Bir İnsan Çip Üzerinde Vajinada Sağlıklı ve Disbiyotik Vajinal Mikro Ortamların Modellenmesi

Özet

Bu makale, mikroaerofilik koşullar altında canlı bir vajinal mikrobiyom ile insan konakçı etkileşimlerinin incelenmesini sağlayan bir mikroakışkan çip üzerinde vajina (Vajina Çipi) kültür cihazı oluşturmak için bir protokolü açıklamaktadır. Bu çip, vajinal hastalıkları araştırmak ve potansiyel terapötik karşı önlemleri geliştirmek ve test etmek için bir araç olarak kullanılabilir.

Özet

Kadın sağlığı ve özellikle kadın üreme sistemi (FRT) hastalıkları, sağlıksız bir üreme sistemi hamilelik sırasında yaşamı tehdit eden hastalıklara, kısırlığa veya olumsuz sonuçlara yol açabilse de, hak ettikleri ilgiyi görmemiştir. Alandaki bir engel, FRT'nin fizyolojisini ve patofizyolojisini sadık bir şekilde taklit eden klinik öncesi, deneysel modellerin kıtlığının olmasıdır. Mevcut in vitro ve hayvan modelleri hormonal değişiklikleri, mikroaerobik koşulları ve vajinal mikrobiyom ile etkileşimleri tam olarak özetlememektedir. Doku-doku arayüzlerini, vasküler perfüzyonu, interstisyel sıvı akışlarını ve insan organlarının önemli bir alt biriminin fiziksel mikro çevresini taklit edebilen Çip Üzerinde Organ (Organ Çipi) mikroakışkan kültür teknolojisinin ortaya çıkışı, potansiyel olarak bu soruna bir çözüm olarak hizmet edebilir. Son zamanlarda, insan vajinal mikrobiyal konsorsiyumunun birincil insan vajinal epiteli ile aynı zamanda vajinal stroma ile arayüzlenen ve dinamik sıvı akışı deneyimleyen ko-kültürünü destekleyen bir insan Vajina Çipi geliştirilmiştir. Bu çip, insan vajinasının sağlıklı ve disbiyotik mikrobiyomlara verdiği fizyolojik tepkileri çoğaltır. Bu makalede insan Vajina Cipsleri oluşturmak için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır.

Giriş

Asidik bir mikro ortamın korunmasına yardımcı olan Lactobacillus spp.'nin hakim olduğu bir vajinal mikrobiyom, kadın üreme sağlığının korunmasında önemli bir rol oynar¹. Bununla birlikte, zaman zaman mikrobiyomu oluşturan mikrobiyal toplulukların bileşiminde bir değişiklik olabilir ve bu da vajinal bakteri çeşitliliğinde bir artışa neden olur. Genellikle Lactobacillus'un baskın olduğu bir durumdan daha çeşitli anaerobik bakteri türlerinin (örneğin, Gardnerella vaginalis) egemen olduğu bir duruma geçişle sonuçlanan bu disbiyotik değişiklikler, bakteriyel vajinoz, atrofik vajinit, idrar yolu enfeksiyonu, vulvovajinal kandidiyazis, üretrit ve koryoamniyonit gibi çeşitli üreme sistemi hastalıklarıyla ilişkilidir 2,3,4,5 . Bu hastalıklar, sırayla, bir kadının cinsel yolla bulaşan hastalıklara ve pelvik inflamatuar hastalığa yakalanma şansını arttırır^6,7,8,9. Ayrıca hamile kadınlarda erken doğum ve düşükler için daha yüksek risk oluştururlar^10,11,12 ve ayrıca kısırlık 13,14,15,16 ile ilişkilendirilmişlerdir.

Statik, iki boyutlu (2D) kültür sistemlerinde^{kültürlenen} vajinal epitel hücreleri kullanılarak vajinal disbiyozu modellemek için çaba sarf edilmiş olsa da ^17,18, vajinal mikroçevrenin fizyolojisini ve karmaşıklığını etkili bir şekilde taklit etmezler¹⁹. Hayvan modelleri ayrıca vajinal dysbiozu incelemek için kullanılmıştır; Bununla birlikte, adet evreleri ve konak-mikrobiyom etkileşimleri insanlardakinden büyük ölçüde farklıdır ve bu nedenle, bu çalışmalardan elde edilen sonuçların fizyolojik önemi belirsizliğini korumaktadır 19,20,21. Bu sorunlara karşı koymak için, FRT ^{19,22,23,24'teki} konak-patojen etkileşimlerini incelemek için insan vajinal dokusunun organoidleri ve Transwell insert modelleri de kullanılmıştır. Ancak bunlar statik kültürler oldukları için, insan hücrelerinin canlı mikroplarla ko-kültürünü yalnızca kısa bir süre için (<16-24 saat) destekleyebilirler ve mukus üretimi ve sıvı akışı gibi insan vajinal mikro çevresinin potansiyel olarak önemli diğer birçok fiziksel özelliğinden yoksundurlar²².

