إنتاج دفعات ناقلات مرتبطة ب Adeno عالية الإنتاجية باستخدام خلايا تعليق HEK293

Summary

هنا ، يتم تقديم بروتوكول إنتاج AAV قائم على الخلايا HEK293 ، مما يؤدي إلى تقليل الوقت والعمالة اللازمة لإنتاج النواقل باستخدام المكونات المتاحة لأغراض البحث من البائعين التجاريين.

Abstract

النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي (AAVs) هي أداة رائعة للتحقيق في الجهاز العصبي المركزي (CNS). قفيصات مبتكرة ، مثل AAV. PHP.eB ، تظهر نقيضا واسعا للجهاز العصبي المركزي عن طريق الحقن في الوريد في الفئران. لتحقيق نقل مماثل ، هناك حاجة إلى عيار أعلى بمقدار 100 ضعف (الحد الأدنى من 1 × 10¹¹ نسخة جينوم / فأر) مقارنة بالحقن المباشر في حمة الجهاز العصبي المركزي. في مجموعتنا ، إنتاج AAV ، بما في ذلك AAV. يعتمد PHP.eB على خلايا HEK293T الملتصقة وطريقة النقل الثلاثي. إن تحقيق غلات عالية من AAV مع الخلايا الملتصقة يستلزم عملية كثيفة العمالة والمواد. دفع هذا القيد إلى تطوير بروتوكول لزراعة الخلايا القائمة على التعليق في الأنابيب المخروطية. تمت مقارنة AAVs المتولدة في الخلايا الملتصقة بطريقة إنتاج التعليق. تمت مقارنة الثقافة في التعليق باستخدام كواشف النقل Polyethylenimine أو TransIt. تم تنقية ناقلات AAV بواسطة الطرد المركزي الفائق التدرج اليوديكسانول متبوعا بتبادل المخزن المؤقت والتركيز باستخدام مرشح الطرد المركزي. باستخدام طريقة الالتصاق ، حققنا متوسط 2.6 × 10¹² نسخة جينوم إجمالا (GC) ، في حين أن طريقة التعليق و Polyethylenimine أنتجت 7.7 × 10¹² GC في المجموع ، وأسفرت TransIt عن 2.4 × 10¹³ GC في المجموع. لا يوجد فرق في كفاءة النقل في الجسم الحي بين النواقل المنتجة مع الالتصاق مقارنة بنظام خلية التعليق. باختصار ، تم تقديم بروتوكول إنتاج AAV قائم على خلية التعليق HEK293 ، مما أدى إلى تقليل مقدار الوقت والعمالة اللازمة لإنتاج النواقل مع تحقيق عوائد أعلى من 3 إلى 9 مرات باستخدام المكونات المتاحة من البائعين التجاريين لأغراض البحث.

Introduction

تم اكتشاف الفيروس المرتبط بالغدي (AAV) في عام 1965 ومنذ ذلك الحين تم استخدامه في عدد لا يحصى من التطبيقات¹. تم تطبيق AAVs في أبحاث علم الأعصاب لدراسة الجينات والوظيفة العصبية ، أو رسم خرائط للدوائر العصبية ، أو إنتاج نماذج حيوانية للمرض². تقليديا ، يتم ذلك عن طريق الحقن مباشرة في موقع الاهتمام ، لأن معظم الأنماط المصلية الطبيعية لا تعبر حاجز الدم في الدماغ أو تحتاج إلى جرعة عالية للقيام بذلك^1،2،3.

مع اكتشاف AAV. PHP.B⁴ والجيل التالي من القفيصات مثل AAV. PHP.eB^....

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام التابعة للأكاديمية الملكية الهولندية للعلوم (KNAW) وكانت متوافقة مع القانون الهولندي بشأن التجارب على بموجب المشروع رقم AVD8010020199126. في الشكل 1 ، يتم توفير نظرة عامة تخطيطية للبروتوكول الكامل. من خلايا البذر إلى تنقية AAV ، يستغرق البروتوكول 6 أيام حتى يكتمل.

1. إعداد الكاشف

1. تنقية البلازميد
   1. إجراء استخراج البلازميد كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة مع بعض التعديلات لضمان عقم البلازميدات.
   2. تحضير 70 ٪ من الإيثانول باستخدام الماء المقطر المعقم والإيثانول المطلق.
   3. بعد خطوة الطرد....

النتائج

تستخدم معظم المختبرات الأكاديمية خلايا HEK293T الملتصقة لإنتاج AAV ^8,9. في حين أن هذا يعمل بشكل جيد نسبيا عندما تكون هناك حاجة إلى كميات صغيرة من AAV للحقن المباشر ، هناك حاجة إلى عيار أعلى 100 مرة (الحد الأدنى 1 ×^{10 11} GC / الماوس) لتحقيق نقل مماثل مع قفيصات جهازية م?.......

Discussion

الإدارة الجهازية ل AAV هي أداة قوية لنقل الجينات إلى الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك ، فإن إنتاج AAV هو عملية مكلفة وشاقة. باستخدام خلايا التعليق ، يتم تقليل العمالة والبلاستيك مقارنة بالثقافة الملتصقة HEK293T على ألواح 15 سم² . علاوة على ذلك ، فإن الأنابيب المخروطية المنفذة هنا سهلة التعامل ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm - 50Pk	Beckman Coulter	342414
Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4x1000,	eppendorf	5920701002
Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml	Infors HT/ TPP	587633
Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets	eppendorf	5820747005
Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes	eppendorf	5948000315
Distilled Water	Gibco	15230147
DNase I recombinant, RNase-free	Roche	4716728001
DNase I recombinant, RNase-free	Roche	4716728001
DPBS, calcium, magnesium	Gibco	14040091
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2	Fisher	FB12566504
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45	Fisher	FB12566505
Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube	Infors HT/ TPP	31362
Holder for 600 ml cell culture tube	Infors HT/ TPP	66129
Incubator Minitron 50 mm	Infors HT	500043
LV-MAX Production Medium	Gibco	A3583401
N-Tray Universal	Infors HT/ TPP	31321
OptiPrep - Iodixanol	Serumwerk bernburg	1893
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)	Poly-sciences	24765-100
Phenol red solution	Sigma-Aldrich	72420100
Poly(ethylene glycol) 8000	Sigma-Aldrich	89510
TransIT-VirusGEN	Mirus	Mir 6706
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	5250061
TubeSpin Bioreactors-50ml	TTP	87050
TubeSpin Bioreactors-600ml	TTP	87600
Viral Production Cells	Gibco	A35347
Vivaspin 20 MWCO 100 000	Cytvia	28932363