Modelagem de microambientes vaginais saudáveis e disbióticos em uma vagina humana em um chip

Resumo

Este artigo descreve um protocolo para a criação de um dispositivo de cultura microfluídica vagina-on-a-chip (Vagina Chip) que permite o estudo das interações do hospedeiro humano com um microbioma vaginal vivo sob condições microaerofílicas. Este chip pode ser usado como uma ferramenta para investigar doenças vaginais, bem como para desenvolver e testar possíveis contramedidas terapêuticas.

Resumo

A saúde das mulheres, e particularmente as doenças do trato reprodutivo feminino (TRF), não receberam a atenção que merecem, embora um sistema reprodutivo insalubre possa levar a doenças com risco de vida, infertilidade ou resultados adversos durante a gravidez. Uma barreira no campo é que tem havido uma escassez de modelos experimentais pré-clínicos que imitam fielmente a fisiologia e a fisiopatologia do FRT. Os modelos in vitro e animais atuais não recapitulam totalmente as alterações hormonais, as condições microaeróbicas e as interações com o microbioma vaginal. O advento da tecnologia de cultura microfluídica Organ-on-a-Chip (Organ Chip) que pode imitar interfaces tecido-tecido, perfusão vascular, fluxos de fluido intersticial e o microambiente físico de uma subunidade importante de órgãos humanos pode potencialmente servir como uma solução para esse problema. Recentemente, foi desenvolvido um chip de vagina humana que suporta a co-cultura de consórcios microbianos vaginais humanos com epitélio vaginal humano primário que também tem interface com o estroma vaginal e experimenta fluxo dinâmico de fluido. Este chip replica as respostas fisiológicas da vagina humana a microbiomas saudáveis e disbióticos. Um protocolo detalhado para a criação de chips de vagina humana foi descrito neste artigo.

Introdução

Um microbioma vaginal dominado por Lactobacillus spp. que ajuda a manter um microambiente ácido desempenha um papel importante na manutenção da saúde reprodutiva feminina¹. No entanto, às vezes pode haver uma mudança na composição das comunidades microbianas que compõem o microbioma, o que resulta em um aumento na diversidade de bactérias vaginais. Essas alterações disbióticas, que muitas vezes resultam em uma mudança de um estado dominado por Lactobacillus para um dominado por espécies bacterianas anaeróbias mais diversas (por exemplo, Gardnerella vaginalis), estão associadas a várias doenças do sistema reprodutivo, como vaginose bacteriana, vaginite atrófica, infecção do trato urinário, candidíase vulvovaginal, uretrite e corioamnionite 2,3,4,5 . Essas doenças, por sua vez, aumentam as chances de a mulher adquirir doenças sexualmente transmissíveis e doenças inflamatórias pélvicas 6,7,8,9. Eles também representam um risco maior de parto prematuro e abortos espontâneos em mulheres grávidas 10,11,12 e também têm sido implicados na infertilidade 13,14,15,16.

Embora esforços tenham sido feitos para modelar a disbiose vaginal usando células epiteliais vaginais cultivadas em sistemas de cultura estáticos bidimensionais (2D)^17,18, eles não imitam efetivamente a fisiologia e a complexidade do microambiente vaginal¹⁹. Modelos animais também têm sido usados para estudar a disbiose vaginal; no entanto, suas fases menstruais e interações hospedeiro-microbioma diferem muito das dos humanos e, portanto, a relevância fisiológica dos resultados desses estudos permanece obscura 19,20,21. Para neutralizar esses problemas, organoides e modelos de inserção Transwell de tecido vaginal humano também têm sido usados para estudar as interações patógeno-hospedeiro no FRT 19,22,23,24. Mas, como são culturas estáticas, elas só podem suportar a co-cultura de células humanas com micróbios vivos por um curto período de tempo (<16-24 h) e carecem de muitas outras características físicas potencialmente importantes do microambiente vaginal humano, como produção de muco e fluxo de fluido²².

