在人类阴道芯片中模拟健康和生态失调的阴道微环境

摘要

本文介绍了一种用于创建微流体阴道芯片（Vagina Chip）培养装置的方案，该装置能够在微需氧条件下研究人类宿主与活体阴道微生物组的相互作用。该芯片可以用作研究阴道疾病的工具，以及开发和测试潜在的治疗对策。

摘要

妇女的健康，特别是女性生殖道疾病（FRT）没有得到应有的重视，尽管不健康的生殖系统可能导致危及生命的疾病、不孕症或怀孕期间的不良后果。该领域的一个障碍是，缺乏忠实模仿FRT的生理学和病理生理学的临床前实验模型。 目前的 体外 和动物模型不能完全概括荷尔蒙变化、微需氧条件以及与阴道微生物组的相互作用。Organ-on-a-Chip（器官芯片）微流控培养技术的出现，可以模拟组织-组织界面、血管灌注、间质液流动以及人体器官主要亚基的物理微环境，有可能解决这个问题。最近，已经开发出一种人类阴道芯片，该芯片支持人类阴道微生物联盟与原代人类阴道上皮共培养，该联盟也与阴道基质接触并体验动态流体流动。该芯片复制了人类阴道对健康和生态失调微生物组的生理反应。本文描述了创建人类阴道芯片的详细协议。

引言

以乳酸杆菌属为主的阴道微生物组有助于维持酸性微环境，在维持女性生殖健康方面发挥着重要作用¹.然而，有时构成微生物组的微生物群落的组成可能会发生变化，从而导致阴道细菌的多样性增加。这些菌群失调的变化通常导致从乳酸菌为主的状态转变为以更多样化的厌氧菌物种（例如阴道加德纳菌）为主的状态，与生殖系统的各种疾病有关，例如细菌性阴道病、萎缩性阴道炎、尿路感染、外阴阴道念珠菌病、尿道炎和绒毛膜羊膜炎 2,3,4,5 .这些疾病反过来又增加了女性患性传播疾病和盆腔炎的机会6,7,8,9。它们还对孕妇造成早产和流产的更高风险 10,11,12 并且还与不孕症有关

研究方案

这项研究是按照使用人类细胞的机构指南进行的。这些细胞是通过商业方式获得的（参见 材料表）。所有步骤都应在生物安全柜 （BSC） 中无菌进行。对于此协议，仅使用过滤器（或屏障）移液器吸头。

1. 培养人阴道上皮细胞

1. 将50mL阴道上皮培养基（VEM，参见 材料表）加热至37°C。
2. 将 9 mL VEM 分装到 15 mL 试管中。然后，解冻一小瓶人阴道上皮细胞 （HVEC），并将其添加到含有 VEM 的试管中。
3. 将 15 mL 管在室温 （RT） 下以 300 x g 离心 5 分钟并吸出上清液，留下沉淀。
4. 轻轻地将沉淀重悬于 2 mL VEM 中，并将 1 mL 添加到含有 14 mL VEM 的两个 T75 烧瓶中。
5. 将烧瓶在37°C与5%CO 2孵育_。 每 2 天更换一次 VEM，直到 HVEC 大约 70% 汇合（约 5 天）。

2. 培养人子宫成纤维细胞

1. 在双蒸水 （ddH₂O） 中制备 10 mL 15 μg/mL 聚-L-赖氨酸溶液 （PLL）。向两个T75烧瓶中的每一个中加入5mL ....

讨论

过去人类阴道的体外模型不能忠实地复制阴道组织结构、液体流动和宿主-病原体相互作用^19,22。动物模型还受到微生物组物种间变异以及发情或月经周期差异的限制^19,22。这份手稿描述了一种协议，用于创建人类阴道的器官芯片模型，该模型可以有效地模仿人类对健康和生态失调微生物群落的反应。

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Steriflip	Millipore	SCGP00525	To degas media
2 channel chip	Emulate	BRK-S1-WER-24	Part of the two-channel Chip kit
200 μL barrier tips (or filter tips)	Thomas Scientific, SHARP	1159M40	Tips used for chip seeding
Activation Reagent 1 (or ER-1 powder)	Emulate	Chip S1 Basic Research kit-24PK	Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature -20 °C
Activation Reagent 2 (or ER-2 solution)	Emulate	Chip S1 Basic Research kit-24PK	Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature 4 °C
Adenine	Sigma Aldrich	A2786	Component of the Differentiation media
Brucella blood agar plates	VWR International Inc.	89405-032	with Hemin and Vitamin K; For the enumeration of Gardnerella vaginalis
Ca2+ and Mg2+ free DPBS (DPBS (-/-)	ScienCell	303	For washing cells
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C5670	Component of the Differentiation media
Calcium chloride (anhyd.)	Sigma Aldrich	499609	Component of HBSS (LB/+G)
Collagen I	Corning	354236	For the coating solution for HVEC
Collagen IV	Sigma Aldrich	C7521	For the coating solution for HVEC
Collagenase IV	Gibco	17104019	For the dissociation of cells from the Vagina Chips
Complete fibroblast medium	ScienCell	2301	Media for the culture of HUF
Complete vaginal epithelium medium	Lifeline	LL-0068	Media for the culture of HVEC
D-Glucose (dextrose)	Sigma Aldrich	158968	Component of HBSS (LB/+G)
DMEM (Low Glucose)	Thermofisher	12320-032	Component of the Differentiation media
Dynamic Flow Module (or Zoë)	Emulate	Zoë-CM1	Regulates the flow rate of the chips
Ham's F12	Thermofisher	11765-054	Component of the Differentiation media
Heat inactivated FBS	Thermofisher	10438018	Component of the Differentiation media
Human uterine fibroblasts	ScienCell	7040	HUF
Human vaginal epithelial cells	Lifeline	FC-0083	HVEC
Hydrocortisone	Sigma Aldrich	H0396	Component of the Differentiation media
ITES	Lonza	17-839Z	Component of the Differentiation media
L-glutamine	Thermofisher	25030081	Component of the Differentiation media
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	M2393	Component of HBSS (LB/+G)
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	M1880	Component of HBSS (LB/+G)
MRS agar plates	VWR International Inc.	89407-214	For enumeration of Lactobacillus
O-phosphorylethanolamine	Sigma Aldrich	P0503	Component of the Differentiation media
Pen/Strep	Thermofisher	15070063	Component of the Differentiation media
pH strips	Fischer-Scientific	13-640-520	For measurement of pH
Pods (1/chip)	Emulate	BRK-S1-WER-24	Part of the two-channel Chip kit
Poly-L-lysine	ScienCell	403	For the coating solution for HUFs
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911	Component of HBSS (LB/+G)
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P0662	Component of HBSS (LB/+G)
Sterile 80% glycerol	MP Biomedicals	113055034	For freezing bacterial samples
Triiodothyronine	Sigma Aldrich	T6397	Component of the Differentiation media
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma Aldrich	T8154	For counting live/dead cells
TrypLE Express	Thermofisher	12605010	For the dissociation of cells from the Vagina Chips
Trypsin Neutralizing Solution (TNS)	ScienCell	113	For neutralization of Trypsin
Trypsin/EDTA Solutiom (0.25%)	ScienCell	103	For cell dissociation
β-estradiol	Sigma Aldrich	E2257	Hormone for differentiation media