Organ Çipleri, dinamik sıvı akışı altında kültürlenmiş canlı hücreler tarafından kaplanmış bir veya daha fazla paralel içi boş mikro kanal içeren üç boyutlu (3D) mikroakışkan kültür sistemleridir. İki kanallı çipler, iki paralel kanalı ayıran gözenekli bir zarın zıt taraflarında farklı hücre tiplerini (örneğin, epitel ve stromal fibroblastlar veya epitel ve vasküler endotel) kültürleyerek organ düzeyinde doku-doku arayüzlerinin yeniden oluşturulmasını sağlar (Şekil 1). Her iki doku da bağımsız olarak sıvı akışına maruz kalabilir ve ayrıca karmaşık bir mikrobiyom^25,26,27,28 ile ko-kültürü mümkün kılmak için mikroaerobik koşulları deneyimleyebilirler. Bu yaklaşım yakın zamanda, epitel lümeninde düşük bir fizyolojik oksijen konsantrasyonunu sürdüren ve en az 3 gün boyunca sağlıklı ve disbiyotik mikrobiyomlarla ko-kültürü mümkün kılan, altta yatan stromal fibroblastlarla arayüzlenmiş hormona duyarlı, birincil vajinal epitel ile kaplı bir insan Vajina Çipi geliştirmek için kullanıldı in vitro²⁹. Vajina Çipinin, optimal (sağlıklı) L. crispatus konsorsiyumu tarafından kolonizasyonu incelemek ve optimal olmayan (sağlıklı olmayan) G. vaginalis içeren konsorsiyumların neden olduğu iltihabı ve yaralanmayı tespit etmek için kullanılabileceği gösterilmiştir. Burada, insan Vajina Çipini oluşturmak ve çip üzerinde sağlıklı ve disbiyotik bakteri toplulukları oluşturmak için kullanılan yöntemleri ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Protokol

Bu araştırma, insan hücrelerinin kullanımı için kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Hücreler ticari olarak elde edildi (bkz . Tüm adımlar bir biyogüvenlik kabininde (BSC) aseptik olarak gerçekleştirilmelidir. Bu protokol için yalnızca filtre (veya bariyer) pipet uçları kullanın.

1. İnsan vajinal epitel hücrelerinin kültürlenmesi

1. 50 mL vajinal epitel ortamını (VEM, Malzeme Tablosuna bakınız) 37 ° C'ye ısıtın.
2. 15 mL'lik bir tüpe 9 mL VEM ekleyin. Daha sonra, insan vajinal epitel hücrelerinin (HVEC'ler) bir şişesini çözün ve VEM içeren tüpe ekleyin.
3. 15 mL'lik tüpü oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve peleti geride bırakarak süpernatanı aspire edin.
4. Peleti 2 mL VEM içinde nazikçe yeniden süspanse edin ve 14 mL VEM içeren iki T75 şişesinin her birine 1 mL ekleyin.
5. Şişeleri 37 °C'de% 5 CO 2 ile inkübe edin_. HVEC'ler yaklaşık% 70 birleşene kadar (yaklaşık 5 gün) VEM'i her 2 günde bir değiştirin.

2. İnsan uterus fibroblast hücrelerinin kültürlenmesi

1. Çift damıtılmış suda (ddH₂O) 10 mL 15 μg / mL Poli-L-lizin çözeltisi (PLL) hazırlayın. İki T75 şişesinin her birine 5 mL PLL çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
2. 50 mL fibroblast ortamını (FM, Malzeme Tablosuna bakınız) 37 ° C'ye ısıtın.
3. PLL solüsyonunu aspire edin ve her şişeyi 5 mL ddH₂O ile yıkayın.
4. 9 mL FM'yi 15 mL'lik bir tüpe bağlayın ve bir insan uterus fibroblastı (HUF'ler) şişesini çözün.
5. HUF'ları FM içeren 15 mL'lik tüpe ekleyin.
6. 15 mL'lik tüpü RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin, hücre peletini geride bırakın.
7. Peleti 2 mL FM'de nazikçe yeniden süspanse edin ve 14 mL FM içeren iki T75 şişesinin her birine 1 mL ekleyin.
8. Şişeleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ile, hücreler yaklaşık% 70 birleşene kadar inkübe edin ve ortamı 2 günde bir değiştirin.