Os chips de órgãos são sistemas de cultura microfluídica tridimensional (3D) que contêm um ou mais microcanais ocos paralelos revestidos por células vivas cultivadas sob fluxo dinâmico de fluido. Os chips de dois canais permitem a recriação de interfaces tecido-tecido em nível de órgão, cultivando diferentes tipos de células (por exemplo, epitélio e fibroblastos estromais ou epitélio e endotélio vascular) em lados opostos de uma membrana porosa que separa os dois canais paralelos (Figura 1). Ambos os tecidos podem ser expostos independentemente ao fluxo de fluido e também podem experimentar condições microaeróbicas para permitir a co-cultura com um microbioma complexo 25,26,27,28. Essa abordagem foi recentemente aproveitada para desenvolver um chip de vagina humano revestido por epitélio vaginal primário sensível a hormônios, interligado com fibroblastos estromais subjacentes, que sustenta uma baixa concentração fisiológica de oxigênio no lúmen epitelial e permite a co-cultura com microbiomas saudáveis e disbióticos por pelo menos 3 dias in vitro²⁹. Foi demonstrado que o Vagina Chip pode ser usado para estudar a colonização por consórcios ideais (saudáveis) de L. crispatus e detectar inflamação e lesão causada por consórcios contendo G. vaginalis não ideais (não saudáveis). Aqui, descrevemos em detalhes os métodos usados para criar o chip da vagina humana, bem como para estabelecer comunidades bacterianas saudáveis e disbióticas no chip.

Protocolo

Esta pesquisa foi realizada em conformidade com as diretrizes institucionais para o uso de células humanas. As células foram obtidas comercialmente (ver Tabela de Materiais). Todas as etapas devem ser realizadas assepticamente em um gabinete de biossegurança (BSC). Use apenas ponteiras de pipeta de filtro (ou barreira) para este protocolo.

1. Cultura de células epiteliais vaginais humanas

1. Aqueça 50 mL de meio epitelial vaginal (VEM, consulte a Tabela de Materiais) a 37 °C.
2. Alíquota de 9 mL de VEM para um tubo de 15 mL. Em seguida, descongele um frasco de células epiteliais vaginais humanas (HVECs) e adicione-o ao tubo contendo VEM.
3. Centrifugue o tubo de 15 ml a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente (RT) e aspire o sobrenadante, deixando o pellet para trás.
4. Ressuspenda suavemente o pellet em 2 ml de VEM e adicione 1 ml a cada um dos dois frascos T75 contendo 14 ml de VEM.
5. Incubar os frascos a 37 °C com 5% de CO_2. Troque o VEM a cada 2 dias até que os HVECs estejam aproximadamente 70% confluentes (cerca de 5 dias).

2. Cultura de células de fibroblastos uterinos humanos

1. Preparar 10 ml de solução de poli-L-lisina (PLL) a 15 μg/ml em água bidestilada (ddH₂O). Adicionar 5 ml de solução de PLL a cada um dos dois balões T75 e incubar a 37 °C durante 1 h.
2. Aqueça 50 mL de meio de fibroblastos (FM, consulte a Tabela de Materiais) a 37 °C.
3. Aspirar a solução de PLL e lavar cada balão com 5 ml de ddH₂O.
4. Alíquota de 9 mL de FM para um tubo de 15 mL e descongele um frasco de fibroblastos uterinos humanos (HUFs).
5. Adicione os HUFs ao tubo de 15 mL contendo FM.
6. Centrifugue o tubo de 15 ml a 300 x g durante 5 min à RT e aspire o sobrenadante, deixando o sedimento celular para trás.
7. Ressuspenda suavemente o pellet em 2 mL de FM e adicione 1 mL a cada um dos dois frascos T75 contendo 14 mL de FM.
8. Incubar frascos a 37 °C com 5% de CO₂ até que as células estejam aproximadamente 70% confluentes, trocando o meio de 2 em 2 dias.

