Bir İnsan Çip Üzerinde Vajinada Sağlıklı ve Disbiyotik Vajinal Mikro Ortamların Modellenmesi

Özet

Bu makale, mikroaerofilik koşullar altında canlı bir vajinal mikrobiyom ile insan konakçı etkileşimlerinin incelenmesini sağlayan bir mikroakışkan çip üzerinde vajina (Vajina Çipi) kültür cihazı oluşturmak için bir protokolü açıklamaktadır. Bu çip, vajinal hastalıkları araştırmak ve potansiyel terapötik karşı önlemleri geliştirmek ve test etmek için bir araç olarak kullanılabilir.

Özet

Kadın sağlığı ve özellikle kadın üreme sistemi (FRT) hastalıkları, sağlıksız bir üreme sistemi hamilelik sırasında yaşamı tehdit eden hastalıklara, kısırlığa veya olumsuz sonuçlara yol açabilse de, hak ettikleri ilgiyi görmemiştir. Alandaki bir engel, FRT'nin fizyolojisini ve patofizyolojisini sadık bir şekilde taklit eden klinik öncesi, deneysel modellerin kıtlığının olmasıdır. Mevcut in vitro ve hayvan modelleri hormonal değişiklikleri, mikroaerobik koşulları ve vajinal mikrobiyom ile etkileşimleri tam olarak özetlememektedir. Doku-doku arayüzlerini, vasküler perfüzyonu, interstisyel sıvı akışlarını ve insan organlarının önemli bir alt biriminin fiziksel mikro çevresini taklit edebilen Çip Üzerinde Organ (Organ Çipi) mikroakışkan kültür teknolojisinin ortaya çıkışı, potansiyel olarak bu soruna bir çözüm olarak hizmet edebilir. Son zamanlarda, insan vajinal mikrobiyal konsorsiyumunun birincil insan vajinal epiteli ile aynı zamanda vajinal stroma ile arayüzlenen ve dinamik sıvı akışı deneyimleyen ko-kültürünü destekleyen bir insan Vajina Çipi geliştirilmiştir. Bu çip, insan vajinasının sağlıklı ve disbiyotik mikrobiyomlara verdiği fizyolojik tepkileri çoğaltır. Bu makalede insan Vajina Cipsleri oluşturmak için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır.

Giriş

Asidik bir mikro ortamın korunmasına yardımcı olan Lactobacillus spp.'nin hakim olduğu bir vajinal mikrobiyom, kadın üreme sağlığının korunmasında önemli bir rol oynar¹. Bununla birlikte, zaman zaman mikrobiyomu oluşturan mikrobiyal toplulukların bileşiminde bir değişiklik olabilir ve bu da vajinal bakteri çeşitliliğinde bir artışa neden olur. Genellikle Lactobacillus'un baskın olduğu bir durumdan daha çeşitli anaerobik bakteri türlerinin (örneğin, Gardnerella vaginalis) egemen olduğu bir duruma geçişle sonuçlanan bu disbiyotik değişiklikler, bakteriyel vajinoz, atrofik vajinit, idrar yolu enfeksiyonu, vulvovajinal ka....

Protokol

Bu araştırma, insan hücrelerinin kullanımı için kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Hücreler ticari olarak elde edildi (bkz . Tüm adımlar bir biyogüvenlik kabininde (BSC) aseptik olarak gerçekleştirilmelidir. Bu protokol için yalnızca filtre (veya bariyer) pipet uçları kullanın.

1. İnsan vajinal epitel hücrelerinin kültürlenmesi

1. 50 mL vajinal epitel ortamını (VEM, Malzeme Tablosuna bakınız) 37 ° C'ye ısıtın.
2. 15 mL'lik bir tüpe 9 mL VEM ekleyin. Daha sonra, insan vajinal epitel hücrelerinin (HVEC'ler) bir şişesini çözün ve VEM içeren tüpe ekleyin.
....