3. Çip aktivasyonu ve kanal kaplama

1. Talaşları (ticari olarak elde edilir, Malzeme Tablosuna bakınız) bir vakumlu desikatörde 30 dakika boyunca gazdan arındırın.
2. Aktivasyon Reaktifi 1'in (AR-1) ve Aktivasyon Reaktifi 2'nin (AR-2) (Malzeme Tablosuna bakın) ambalajlarını çıkarmadan 15 dakika boyunca RT'ye dengelenmesine izin verin.
3. Işıktan korumak için 15 mL'lik konik bir tüpü folyoya sarın. AR-1 şişesinin duvarlarına yavaşça 1 mL AR-2 çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın. Karışımı folyoya sarılmış 15 mL'lik tüpe aktarın.
4. AR-1 tozu flakondan tamamen yıkanana kadar AR-1 şişesine 1 mL'lik artışlarla tekrar tekrar AR-2 çözeltisi ekleyin.
5. AR-1 sulandırılmış çözeltisini AR-2 çözeltisi ile 10 mL'ye kadar doldurun.
6. Çıkıştan aspire ederken her bir çipin apikal kanal girişine bu çözeltiden 200 μL ekleyin (Şekil 1A). Bazal kanal için tekrarlayın. Engelsiz akışla sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için çözeltiyi eklerken pipeti çipe dik tutun.
7. Tüm çipler için adım 3.6'yı tekrarlayın.
8. Tüm cipslerde baloncuk olup olmadığını kontrol edin. Etkilenen kanal(lar)a daha fazla çözelti ekleyerek baloncukları çıkarın.
9. Kanal giriş ve çıkışlarından kaçınırken talaş yüzeyindeki tüm fazla AR-1 solüsyonunu aspire edin.
10. Cipsleri 150 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin ve bu üstü açık kabı bir UV ışık kutusuna yerleştirin.
11. UV ışık kutusunu BSC'nin arkasına doğru çevirin ve cipsleri 30 dakika boyunca sabit UV ışığı altında bırakın. Cipslerdeki çözeltinin rengi koyu pembeden mauna değişecektir.
12. Girişe 200 μL AR-2 solüsyonu ekleyerek her kanalı yıkayın ve aynı anda çıkıştan aspire edin.
13. Girişe 200 μL soğuk DPBS (-/-) ekleyerek ve aynı anda çıkıştan aspire ederek her kanalı iki kez yıkayın.
14. Apikal kanal kaplamasını hazırlayın (DMEM'de 200 μg/mL Kollajen I ve 30 μg/mL Kollajen IV karışımı) ( Malzeme Tablosuna bakınız). Buz üzerinde tutun.
15. Bazal kanal kaplamasını hazırlayın (DMEM'de 15 μg/mL PLL ve 200 μg/mL kollajen I karışımı). Buz üzerinde tutun.
16. Bazal kanal girişine 200 μL bazal kanal kaplaması ekleyin. Prizde kaplama solüsyonu göründüğünde prizi bir P200 ucuyla takın. Çözeltiyi giriş ve çıkış ucu hacimleri eşit olana kadar dağıtın ve ardından pipet ucunu pipetten serbest bırakın ve ucu girişte bırakın.
17. Benzer şekilde, apikal kanala 200 μL apikal kanal kaplaması ekleyin.
18. Talaş yüzeyinden fazla çözeltiyi aspire edin.
19. Tüm cipslerde baloncuk olup olmadığını kontrol edin. Etkilenen kanal(lar)a daha fazla kanal kaplaması ekleyerek baloncukları çıkarın.
20. Cipsleri gece boyunca 150 mm'lik bir Petri kabında 37 ° C'de% 5 CO 2 ile inkübe_edin.

4. HUF'lar ile tohumlama çipi bazal kanalı

1. Şişedeki HUF'ların büyümesini günlük olarak mikroskop altında görüntüleyin.
2. HUF kültürleri %70-90 birleştiğinde (kaplamadan ~ 3 gün sonra), 25 mL FM, 5 mL Ca^{2 +} / Mg²⁺ serbest DPBS (DPBS (-/-), 10 mL tripsin / EDTA ve 15 mL tripsin nötralize edici çözelti (TNS, Malzeme Tablosuna bakınız) 37 ° C'ye kadar.
3. Ortamı şişelerden aspire edin. 5 mL DPBS (-/-) ile yıkayın, ardından tekrar aspire edin.
4. Her şişeye 4 mL tripsin-EDTA ekleyin ve hücreler ayrılana kadar 37 ° C'de 3-5 dakika inkübe edin.
5. Her şişeye 6 mL TNS ekleyin ve hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
6. Süspansiyonu bir pipetle iyice karıştırın ve hücre sayımı için 10 μL'lik bir alikot alın. 10 μL hücre süspansiyonunu 10 μL tripan mavisi ile karıştırın ve bir hemositometre kullanarak sayın.
7. RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj hücresi süspansiyonu. Süpernatanı aspire edin ve peleti ılık FM'de 7.5 x 10⁵ hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyona kadar yeniden süspanse edin.
8. Bazal kanalı 200 μL FM ile yıkayın.
9. 15 mL VEM'i 37 °C'ye ısıtın. Apikal kanalı 200 μL VEM ile yıkayın.
10. Çıkışı bir pipet ucuyla tıkarken apikal kanal girişine 200 μL tam VEM ekleyin. Ortamı giriş ve çıkış ucu hacimleri eşit olana kadar dağıtın, ardından pipet ucunu pipetten serbest bırakın ve ucu girişte bırakın. Üst kanalı hem girişte hem de çıkışta dolu ve tıkalı tutun.
11. 50 μL HUF hücre süspansiyonunu bazal kanal girişine yavaşça pipetleyin ve aynı anda çıkıştan aspire edin. Kabarcık oluşumunu önlemek için pipet pistonuna bastırmadan veya bırakmadan pipet ucunda ~2 μL hücre süspansiyonu kaldığında, pipet ucunu girişten çıkarın. Giriş ve çıkışı pipet uçlarıyla takın.
12. Mikroskop altında kabarcık olup olmadığını kontrol edin. Varsa, bazal kanalı FM ile yıkayın ve adım 4.11'i tekrarlayın.
13. Tıkalı cipsleri 15 mL'lik bir tüp rafında ters çevirin ve 37 °C'de %5 CO₂ ile 1 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra çipleri gözlemleyin ve hücre ekini kontrol edin.
14. Bazal kanalın çıkışını bir pipet ucuyla takın. Pipet pistonunu aşağı bastırmadan bazal kanal girişine 200 μL FM ekleyin. Ucu pipetten serbest bırakın ve ortamın yerçekimi akışıyla kanaldan çıkış pipet ucuna serbestçe akmasına izin verin.
15. HUF tohumlu cipsleri gece boyunca 37 °C'de %5 CO₂ ile inkübe edin.