3. Ativação do chip e revestimento do canal

1. Desgaseifique os cavacos (obtidos comercialmente, consulte a Tabela de Materiais) por 30 min em um dessecador a vácuo.
2. Permita que o Reagente de Ativação 1 (AR-1) e o Reagente de Ativação 2 (AR-2) (consulte a Tabela de Materiais) se equilibrem em RT por 15 min sem remover sua embalagem.
3. Enrole um tubo cônico de 15 mL em papel alumínio para protegê-lo da luz. Adicione lentamente 1 ml de solução de AR-2 às paredes do frasco para injetáveis de AR-1 e misture bem. Transfira a mistura para o tubo de 15 mL embrulhado em papel alumínio.
4. Adicione repetidamente a solução de AR-2 ao frasco para injetáveis de AR-1 em incrementos de 1 ml até que o pó de AR-1 seja totalmente lavado do frasco para injetáveis.
5. Complete a solução reconstituída AR-1 para 10 mL com solução AR-2.
6. Adicione 200 μL desta solução à entrada do canal apical de cada chip durante a aspiração da saída (Figura 1A). Repita para o canal basal. Mantenha a pipeta perpendicular ao cavaco enquanto adiciona a solução para manter uma vedação hermética com fluxo desobstruído.
7. Repita a etapa 3.6 para todos os chips.
8. Verifique se há bolhas em todos os chips. Remova todas as bolhas adicionando mais solução ao(s) canal(is) afetado(s).
9. Aspire todo o excesso de solução AR-1 da superfície do cavaco, evitando entradas e saídas de canal.
10. Coloque os chips em uma placa de Petri de 150 mm e insira este prato descoberto em uma caixa de luz ultravioleta.
11. Vire a caixa de luz UV para a parte de trás do BSC e deixe os chips sob luz UV constante por 30 min. A cor da solução nos chips mudará de rosa escuro para mogno.
12. Lave cada canal adicionando 200 μL de solução AR-2 à entrada enquanto aspira simultaneamente da saída.
13. Lave cada canal duas vezes adicionando 200 μL de DPBS frio (-/-) à entrada enquanto aspira simultaneamente da saída.
14. Prepare o revestimento do canal apical (mistura de 200 μg/mL de colágeno I e 30 μg/mL de colágeno IV em DMEM) (consulte a Tabela de Materiais). Mantenha no gelo.
15. Prepare o revestimento do canal basal (mistura de 15 μg/mL de PLL e 200 μg/mL de colágeno I em DMEM). Mantenha no gelo.
16. Adicione 200 μL de revestimento do canal basal à entrada do canal basal. Conecte a tomada com uma ponta P200 quando a solução de revestimento aparecer na tomada. Dispense a solução até que os volumes da ponteira de entrada e saída sejam iguais e, em seguida, solte a ponteira da pipeta, deixando a ponteira na entrada.
17. Da mesma forma, adicione 200 μL de revestimento do canal apical ao canal apical.
18. Aspirar o excesso de solução da superfície da apara.
19. Verifique se há bolhas em todos os chips. Remova todas as bolhas adicionando mais revestimento de canal ao(s) canal(is) afetado(s).
20. Incubar as aparas durante a noite numa placa de Petri de 150 mm a 37 °C com 5% de CO₂.

4. Semeando o canal basal do chip com HUFs

1. Veja o crescimento de HUFs no frasco ao microscópio diariamente.
2. Uma vez que as culturas de HUF estejam 70% -90% confluentes (~ 3 dias após o plaqueamento), aqueça 25 mL de FM, 5 mL de Dbs livre de Ca²⁺/Mg²⁺ (DPBS (-/-), 10 mL de tripsina/EDTA e 15 mL de solução neutralizante de tripsina (TNS, consulte a Tabela de Materiais) a 37 °C.
3. Aspirar o meio dos frascos. Lave com 5 mL de DPBS (-/-) e aspire novamente.
4. Adicione 4 ml de tripsina-EDTA a cada balão e incube a 37 °C durante 3-5 min até que as células se desprendam.
5. Adicionar 6 ml de TNS a cada balão e transferir a suspensão celular para um tubo cónico de 15 ml.
6. Misturar bem a suspensão com uma pipeta e tomar uma alíquota de 10 μL para a contagem das células. Misture 10 μL de suspensão celular com 10 μL de azul de tripano e conte usando um hemocitômetro.
7. Centrifugar a suspensão da célula a 300 x g durante 5 min à RT. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em FM quente até uma concentração final de 7,5 x 10⁵ células/ml.
8. Lave o canal basal com 200 μL de FM.
9. Aqueça 15 mL de VEM a 37 °C. Lavar o canal apical com 200 μL de VEM.
10. Adicione 200 μL de VEM completo à entrada do canal apical enquanto obstrui a saída com uma ponta de pipeta. Dispense o meio até que os volumes da ponta de entrada e saída sejam iguais e, em seguida, solte a ponta da pipeta da pipeta, deixando a ponta na entrada. Mantenha o canal superior cheio e conectado na entrada e na saída.
11. Pipete lentamente 50 μL de suspensão de células HUF na entrada do canal basal enquanto aspira simultaneamente da saída. Remova a ponta da pipeta da entrada quando ~ 2 μL da suspensão celular permanecerem na ponta da pipeta sem pressionar ou soltar o êmbolo da pipeta para evitar a formação de bolhas. Conecte a entrada e a saída com pontas de pipeta.
12. Verifique se há bolhas sob um microscópio. Se estiverem presentes, lave o canal basal com FM e repita o passo 4.11.
13. Vire os chips conectados de cabeça para baixo em um rack de tubo de 15 mL e incube a 37 ° C com 5% de CO₂ por 1 h. Observe os chips após a incubação e verifique se há fixação da célula.
14. Conecte a saída do canal basal com uma ponta de pipeta. Adicione 200 μL de FM à entrada do canal basal sem empurrar o êmbolo da pipeta para baixo. Solte a ponta da pipeta e deixe o meio fluir livremente através do canal até a ponta da pipeta de saída por fluxo gravitacional.
15. Incubar lascas semeadas com HUF durante a noite a 37 °C com 5% de CO₂.

