Modellierung gesunder und dysbiotischer vaginaler Mikroumgebungen in einer menschlichen Vagina-on-a-Chip

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Erstellung eines mikrofluidischen Vagina-on-a-Chip-Kulturgeräts (Vagina Chip) beschrieben, das die Untersuchung der Interaktionen des menschlichen Wirts mit einem lebenden vaginalen Mikrobiom unter mikroaerophilen Bedingungen ermöglicht. Dieser Chip kann sowohl als Werkzeug zur Erforschung von Vaginalerkrankungen als auch zur Entwicklung und Erprobung möglicher therapeutischer Gegenmaßnahmen eingesetzt werden.

Zusammenfassung

Die Gesundheit von Frauen, und insbesondere Erkrankungen des weiblichen Fortpflanzungstrakts (FRT), haben nicht die Aufmerksamkeit erhalten, die sie verdienen, obwohl ein ungesundes Fortpflanzungssystem zu lebensbedrohlichen Krankheiten, Unfruchtbarkeit oder unerwünschten Folgen während der Schwangerschaft führen kann. Ein Hindernis auf diesem Gebiet besteht darin, dass es einen Mangel an präklinischen, experimentellen Modellen gibt, die die Physiologie und Pathophysiologie der FRT originalgetreu nachahmen. Aktuelle In-vitro - und Tiermodelle rekapitulieren die hormonellen Veränderungen, mikroaeroben Bedingungen und Wechselwirkungen mit dem vaginalen Mikrobiom nicht vollständig. Das Aufkommen der mikrofluidischen Kulturtechnologie Organ-on-a-Chip (Organ Chip), die Gewebe-Gewebe-Grenzflächen, die Gefäßperfusion, interstitielle Flüssigkeitsflüsse und die physikalische Mikroumgebung einer wichtigen Untereinheit menschlicher Organe nachahmen kann, kann möglicherweise als Lösung für dieses Problem dienen. Kürzlich wurde ein humaner Vagina-Chip entwickelt, der die Co-Kultur von menschlichen vaginalen mikrobiellen Konsortien mit primärem humanem Vaginalepithel unterstützt, das ebenfalls mit dem vaginalen Stroma verbunden ist und einen dynamischen Flüssigkeitsfluss erfährt. Dieser Chip repliziert die physiologischen Reaktionen der menschlichen Vagina auf gesunde und dysbiotische Mikrobiome. Ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von menschlichen Vagina-Chips wurde in diesem Artikel beschrieben.

Einleitung

Ein vaginales Mikrobiom, das von Lactobacillus spp. dominiert wird und zur Aufrechterhaltung eines sauren Mikromilieus beiträgt, spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der weiblichen Fortpflanzungsgesundheit¹. Manchmal kann es jedoch zu einer Veränderung in der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaften kommen, aus denen das Mikrobiom besteht, was zu einer Zunahme der Vielfalt der Vaginalbakterien führt. Diese dysbiotischen Veränderungen, die oft zu einem Wechsel von einem Lactobacillus-dominierten Zustand zu einem Zustand führen, der von vielfältigeren anaeroben Bakterienarten (z. B. Gardnerella vaginal....

Protokoll

Diese Forschung wurde in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien für die Verwendung menschlicher Zellen durchgeführt. Die Zellen wurden kommerziell beschafft (siehe Materialtabelle). Alle Schritte sollten aseptisch in einer Biosicherheitswerkbank (BSC) durchgeführt werden. Verwenden Sie für dieses Protokoll nur Filter- (oder Barriere-) Pipettenspitzen.

1. Kultivierung menschlicher Vaginalepithelzellen

1. 50 ml vaginales Epithelmedium (VEM, siehe Materialtabelle) auf 37 °C erwärmen.
2. Aliquotieren Sie 9 mL VEM auf ein 15 mL Röhrchen. Tauen Sie dann ein Fläschchen ....