5. Vajinal epitel hücreleri ile tohumlama çip apikal kanalı

1. 50 mL VEM'i 37 °C'ye ısıtın.
2. Apikal kanal kaplaması hazırlayın (DMEM'de 200 μg/mL Kollajen I). Buz üzerinde tutun.
3. Apikal kanal çıkışını bir pipet ucuyla takın.
4. Apikal kanal girişine 200 μL apikal kanal kaplaması ekleyin. Apikal kaplama solüsyonunu giriş ve çıkış ucu hacimleri eşit olana kadar dağıtın, ardından pipet ucunu pipetten serbest bırakın ve ucu girişte bırakın.
5. Çipin yüzeyinden fazla çözeltiyi aspire edin.
6. Cipsleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ile 1 saat inkübe edin.
7. 1 saat sonra, çıkıştan aspire ederken apikal kanal girişine 200 μL VEM ekleyerek apikal kanal kaplamasını yıkayın.
8. ~% 70 -% 90 birleşme için mikroskop altında HVEC büyümesini kontrol edin.
9. Hücreler% 70 -% 90 birleşikse, şişe başına 6 mL tam vajinal epitel hücre ortamını ve 4 mL tripsin / EDTA'yı 37 ° C'ye ısıtın.
10. HVEC şişesinden besiyerini aspire edin ve 5 mL DPBS (-/-) ile yıkayın, ardından aspire edin.
11. Her şişeye 4 mL tripsin ekleyin ve hücreler ayrılana kadar 3-5 dakika boyunca% 5 CO₂ ile 37 ° C'de inkübe edin.
12. Tripsini inaktive etmek ve hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir konik tüpe aktarmak için şişeye 6 mL VEM ekleyin.
13. Süspansiyonu bir pipetle iyice karıştırın ve hücre sayımı için 10 μL'lik bir alikot alın. 10 μL hücre süspansiyonunu 10 μL tripan mavisi ile karıştırın ve bir hemositometre kullanarak sayın.
14. RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj hücresi süspansiyonu. Süpernatanı aspire edin ve peleti VEM'de 3.5-4 milyon hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyona yeniden süspanse edin.
15. 25 mL FM'yi 37 °C'ye ısıtın.
16. Apikal kanal çıkışını bir pipet ucuyla takın. Apikal kanal girişine en az 40 μL HVEC hücre süspansiyonunu yavaşça pipetleyin. Giriş ve çıkış ucu hacimleri eşit olana kadar hücre süspansiyonunu dağıtın, ardından pipet ucunu pipetten serbest bırakın ve ucu girişte bırakın. Bazal kanalı FM ile dolu tutun ve hem girişe hem de çıkışa takılı tutun.
17. Talaşların yüzeyindeki fazla ortamı dikkatlice aspire edin ve mikroskop altında kabarcık olup olmadığını kontrol edin. Varsa, adım 5.16'yı tekrarlayın.
18. Cipsleri büyük bir Petri kabına koyun ve gece boyunca %5 CO₂ ile 37 °C'de inkübe edin.
19. Ertesi gün, hücre bağlantısı için mikroskop altında cipsleri gözlemleyin.
20. Pipet uçlarını hem apikal hem de bazal kanalların giriş ve çıkışlarından çıkarın.
21. Bazal kanal çıkışını bir pipet ucuyla takın ve pipet pistonunu aşağı bastırmadan bazal kanal girişine 200 μL FM ekleyin. Pipet ucunu pipetten serbest bırakın ve ortamın yerçekimi akışıyla kanaldan çıkış pipet ucuna serbestçe akmasına izin verin.
22. VEM kullanarak apikal kanal için adım 5.21'i tekrarlayın.
23. Çift tohumlu cipsleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ile 24 saat inkübe edin.