Tartışmalar

İnsan vajinasının geçmiş in vitro modelleri, vajinal doku yapılarını, sıvı akışını ve konakçı-patojen etkileşimlerini aslına uygun olarak kopyalamaz^19,22. Hayvan modelleri ayrıca mikrobiyomdaki türler arası varyasyon ve kızgınlık veya adet döngüsündeki farklılıklarla sınırlıdır^19,22. Bu el yazması, sağlıklı ve disbiyotik mikrobiyal topluluklara insan tepkileri.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Steriflip	Millipore	SCGP00525	To degas media
2 channel chip	Emulate	BRK-S1-WER-24	Part of the two-channel Chip kit
200 μL barrier tips (or filter tips)	Thomas Scientific, SHARP	1159M40	Tips used for chip seeding
Activation Reagent 1 (or ER-1 powder)	Emulate	Chip S1 Basic Research kit-24PK	Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature -20 °C
Activation Reagent 2 (or ER-2 solution)	Emulate	Chip S1 Basic Research kit-24PK	Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature 4 °C
Adenine	Sigma Aldrich	A2786	Component of the Differentiation media
Brucella blood agar plates	VWR International Inc.	89405-032	with Hemin and Vitamin K; For the enumeration of Gardnerella vaginalis
Ca2+ and Mg2+ free DPBS (DPBS (-/-)	ScienCell	303	For washing cells
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C5670	Component of the Differentiation media
Calcium chloride (anhyd.)	Sigma Aldrich	499609	Component of HBSS (LB/+G)
Collagen I	Corning	354236	For the coating solution for HVEC
Collagen IV	Sigma Aldrich	C7521	For the coating solution for HVEC
Collagenase IV	Gibco	17104019	For the dissociation of cells from the Vagina Chips
Complete fibroblast medium	ScienCell	2301	Media for the culture of HUF
Complete vaginal epithelium medium	Lifeline	LL-0068	Media for the culture of HVEC
D-Glucose (dextrose)	Sigma Aldrich	158968	Component of HBSS (LB/+G)
DMEM (Low Glucose)	Thermofisher	12320-032	Component of the Differentiation media
Dynamic Flow Module (or Zoë)	Emulate	Zoë-CM1	Regulates the flow rate of the chips
Ham's F12	Thermofisher	11765-054	Component of the Differentiation media
Heat inactivated FBS	Thermofisher	10438018	Component of the Differentiation media
Human uterine fibroblasts	ScienCell	7040	HUF
Human vaginal epithelial cells	Lifeline	FC-0083	HVEC
Hydrocortisone	Sigma Aldrich	H0396	Component of the Differentiation media
ITES	Lonza	17-839Z	Component of the Differentiation media
L-glutamine	Thermofisher	25030081	Component of the Differentiation media
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	M2393	Component of HBSS (LB/+G)
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	M1880	Component of HBSS (LB/+G)
MRS agar plates	VWR International Inc.	89407-214	For enumeration of Lactobacillus
O-phosphorylethanolamine	Sigma Aldrich	P0503	Component of the Differentiation media
Pen/Strep	Thermofisher	15070063	Component of the Differentiation media
pH strips	Fischer-Scientific	13-640-520	For measurement of pH
Pods (1/chip)	Emulate	BRK-S1-WER-24	Part of the two-channel Chip kit
Poly-L-lysine	ScienCell	403	For the coating solution for HUFs
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911	Component of HBSS (LB/+G)
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P0662	Component of HBSS (LB/+G)
Sterile 80% glycerol	MP Biomedicals	113055034	For freezing bacterial samples
Triiodothyronine	Sigma Aldrich	T6397	Component of the Differentiation media
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma Aldrich	T8154	For counting live/dead cells
TrypLE Express	Thermofisher	12605010	For the dissociation of cells from the Vagina Chips
Trypsin Neutralizing Solution (TNS)	ScienCell	113	For neutralization of Trypsin
Trypsin/EDTA Solutiom (0.25%)	ScienCell	103	For cell dissociation
β-estradiol	Sigma Aldrich	E2257	Hormone for differentiation media