5. Canal apical do chip de semeadura com células epiteliais vaginais

1. Aqueça 50 mL de VEM a 37 °C.
2. Prepare o revestimento do canal apical (200 μg / mL de colágeno I em DMEM). Mantenha no gelo.
3. Conecte a saída do canal apical com uma ponta de pipeta.
4. Adicione 200 μL de revestimento do canal apical à entrada do canal apical. Dispense a solução de revestimento apical até que os volumes da ponta de entrada e saída sejam iguais e, em seguida, solte a ponta da pipeta da pipeta, deixando a ponta na entrada.
5. Aspire o excesso de solução da superfície do chip.
6. Incube os cavacos a 37 °C com 5% de CO₂ por 1 h.
7. Após 1 h, lave o revestimento do canal apical adicionando 200 μL de VEM à entrada do canal apical enquanto aspira da saída.
8. Verifique o crescimento HVEC sob um microscópio para ~ 70% -90% de confluência.
9. Se as células forem 70% -90% confluentes, aqueça 6 mL de meio de células epiteliais vaginais completas e 4 mL de tripsina/EDTA por frasco, a 37 °C.
10. Aspirar o meio do balão HVEC e lavar com 5 ml de DPBS (-/-) e, em seguida, aspirar.
11. Adicione 4 ml de tripsina a cada frasco e incube a 37 °C com 5% de CO₂ durante 3-5 min até que as células se desprendam.
12. Adicionar 6 ml de VEM ao balão para inactivar a tripsina e transferir a suspensão celular para um tubo cónico de 15 ml.
13. Misturar bem a suspensão com uma pipeta e tomar uma alíquota de 10 μL para a contagem das células. Misture 10 μL de suspensão celular com 10 μL de azul de tripano e conte usando um hemocitômetro.
14. Centrifugar a suspensão da célula a 300 x g durante 5 min à RT. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em VEM até uma concentração final de 3,5-4 milhões de células/ml.
15. Aqueça 25 mL de FM a 37 °C.
16. Conecte a saída do canal apical com uma ponta de pipeta. Pipetar lentamente pelo menos 40 μL de suspensão de células HVEC na entrada do canal apical. Dispense a suspensão da célula até que os volumes da ponteira de entrada e saída sejam iguais e, em seguida, solte a ponteira da pipeta, deixando a ponteira na entrada. Mantenha o canal basal cheio de FM e conectado na entrada e na saída.
17. Aspire cuidadosamente o excesso de meio na superfície dos chips e verifique se há bolhas ao microscópio. Se estiverem presentes, repita o passo 5.16.
18. Coloque os cavacos em uma placa de Petri grande e incube a 37 ° C com 5% de CO₂ durante a noite.
19. No dia seguinte, observe os chips sob um microscópio para fixação celular.
20. Remova as pontas da pipeta das entradas e saídas dos canais apicais e basais.
21. Conecte a saída do canal basal com uma ponta de pipeta e adicione 200 μL de FM à entrada do canal basal sem empurrar o êmbolo da pipeta para baixo. Solte a ponta da pipeta da pipeta e deixe o meio fluir livremente através do canal até a ponta da pipeta de saída por fluxo gravitacional.
22. Repita a etapa 5.21 para o canal apical usando VEM.
23. Incubar as aparas duplamente semeadas a 37 °C com 5% de CO₂ durante 24 h.