6. Çiplerin bölmelere bağlanması ve vajinal epitel hücrelerinin ayırt edilmesi

1. 50 mL konik tüpleri ayırmak ve 37 ° C'ye ısıtmak için 50 mL FM ve VEM ekleyin.
2. FM ve VEM ortamının gazını alın, steril bir vakum altında 5 dakika boyunca 37 °C'ye ısıtılır.
3. Dinamik Akış Modülü (DFM, Malzeme Tablosuna bakın) için tepsileri dezenfekte edin ve temizleyin. Bölmeleri ambalajından çıkarın ve tepsilere yerleştirin.
4. Apikal giriş rezervuarına 2 mL gazı alınmış VEM ekleyin (sağ üst rezervuar; Şekil 1B). Kabarcık oluşumunu önlemek için rezervuar duvarları boyunca orta ekleyin.
5. Bazal giriş rezervuarına 3 mL gazı alınmış FM ekleyin (sol üst rezervuar, Şekil 1B). Kabarcık oluşumunu önlemek için rezervuar duvarları boyunca orta ekleyin.
6. Apikal çıkış rezervuarına 500 μL gazı alınmış VEM ekleyin (sağ alt rezervuar, Şekil 1B). Bölmeyi, ortam rezervuarın tüm alt yüzeyini kaplayacak şekilde eğin.
7. Bazal çıkış rezervuarına 500 μL gazı alınmış FM ekleyin (sol alt rezervuar, Şekil 1B). Bölmeyi, ortam rezervuarın tüm alt yüzeyini kaplayacak şekilde eğin.
8. Bölme içeren tepsileri DFM'ye kaydırın ve Prime döngüsünü iki kez çalıştırın. Her bölmenin alt tarafındaki bağlantı noktalarından damlacık çıkıp çıkmadığını kontrol edin.
9. 4 "Prime" döngüsünden sonra bir damlacık oluşmazsa, ortamın rezervuar ile kanal arasında akmasına izin vermek için bölmenin çıkış rezervuarının içindeki portla doğrudan temas edin (Şekil 1B) ve ilgili ortamdan 200 μL pipetleyin. Buna "Elle astarlama" denir.
10. Pipet uçlarını çiplerden çıkarın ve her çip için tüm bağlantı noktalarının üzerine ilgili ortamdan bir damlacık yerleştirin.
11. Cipsleri bölmelere kaydırın ve bölmeleri tepsilere yerleştirin.
12. Talaşların yüzeyindeki herhangi bir ortamı aspire edin ve her tepsiyi bir DFM'ye kaydırın.
13. DFM'de aşağıdaki parametreleri şu şekilde ayarlayın: Üst ve Alt - Sıvı; Apikal (Üst Kanal) Akış - 15 μL/h; Bazal (Alt Kanal) Akış - 30 μL/h; Uzatma = % 0; Frekans = 0 Hz.
14. DFM'de Düzenleme döngüsünü çalıştırın ve gece boyunca akışa izin verin.
15. 24 saat sonra, apikal kanal için akış ayarlarını 0 μL/s olarak değiştirin ve bazal kanalı 24 saat daha 30 μL/s akış hızında tutun.
16. 4 mM L-glutamin, 20 mM Hidrokortizon, 1x ITES, 20 nM Triiyodotironin, 100 μM O-Fosforil Etanolamin, 180 μM Adenin, 3.2 mM Kalsiyum klorür, %2 Isı ile inaktive edilmiş FBS, %1 Pen-strep ve 120 mL Ham F-12 ortamını Düşük glikozlu DMEM'e ekleyerek 500 mL farklılaşma ortamı (DM) hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve filtreyle sterilize edin.
17. 50 mL DM'yi 37 °C'ye ısıtın.
18. 50 mL DM'ye 20 μL 10 μM Estradiol ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin, iyice karıştırın ve steril bir vakum altında 5 dakika boyunca gazdan arındırın.
19. 50 mL VEM'i bir su banyosunda 37 °C'ye ısıtın ve steril bir vakum altında 5 dakika boyunca gazdan arındırın.
20. Tepsileri DFM'den çıkarın, bir BSC'ye yerleştirin ve rezervuarlardaki bağlantı noktalarından kaçınarak bölmelerden ortamı aspire edin (Şekil 1A). Ardından, apikal kanal giriş rezervuarına 2 mL VEM ve bazal kanal giriş rezervuarına 3 mL DM ekleyin.
21. Tepsileri DFM'ye geri koyun ve apikal kanal akışını 15 μL/s'ye ve bazal kanal akışını 30 μL/s'ye ayarlayın.
22. DFM'nin 4-7 saat akmasına izin verin. Ardından, apikal kanal akışını 0 μL/h'ye ayarlayarak durdurun. Bazal kanal akışının 30 μL/s'de devam etmesine izin verin.
23. Her 48 saatte bir 6.16-6.19 adımlarını izleyerek ortamı değiştirin.
24. 6.20-6.21 adımlarını izleyerek 5 gün daha her gün 4-7 saat apikal kanalda aralıklı olarak ortam akışı sağlayın.
25. 1.26 mM Kalsiyum klorür, 0.49 mM Magnezyum klorür hekzahidrat, 0.406 mM Magnezyum sülfat, 5.33 mM Potasyum klorür, 137.93 mM Sodyum klorür, 0.441 mM Potasyum fosfat monobazik ve 5.55 mM D- Glikozu dd H_2O'yaekleyerek Glikoz (HBSS (LB/+G)) ortamı ile düşük tamponlama kapasitesine sahip Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisini hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu); pH 4.8'dir.
26. 4 mM L-glutamin, 20 mM Hidrokortizon, 1x ITES, 20 nM Triiyodotironin, 100 μM O-Fosforil Etanolamin, 180 μM Adenin, 3.2 mM Kalsiyum klorür,% 2 Isı ile etkisiz FBS ve 120 mL Ham'ın F-12 ortamını ekleyerek 500 mL Pen-Strep-içermeyen DM hazırlayın Düşük glikozlu DMEM'e ve filtreyle sterilize edin.
27. 6. günde, 6.16-6.19 adımlarını izleyerek apikal kanal ortamını (HBSS (LB/+G)) ile ve bazal kanal ortamını Pen-Strep-free DM ile değiştirin.
28. Bakteriyel aşılamaya devam etmeden önce DFM üzerindeki akışı apikal kanal için 15 μL/s ve bazal kanal için 30 μL/s olarak 24 saat ayarlayın.

