two-channel Chip kit
200 μL barrier tips (or filter tips)	Thomas Scientific, SHARP	1159M40	Tips used for chip seeding
Activation Reagent 1 (or ER-1 powder)	Emulate	Chip S1 Basic Research kit-24PK	Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature -20 °C
Activation Reagent 2 (or ER-2 solution)	Emulate	Chip S1 Basic Research kit-24PK	Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature 4 °C
Adenine	Sigma Aldrich	A2786	Component of the Differentiation media
Brucella blood agar plates	VWR International Inc.	89405-032	with Hemin and Vitamin K; For the enumeration of Gardnerella vaginalis
Ca2+ and Mg2+ free DPBS (DPBS (-/-)	ScienCell	303	For washing cells
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C5670	Component of the Differentiation media
Calcium chloride (anhyd.)	Sigma Aldrich	499609	Component of HBSS (LB/+G)
Collagen I	Corning	354236	For the coating solution for HVEC
Collagen IV	Sigma Aldrich	C7521	For the coating solution for HVEC
Collagenase IV	Gibco	17104019	For the dissociation of cells from the Vagina Chips
Complete fibroblast medium	ScienCell	2301	Media for the culture of HUF
Complete vaginal epithelium medium	Lifeline	LL-0068	Media for the culture of HVEC
D-Glucose (dextrose)	Sigma Aldrich	158968	Component of HBSS (LB/+G)
DMEM (Low Glucose)	Thermofisher	12320-032	Component of the Differentiation media
Dynamic Flow Module (or Zoë)	Emulate	Zoë-CM1	Regulates the flow rate of the chips
Ham's F12	Thermofisher	11765-054	Component of the Differentiation media
Heat inactivated FBS	Thermofisher	10438018	Component of the Differentiation media
Human uterine fibroblasts	ScienCell	7040	HUF
Human vaginal epithelial cells	Lifeline	FC-0083	HVEC
Hydrocortisone	Sigma Aldrich	H0396	Component of the Differentiation media
ITES	Lonza	17-839Z	Component of the Differentiation media
L-glutamine	Thermofisher	25030081	Component of the Differentiation media
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	M2393	Component of HBSS (LB/+G)
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	M1880	Component of HBSS (LB/+G)
MRS agar plates	VWR International Inc.	89407-214	For enumeration of Lactobacillus
O-phosphorylethanolamine	Sigma Aldrich	P0503	Component of the Differentiation media
Pen/Strep	Thermofisher	15070063	Component of the Differentiation media
pH strips	Fischer-Scientific	13-640-520	For measurement of pH
Pods (1/chip)	Emulate	BRK-S1-WER-24	Part of the two-channel Chip kit
Poly-L-lysine	ScienCell	403	For the coating solution for HUFs
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911	Component of HBSS (LB/+G)
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P0662	Component of HBSS (LB/+G)
Sterile 80% glycerol	MP Biomedicals	113055034	For freezing bacterial samples
Triiodothyronine	Sigma Aldrich	T6397	Component of the Differentiation media
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma Aldrich	T8154	For counting live/dead cells
TrypLE Express	Thermofisher	12605010	For the dissociation of cells from the Vagina Chips
Trypsin Neutralizing Solution (TNS)	ScienCell	113	For neutralization of Trypsin
Trypsin/EDTA Solutiom (0.25%)	ScienCell	103	For cell dissociation
β-estradiol	Sigma Aldrich	E2257	Hormone for differentiation media