6. Conectando chips a vagens e diferenciando células epiteliais vaginais

1. Alíquota de 50 mL de FM e VEM para separar tubos cônicos de 50 mL e aquecer a 37 °C.
2. Desgaseifique os meios FM e VEM aquecidos a 37 °C sob vácuo estéril por 5 min.
3. Desinfete e limpe as bandejas para o Dynamic Flow Module (DFM, consulte a Tabela de Materiais). Retire as cápsulas da embalagem e coloque-as nas bandejas.
4. Adicionar 2 ml de VEM desgaseificado ao reservatório de entrada apical (reservatório superior direito; Figura 1B). Adicione meio ao longo das paredes do reservatório para evitar a formação de bolhas.
5. Adicione 3 mL de FM desgaseificado ao reservatório de entrada basal (reservatório superior esquerdo, Figura 1B). Adicione meio ao longo das paredes do reservatório para evitar a formação de bolhas.
6. Adicione 500 μL de VEM desgaseificado ao reservatório de saída apical (reservatório inferior direito, Figura 1B). Incline a cápsula de forma que o meio cubra toda a superfície inferior do reservatório.
7. Adicione 500 μL de FM desgaseificado ao reservatório de saída basal (reservatório inferior esquerdo, Figura 1B). Incline a cápsula de forma que o meio cubra toda a superfície inferior do reservatório.
8. Deslize as bandejas contendo pods para o DFM e execute o ciclo Prime duas vezes. Verifique se há gotículas saindo das portas na parte inferior de cada pod.
9. Se uma gota não se formar após 4 ciclos "Prime", faça contato direto com a porta dentro do reservatório de saída da cápsula (Figura 1B) e pipete 200 μL do respectivo meio para permitir que o meio flua entre o reservatório e o canal. Isso é chamado de "preparação manual".
10. Remova as pontas das pipetas dos chips e coloque uma gota do respectivo meio sobre todas as portas de cada chip.
11. Deslize os chips nas vagens e coloque-os nas bandejas.
12. Aspire qualquer mídia na superfície dos chips e deslize cada bandeja em um DFM.
13. Defina os seguintes parâmetros no DFM como: Superior e Inferior - Líquido; Fluxo apical (canal superior) - 15 μL/h; Fluxo Basal (Canal Inferior) - 30 μL/h; Alongamento = 0%; Frequência = 0 Hz.
14. Execute o ciclo Regular no DFM e permita o fluxo durante a noite.
15. Após 24 h, altere as configurações de fluxo para 0 μL / h para o canal apical e mantenha o canal basal a uma taxa de fluxo de 30 μL / h por mais 24 h.
16. Prepare 500 mL de meio de diferenciação (DM) adicionando 4 mM de L-glutamina, 20 mM de hidrocortisona, 1x ITES, 20 nM de triiodotironina, 100 μM de O-fosforil etanolamina, 180 μM de adenina, 3,2 mM de cloreto de cálcio, 2% de FBS inativado por calor, 1% de Pen-strep e 120 mL de meio F-12 de Ham ao DMEM de baixa glicose (consulte a Tabela de Materiais) e esterilize por filtro.
17. Aqueça 50 mL de MS a 37 °C.
18. Adicione 20 μL de estradiol 10 μM (consulte a Tabela de Materiais) aos 50 mL de MS, misture bem e desgaseifique sob vácuo estéril por 5 min.
19. Aqueça 50 mL de VEM a 37 °C em banho-maria e desgaseifique sob vácuo estéril por 5 min.
20. Retirar as bandejas do DFM, colocá-las em um BSC e aspirar os meios das cápsulas, evitando as portas nos reservatórios (Figura 1A). Em seguida, adicione 2 mL de VEM ao reservatório de entrada do canal apical e 3 mL de MS ao reservatório de entrada do canal basal.
21. Retorne as bandejas para o DFM e defina o fluxo do canal apical para 15 μL / h e o fluxo do canal basal para 30 μL / h.
22. Deixe o DFM fluir por 4-7 h. Em seguida, pare o fluxo do canal apical ajustando-o para 0 μL / h. Deixe o fluxo do canal basal continuar a 30 μL / h.
23. Troque a mídia seguindo as etapas 6.16-6.19 a cada 48 h.
24. Flua o meio intermitentemente no canal apical por 4-7 h todos os dias por 5 dias adicionais seguindo as etapas 6.20-6.21.
25. Prepare a solução salina balanceada de Hanks com baixa capacidade tamponante com meio de glicose (HBSS (LB / + G)) adicionando 1.26 mM de cloreto de cálcio, 0.49 mM de cloreto de magnésio hexahidratado, 0.406 mM de sulfato de magnésio, 5.33 mM de cloreto de potássio, 137.93 mM de cloreto de sódio, 0.441 mM de fosfato de potássio monobásico e 5.55 mM de D-glicose a dd H₂O (ver Tabela de Materiais); pH 4,8.
26. Prepare 500 mL de DM sem Estreptococos de Caneta adicionando 4 mM de L-glutamina, 20 mM de hidrocortisona, 1x ITES, 20 nM de triiodotironina, 100 μM de O-fosforil etanolamina, 180 μM de adenina, 3,2 mM de cloreto de cálcio, 2% de FBS inativado por calor e 120 mL de meio F-12 de Ham ao DMEM de baixa glicose e esterilize por filtro.
27. No dia 6, substitua o meio do canal apical por (HBSS (LB/+G)) e o meio do canal basal por DM sem estreptococos seguindo as etapas 6.16-6.19.
28. Defina o fluxo no DFM para 15 μL / h para o canal apical e 30 μL / h para o canal basal por 24 h antes de prosseguir com a inoculação bacteriana.