7. Farklılaşmış cipslerin bakteriyel aşılanması

NOT: Mikropları işleme düzenlemelerine uygun bir Laboratuvarda ve BSC'de aşağıdaki adımları gerçekleştirin.

1. İnokuluma dahil edilecek her bir bakteri suşunun CFU/mL'sini hesaplayın. Her bakteri suşunun gerekli miktarını toplam ~ 5 x 10⁶ CFU / mL'ye kadar karıştırın.
2. Karışımı 7.000 x g'da 4 ° C'de 7 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın. Peleti (HBSS (LB/+G)) içinde yeniden süspanse edin. Bu bakteri aşısı olacaktır.
3. Talaşları bölmelerden ayırın. Bazal kanalın çıkışını bir pipet ucuyla tıkayın ve pipet pistonunu aşağı doğru itmeden bazal kanal girişine 200 μL Pen-Strep-free DM ekleyin. Pipet ucunu pipetten serbest bırakın ve ortamın yerçekimi akışıyla kanaldan çıkışa serbestçe akmasına izin verin.
4. Çıkıştan aspire ederken apikal kanal girişine 37 μL bakteri inokulum ekleyin. Pipet ucunda yaklaşık 2 μL kaldığında, ucu dışarı çekin ve apikal kanal giriş ve çıkışını pipet uçlarıyla tıkayın.
5. Kontrol (aşılanmamış) çipleri için, 37 μL (HBSS (LB/+G)) ile adım 7.4'ü tekrarlayın.
6. Çipin yüzeyindeki herhangi bir ortamı aspire edin. Cipsleri 150 mm'lik bir Petri kabına koyun ve 37 °C'de %5 CO₂ ile 24 saat inkübe edin.
7. Bölmeleri (cipssiz) tepsilere yerleştirin ve 24 saat boyunca %5 CO₂ ile 37 °C'de inkübatöre koyun.
8. 50 mL (HBSS (LB/+G)) ve 50 mL Pen-Streptokok içermeyen DM'yi 37 °C'ye ısıtın.
9. 50 mL Pen-Streptokok içermeyen DM'ye 20 μL 10 μM Estradiol ekleyin, iyice karıştırın ve steril bir vakum altında 5 dakika boyunca gazdan arındırın. (HBSS (LB/+G)) vakum altında 5 dakika gazdan arındırın.
10. Rezervuar giriş ve çıkış portlarından kaçınırken bölmelerdeki ortamı dikkatli bir şekilde aspire edin.
11. Apikal giriş pod rezervuarına 3 mL gazı alınmış (HBSS (LB/+G)) ve apikal çıkış pod rezervuarına 500 μL gazı alınmış (HBSS (LB/+G)) ekleyin.
12. Bazal giriş pod rezervuarına 3 mL gazı alınmış Pen-Strep-free DM ve bazal çıkış pod rezervuarına 500 μL gazı alınmış antibiyotik içermeyen DM ekleyin.
13. Tepsileri bölmelerle birlikte (talaşlar olmadan) DFM'ye kaydırın ve Prime döngüsünü iki kez çalıştırın. Bölmenin alt tarafındaki her bir bağlantı noktasından damlacık çıkıp çıkmadığını kontrol edin.
    NOT: 4 "Prime" döngüsünden sonra bir damlacık oluşmazsa, ortamın rezervuar ile kanal arasında akmasına izin vermek için bölmenin çıkış haznesinin içindeki portla doğrudan temas edin (Şekil 1B) ve ilgili ortamın 200 μL'sini pipetleyin.
14. Pipet uçlarını talaşlardan çıkarın ve tüm kanal giriş ve çıkışlarına bir damla ilgili ortam yerleştirin.
15. Cipsleri bölmelere kaydırın ve bölmeleri tepsilere yerleştirin.
16. Apikal ve bazal çıkış pod rezervuarlarındaki ortamları ve talaşların yüzeyindeki herhangi bir ortamı aspire edin. Ardından, tepsileri DFM'ye kaydırın.