Diskussion

Bisherige In-vitro-Modelle der menschlichen Vagina replizieren die Strukturen des vaginalen Gewebes, den Flüssigkeitsfluss und die Wechselwirkungen zwischen Wirt und Krankheitserreger nicht originalgetreu ^19,22. Tiermodelle sind auch durch die Variation des Mikrobioms zwischen den Arten und Unterschiede im Brunst- oder Menstruationszyklus begrenzt^19,22. Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Steriflip	Millipore	SCGP00525	To degas media
2 channel chip	Emulate	BRK-S1-WER-24	Part of the two-channel Chip kit
200 μL barrier tips (or filter tips)	Thomas Scientific, SHARP	1159M40	Tips used for chip seeding
Activation Reagent 1 (or ER-1 powder)	Emulate	Chip S1 Basic Research kit-24PK	Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature -20 °C
Activation Reagent 2 (or ER-2 solution)	Emulate	Chip S1 Basic Research kit-24PK	Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature 4 °C
Adenine	Sigma Aldrich	A2786	Component of the Differentiation media
Brucella blood agar plates	VWR International Inc.	89405-032	with Hemin and Vitamin K; For the enumeration of Gardnerella vaginalis
Ca2+ and Mg2+ free DPBS (DPBS (-/-)	ScienCell	303	For washing cells
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C5670	Component of the Differentiation media
Calcium chloride (anhyd.)	Sigma Aldrich	499609	Component of HBSS (LB/+G)
Collagen I	Corning	354236	For the coating solution for HVEC
Collagen IV	Sigma Aldrich	C7521	For the coating solution for HVEC
Collagenase IV	Gibco	17104019	For the dissociation of cells from the Vagina Chips
Complete fibroblast medium	ScienCell	2301	Media for the culture of HUF
Complete vaginal epithelium medium	Lifeline	LL-0068	Media for the culture of HVEC
D-Glucose (dextrose)	Sigma Aldrich	158968	Component of HBSS (LB/+G)
DMEM (Low Glucose)	Thermofisher	12320-032	Component of the Differentiation media
Dynamic Flow Module (or Zoë)	Emulate	Zoë-CM1	Regulates the flow rate of the chips
Ham's F12	Thermofisher	11765-054	Component of the Differentiation media
Heat inactivated FBS	Thermofisher	10438018	Component of the Differentiation media
Human uterine fibroblasts	ScienCell	7040	HUF
Human vaginal epithelial cells	Lifeline	FC-0083	HVEC
Hydrocortisone	Sigma Aldrich	H0396	Component of the Differentiation media
ITES	Lonza	17-839Z	Component of the Differentiation media
L-glutamine	Thermofisher	25030081	Component of the Differentiation media
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	M2393	Component of HBSS (LB/+G)
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	M1880	Component of HBSS (LB/+G)
MRS agar plates	VWR International Inc.	89407-214	For enumeration of Lactobacillus
O-phosphorylethanolamine	Sigma Aldrich	P0503	Component of the Differentiation media
Pen/Strep	Thermofisher	15070063	Component of the Differentiation media
pH strips	Fischer-Scientific	13-640-520	For measurement of pH
Pods (1/chip)	Emulate	BRK-S1-WER-24	Part of the two-channel Chip kit
Poly-L-lysine	ScienCell	403	For the coating solution for HUFs
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911	Component of HBSS (LB/+G)
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P0662	Component of HBSS (LB/+G)
Sterile 80% glycerol	MP Biomedicals	113055034	For freezing bacterial samples
Triiodothyronine	Sigma Aldrich	T6397	Component of the Differentiation media
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma Aldrich	T8154	For counting live/dead cells
TrypLE Express	Thermofisher	12605010	For the dissociation of cells from the Vagina Chips
Trypsin Neutralizing Solution (TNS)	ScienCell	113	For neutralization of Trypsin
Trypsin/EDTA Solutiom (0.25%)	ScienCell	103	For cell dissociation
β-estradiol	Sigma Aldrich	E2257	Hormone for differentiation media