7. Inoculação bacteriana de chips diferenciados

NOTA: Execute as etapas a seguir em um laboratório e BSC que estejam em conformidade com os regulamentos para lidar com micróbios.

1. Calcular o UFC/ml de cada estirpe bacteriana a incluir no inóculo. Misture a quantidade necessária de cada cepa bacteriana para totalizar até ~ 5 x 10⁶ UFC / mL.
2. Centrifugue a mistura a 7.000 x g por 7 min a 4 °C e remova cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspenda o chumbinho (HBSS (LB/+G)). Este será o inóculo bacteriano.
3. Separe os chips das cápsulas. Conecte a saída do canal basal com uma ponta de pipeta e adicione 200 μL de DM sem estreptococos à entrada do canal basal sem empurrar o êmbolo da pipeta para baixo. Solte a ponta da pipeta da pipeta e permita que o meio flua livremente através do canal até a saída por fluxo gravitacional.
4. Adicione 37 μL do inóculo bacteriano à entrada do canal apical, enquanto aspira da saída. Quando restarem cerca de 2 μL na ponta da pipeta, puxe a ponta para fora e tampe a entrada e saída do canal apical com as pontas da pipeta.
5. Para os chips de controle (não inoculados), repita a etapa 7.4 com 37 μL de [HBSS (LB/+G)).
6. Aspire qualquer mídia na superfície do chip. Colocar as aparas numa placa de Petri de 150 mm e incubar a 37 °C com 5% de CO₂ durante 24 h.
7. Coloque as vagens (sem lascas) nas bandejas e coloque-as na incubadora a 37 °C com 5% de CO₂ por 24 h.
8. Aqueça 50 mL de (HBSS (LB / + G)) e 50 mL de DM sem estreptococos a 37 ° C.
9. Adicione 20 μL de 10 μM de Estradiol aos 50 mL de DM sem estreptococos Pen, misture bem e desgaseifique sob vácuo estéril por 5 min. Desgaseifique o (HBSS (LB / + G)) sob vácuo por 5 min.
10. Aspire cuidadosamente o meio nas cápsulas, evitando as portas de entrada e saída do reservatório.
11. Adicione 3 mL de desgaseificado [HBSS (LB / + G)) ao reservatório da cápsula de entrada apical e 500 μL de desgaseificado [HBSS (LB / + G)) ao reservatório da cápsula de saída apical.
12. Adicione 3 mL de DM sem Pen-Strep desgaseificado ao reservatório da cápsula de entrada basal e 500 μL de DM livre de antibióticos desgaseificados ao reservatório da cápsula de saída basal.
13. Deslize as bandejas com as cápsulas (sem os chips) no DFM e execute o ciclo Prime duas vezes. Verifique se há gotículas saindo de cada porta na parte inferior do pod.
    NOTA: Se uma gota não se formar após 4 ciclos "Prime", faça contato direto com a porta dentro do reservatório de saída da cápsula (Figura 1B) e pipete 200 μL do respectivo meio para permitir que o meio flua entre o reservatório e o canal.
14. Remova as pontas da pipeta dos cavacos e coloque uma gota do respectivo meio sobre todas as entradas e saídas do canal.
15. Deslize as batatas fritas nas cápsulas e coloque-as nas bandejas.
16. Aspirar os meios nos reservatórios da cápsula de saída apical e basal e em qualquer meio na superfície das pastilhas. Em seguida, deslize as bandejas para dentro do DFM.