17. DFM'de aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Üst ve Alt - Sıvı; apikal (üst) akış - 40 μL/s; Bazal (Alt) Akış - 40 μL/h; Streç - % 0; Frekans - 0 Hz. Düzenleme döngüsünü çalıştırın.
18. Akışı 4 saat sonra durdurun ve atık suyu, yani ortamı apikal ve bazal çıkış rezervuarlarında toplayın.
19. Atık su hacimlerini ölçün ve kaydedin.
20. Çipleri DFM'ye geri yerleştirin ve apikal akış hızını 0 μL/s'ye ve bazal akışı 30 μL/s'ye ayarlayın. Akışı gece boyunca çalışacak şekilde başlatın.
21. Toplanan atık suyu çeşitli planlı tahliller için ayırın ve uygun sıcaklıklarda saklayın.
    NOT: CFU ölçümü için, %16'lık bir nihai konsantrasyona kadar gliserol ekleyin ve hemen -80 °C'de saklayın.
22. Ortamı sadece bazal çıkış rezervuarlarında aspire edin ve DFM'de apikal ve bazal akış hızlarını 40 μL / s'ye ayarlayın. Akışı 4 saat boyunca başlatın ve 7.18-7.21 adımlarını tekrarlayın. Bu, 48 saat boyunca atık su toplama işlemi olacaktır.
23. 7.22 adımını 72 saat boyunca veya deney sona erene kadar tekrarlayın.
24. Deneyin uç noktasında, 7.18-7.19 adımlarını izleyerek atık suları toplayın.
25. TrypLE express'e 1 mg / mL Kollajenaz IV ekleyerek sindirim solüsyonu hazırlayın. 10 mL sindirim solüsyonunu 37 °C'ye ısıtın.
26. Bazal kanalın çıkış portunu bir pipet ucuyla takın. Bazal kanala 100 μL sindirim çözeltisi ekleyin. İyice karıştırın ve bir pipet kullanarak kanaldaki tüm çözeltiyi 'Tüp B' olarak etiketlenmiş bir tüpte toplayın.
27. Apikal kanalın çıkış portunu bir pipet ucuyla takın. Apikal kanala 100 μL sindirim çözeltisi ekleyin. İyice karıştırın ve bir pipet kullanarak kanaldaki tüm çözeltiyi 'Tüp A' olarak etiketlenmiş bir tüpte toplayın.
28. Pipet uçlarıyla çıkışları tıkarken hem apikal hem de bazal kanal girişlerine 100 μL daha sindirim solüsyonu ekleyin. Talaşları ve Tüp A ve B'yi 37 °C'de 1-1,5 saat inkübe edin.
29. Sindirim içeriklerini, girişlere ve çıkışlara önceden yerleştirilmiş tıkalı uçları kullanarak kanalların içinde iyice karıştırın. Apikal ve bazal kanalların içeriğini sırasıyla Tüp A ve B'ye toplayın. Bunlar çip apikal ve bazal sindirimdir.
30. Bir hemositometre kullanarak Tüp A'daki hücreleri sayın. Ayrıca, adım 7.21'i izleyerek CFU ölçümü için çip özetlerinden bir alikotu çıkarın.

8. Talaş atık sularının ve çürütücülerin analizi

1. Atık sulardan ve digestlerden bakteri sayımı için, atık suları veya digestleri steril DPBS (-/-) içinde seri olarak seyreltin ve uygun bir ortam plakası üzerinde plakalayın, 37 °C'de 24-48 saat inkübe edin ve plaka üzerindeki kolonileri sayın.
2. pH ölçümü için, toplandıktan hemen sonra 72 saatlik atık suyun 10 μL'sini alın ve atık suyun pH'ını ölçmek için bir pH şeridi kullanın.
3. Sitokinlerin analizi için, Luminex bazlı test, ELISA veya başka herhangi bir uygulanabilir teknik^29,30 kullanarak spesifik sitokinleri tespit etmek için atık suları kullanın.

Sonuçlar

İnsan vajinası, fibroblast açısından zengin kollajen bir stroma üzerinde yer alan tabakalı bir epitel ile kaplıdır. Bunu modellemek için, iki kanallı bir mikroakışkan Organ Çipi cihazı içinde ortak bir gözenekli zarın zıt taraflarında birincil insan vajinal epiteli ve fibroblastların kültürlenmesiyle bir doku arayüzü oluşturuldu. Vajinal epitelin oluşumu, aşamalı olarak birden fazla hücre tabakası oluşturan sürekli bir hücre tabakasının oluşumunu ortaya çıkaran parlak alan mikroskob...

Tartışmalar

İnsan vajinasının geçmiş in vitro modelleri, vajinal doku yapılarını, sıvı akışını ve konakçı-patojen etkileşimlerini aslına uygun olarak kopyalamaz^19,22. Hayvan modelleri ayrıca mikrobiyomdaki türler arası varyasyon ve kızgınlık veya adet döngüsündeki farklılıklarla sınırlıdır^19,22. Bu el yazması, sağlıklı ve disbiyotik mikrobiyal topluluklara insan tepkileri...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Steriflip	Millipore	SCGP00525	To degas media
2 channel chip	Emulate	BRK-S1-WER-24	Part of the two-channel Chip kit
200 μL barrier tips (or filter tips)	Thomas Scientific, SHARP	1159M40	Tips used for chip seeding
Activation Reagent 1 (or ER-1 powder)	Emulate	Chip S1 Basic Research kit-24PK	Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature -20 °C
Activation Reagent 2 (or ER-2 solution)	Emulate	Chip S1 Basic Research kit-24PK	Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature 4 °C
Adenine	Sigma Aldrich	A2786	Component of the Differentiation media
Brucella blood agar plates	VWR International Inc.	89405-032	with Hemin and Vitamin K; For the enumeration of Gardnerella vaginalis
Ca2+ and Mg2+ free DPBS (DPBS (-/-)	ScienCell	303	For washing cells
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C5670	Component of the Differentiation media
Calcium chloride (anhyd.)	Sigma Aldrich	499609	Component of HBSS (LB/+G)
Collagen I	Corning	354236	For the coating solution for HVEC
Collagen IV	Sigma Aldrich	C7521	For the coating solution for HVEC
Collagenase IV	Gibco	17104019	For the dissociation of cells from the Vagina Chips
Complete fibroblast medium	ScienCell	2301	Media for the culture of HUF
Complete vaginal epithelium medium	Lifeline	LL-0068	Media for the culture of HVEC
D-Glucose (dextrose)	Sigma Aldrich	158968	Component of HBSS (LB/+G)
DMEM (Low Glucose)	Thermofisher	12320-032	Component of the Differentiation media
Dynamic Flow Module (or Zoë)	Emulate	Zoë-CM1	Regulates the flow rate of the chips
Ham's F12	Thermofisher	11765-054	Component of the Differentiation media
Heat inactivated FBS	Thermofisher	10438018	Component of the Differentiation media
Human uterine fibroblasts	ScienCell	7040	HUF
Human vaginal epithelial cells	Lifeline	FC-0083	HVEC
Hydrocortisone	Sigma Aldrich	H0396	Component of the Differentiation media
ITES	Lonza	17-839Z	Component of the Differentiation media
L-glutamine	Thermofisher	25030081	Component of the Differentiation media
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	M2393	Component of HBSS (LB/+G)
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	M1880	Component of HBSS (LB/+G)
MRS agar plates	VWR International Inc.	89407-214	For enumeration of Lactobacillus
O-phosphorylethanolamine	Sigma Aldrich	P0503	Component of the Differentiation media
Pen/Strep	Thermofisher	15070063	Component of the Differentiation media
pH strips	Fischer-Scientific	13-640-520	For measurement of pH
Pods (1/chip)	Emulate	BRK-S1-WER-24	Part of the two-channel Chip kit
Poly-L-lysine	ScienCell	403	For the coating solution for HUFs
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911	Component of HBSS (LB/+G)
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P0662	Component of HBSS (LB/+G)
Sterile 80% glycerol	MP Biomedicals	113055034	For freezing bacterial samples
Triiodothyronine	Sigma Aldrich	T6397	Component of the Differentiation media
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma Aldrich	T8154	For counting live/dead cells
TrypLE Express	Thermofisher	12605010	For the dissociation of cells from the Vagina Chips
Trypsin Neutralizing Solution (TNS)	ScienCell	113	For neutralization of Trypsin
Trypsin/EDTA Solutiom (0.25%)	ScienCell	103	For cell dissociation
β-estradiol	Sigma Aldrich	E2257	Hormone for differentiation media