17. Defina os seguintes parâmetros no DFM: Superior e Inferior - Líquido; Fluxo apical (superior) - 40 μL/h; Fluxo Basal (Inferior) - 40 μL/h; Alongamento - 0%; Frequência - 0 Hz. Execute o ciclo Regular .
18. Pare o fluxo após 4 h e colete o efluente, ou seja, o meio nos reservatórios de saída apicais e basais.
19. Meça e registre os volumes de efluentes.
20. Coloque os cavacos de volta no DFM e ajuste a taxa de fluxo apical para 0 μL / h e o fluxo basal para 30 μL / h. Inicie o fluxo para ser executado durante a noite.
21. Alíquota do efluente coletado para vários ensaios planejados e armazene-os em temperaturas apropriadas.
    NOTA: Para medição de UFC, adicione glicerol a uma concentração final de 16% e armazene imediatamente a -80 °C.
22. Aspirar o meio apenas nos reservatórios de saída basal e definir caudais apicais e basais para 40 μL/h no DFM. Inicie o fluxo por 4 h e repita as etapas 7.18-7.21. Esta será a coleta de efluentes por 48 h.
23. Repita a etapa 7.22 por 72 h ou até que o experimento termine.
24. No ponto final do experimento, colete os efluentes seguindo as etapas 7.18-7.19.
25. Prepare a solução de digestão adicionando 1 mg / mL de colagenase IV em TrypLE express. Aquecer 10 ml de solução de digestão a 37 °C.
26. Conecte a porta de saída do canal basal com uma ponta de pipeta. Adicione 100 μL de solução de digestão ao canal basal. Misture bem e, usando uma pipeta, colete toda a solução do canal em um tubo rotulado como 'Tubo B'.
27. Conecte a porta de saída do canal apical com uma ponta de pipeta. Adicione 100 μL de solução de digestão ao canal apical. Misture bem e, usando uma pipeta, colete toda a solução do canal em um tubo rotulado como 'Tubo A'.
28. Adicione mais 100 μL da solução de digestão às entradas do canal apical e basal enquanto obstrui as saídas com ponteiras de pipeta. Incube os cavacos e os tubos A e B a 37 °C por 1-1.5 h.
29. Misture bem o conteúdo da digestão dentro dos canais usando as pontas conectadas já colocadas nas entradas e saídas. Colete o conteúdo dos canais apicais e basais para os tubos A e B, respectivamente. Estes são os resumos apicais e basais do chip.
30. Conte as células no Tubo A usando um hemocitômetro. Além disso, remova uma alíquota dos resumos de cavacos para medição de UFC seguindo a etapa 7.21.

8. Análise de efluentes e digestores de cavacos

1. Para a enumeração de bactérias dos efluentes e digestos, diluir seriadamente os efluentes ou digestos em DPBS estéril (-/-) e placa em uma placa de mídia adequada, incubar a 37 ° C por 24-48 h e contar as colônias na placa.
2. Para a medição do pH, recolher 10 μL do efluente de 72 h imediatamente após a recolha e utilizar uma faixa de pH para medir o pH do efluente.
3. Para a análise das citocinas, utilizar os efluentes para detectar citocinas específicas utilizando ensaio baseado em Luminex, ELISA ou qualquer outra técnica aplicável^29,30.

Resultados

A vagina humana é revestida por um epitélio estratificado que se sobrepõe a um estroma colágeno rico em fibroblastos. Para modelar isso, uma interface de tecido foi criada pela cultura de epitélio vaginal humano primário e fibroblastos em lados opostos de uma membrana porosa comum dentro de um dispositivo Organ Chip microfluídico de dois canais. A formação do epitélio vaginal é monitorada por meio de imagens microscópicas de campo claro, que revelam a formação de uma folha contínua de células que forma pr...

Discussão

Modelos in vitro anteriores da vagina humana não replicam fielmente as estruturas do tecido vaginal, o fluxo de fluido e as interações hospedeiro-patógeno^19,22. Os modelos animais também são limitados pela variação interespécies no microbioma e diferenças no ciclo estral ou menstrual^19,22. Este manuscrito descreve um protocolo para criar um modelo de Chip de Órgão da vagina humana que...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Steriflip	Millipore	SCGP00525	To degas media
2 channel chip	Emulate	BRK-S1-WER-24	Part of the two-channel Chip kit
200 μL barrier tips (or filter tips)	Thomas Scientific, SHARP	1159M40	Tips used for chip seeding
Activation Reagent 1 (or ER-1 powder)	Emulate	Chip S1 Basic Research kit-24PK	Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature -20 °C
Activation Reagent 2 (or ER-2 solution)	Emulate	Chip S1 Basic Research kit-24PK	Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature 4 °C
Adenine	Sigma Aldrich	A2786	Component of the Differentiation media
Brucella blood agar plates	VWR International Inc.	89405-032	with Hemin and Vitamin K; For the enumeration of Gardnerella vaginalis
Ca2+ and Mg2+ free DPBS (DPBS (-/-)	ScienCell	303	For washing cells
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C5670	Component of the Differentiation media
Calcium chloride (anhyd.)	Sigma Aldrich	499609	Component of HBSS (LB/+G)
Collagen I	Corning	354236	For the coating solution for HVEC
Collagen IV	Sigma Aldrich	C7521	For the coating solution for HVEC
Collagenase IV	Gibco	17104019	For the dissociation of cells from the Vagina Chips
Complete fibroblast medium	ScienCell	2301	Media for the culture of HUF
Complete vaginal epithelium medium	Lifeline	LL-0068	Media for the culture of HVEC
D-Glucose (dextrose)	Sigma Aldrich	158968	Component of HBSS (LB/+G)
DMEM (Low Glucose)	Thermofisher	12320-032	Component of the Differentiation media
Dynamic Flow Module (or Zoë)	Emulate	Zoë-CM1	Regulates the flow rate of the chips
Ham's F12	Thermofisher	11765-054	Component of the Differentiation media
Heat inactivated FBS	Thermofisher	10438018	Component of the Differentiation media
Human uterine fibroblasts	ScienCell	7040	HUF
Human vaginal epithelial cells	Lifeline	FC-0083	HVEC
Hydrocortisone	Sigma Aldrich	H0396	Component of the Differentiation media
ITES	Lonza	17-839Z	Component of the Differentiation media
L-glutamine	Thermofisher	25030081	Component of the Differentiation media
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	M2393	Component of HBSS (LB/+G)
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	M1880	Component of HBSS (LB/+G)
MRS agar plates	VWR International Inc.	89407-214	For enumeration of Lactobacillus
O-phosphorylethanolamine	Sigma Aldrich	P0503	Component of the Differentiation media
Pen/Strep	Thermofisher	15070063	Component of the Differentiation media
pH strips	Fischer-Scientific	13-640-520	For measurement of pH
Pods (1/chip)	Emulate	BRK-S1-WER-24	Part of the two-channel Chip kit
Poly-L-lysine	ScienCell	403	For the coating solution for HUFs
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911	Component of HBSS (LB/+G)
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P0662	Component of HBSS (LB/+G)
Sterile 80% glycerol	MP Biomedicals	113055034	For freezing bacterial samples
Triiodothyronine	Sigma Aldrich	T6397	Component of the Differentiation media
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma Aldrich	T8154	For counting live/dead cells
TrypLE Express	Thermofisher	12605010	For the dissociation of cells from the Vagina Chips
Trypsin Neutralizing Solution (TNS)	ScienCell	113	For neutralization of Trypsin
Trypsin/EDTA Solutiom (0.25%)	ScienCell	103	For cell dissociation
β-estradiol	Sigma Aldrich	E2257	Hormone for differentiation media