HEK293浮遊細胞を用いた高収率アデノ関連ベクターバッチの作製(英語)

要約

ここでは、懸濁液HEK293細胞ベースのAAV生産プロトコルを提示し、その結果、商用ベンダーから研究目的で入手可能なコンポーネントを使用してベクターを生産するために必要な時間と労力を削減します。

要約

アデノ随伴ウイルスベクター(AAV)は、中枢神経系(CNS)を調査するための優れたツールです。AAVなどの革新的なカプシド。PHP.eBは、マウスの静脈内注射による中枢神経系の広範な形質導入を示しています。同等の形質導入を実現するには、中枢神経系実質への直接注入と比較して、100倍高い力価(最小1 x 10¹¹ ゲノムコピー/マウス)が必要です。私たちのグループでは、AAVを含むAAV生産。PHP.eBは、接着HEK293T細胞とトリプルトランスフェクション法に依存しています。接着細胞でAAVの高収率を達成するには、労力と材料を大量に消費するプロセスが必要です。この制約により、コニカルチューブでの懸濁液ベースの細胞培養のプロトコルが開発されました。接着細胞で生成したAAVを懸濁液製造法と比較しました。トランスフェクション試薬ポリエチレンイミンまたはTransItを用いた懸濁液中での培養を比較しました。AAVベクターは、ヨウジキサノールグラジエント超遠心分離により精製し、その後、バッファー交換および遠心フィルターを用いた濃縮を行いました。アドヒレント法では平均2.6 x 10¹² GCを達成したが、懸濁法とポリエチレンイミンでは合計7.7 x 10¹² GC、TransItでは合計2.4 x 10¹³ GCであった。接着液で作製したベクター間の in vivo 形質導入効率は、浮遊細胞系と比較して差はありません。要約すると、懸濁液HEK293細胞ベースのAAV生産プロトコルが導入され、ベクター生産に必要な時間と労力が削減され、研究目的で商用ベンダーから入手可能なコンポーネントを使用して3〜9倍の収率を達成します。

概要

アデノ随伴ウイルス(AAV)は1965年に発見され、それ以来、^{無数の用途で}使用されてきました1。AAVは、遺伝子や神経細胞の機能の研究、神経回路のマッピング、疾患の動物モデルの作成など、神経科学研究に応用されています²。伝統的に、これはほとんどの自然な血清型が血液脳関門を通らないか、またはそうするために高線量を必要とするので、興味のある部位に直接注入することによって行われます^1,2,3。

AAVの発見により。PHP.B⁴ や AAV などの次世代の capsid です。PHP.eB⁵ と AAV.CAP-B10⁶は、簡易な全身注射を用いて中枢神経系(CNS)を標的とすることができる。空間マッピングにより、AAV の標的となる細胞が明らかになります。PHP.eB(セルラーレベル^6,7)。これらのカプシドは、特定のプロモーター/エンハンサーと組....

プロトコル

すべての実験手順は、オランダ王立科学アカデミー(KNAW)の動物実験委員会によって承認され、プロジェクト番号AVD8010020199126に基づくオランダの動物実験法に準拠していました。 図1に、完全なプロトコルの概略図を示します。細胞の播種からAAV精製まで、プロトコルは完了するまでに6日かかります。

1. 試薬調製

1. プラスミド精製
   1. プラスミドの無菌性を確保するために、メーカーの説明に従ってプラスミド抽出を数回調整して実行します。
   2. 滅菌蒸留水と無水エタノールを使用して70%エタノールを調製します。
   3. イソプロパノール遠心分離ステップの後、フローキャビネットフードでプラスミドを乾燥させ、滅菌済みの70%エタノールをチューブに加えます。エタノール沈殿後、フローキャビネットフードでプラスミドを乾燥させ、プラスミドを滅菌蒸留水に再懸濁します。滅菌された微量遠心チューブを使用するように注意してください。
   4. 定量、制限酵素分析、および必要に応じてシーケンシングのためにアリコートを採取します。突然変異は収量に悪影響を与える可能性があるため、逆末端反復配列(ITR)の完全性を確認することをお勧めします。サンプル濃度を 1 μg/μL に調整します。
2. 10x ....

ディスカッション

AAVの全身投与は、中枢神経系への遺伝子導入のための強力なツールです。しかし、AAVの製造は高価で手間のかかるプロセスです。浮遊細胞を使用することで、^15cm2 プレート上のHEK293Tの接着培養と比較して、労力とプラスチックが削減されます。さらに、ここに実装されている円錐形のチューブは取り扱いが簡単で、実験室のスペースを最大限に活用できます。このプロトコルは、2人.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm - 50Pk	Beckman Coulter	342414
Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4x1000,	eppendorf	5920701002
Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml	Infors HT/ TPP	587633
Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets	eppendorf	5820747005
Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes	eppendorf	5948000315
Distilled Water	Gibco	15230147
DNase I recombinant, RNase-free	Roche	4716728001
DNase I recombinant, RNase-free	Roche	4716728001
DPBS, calcium, magnesium	Gibco	14040091
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2	Fisher	FB12566504
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45	Fisher	FB12566505
Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube	Infors HT/ TPP	31362
Holder for 600 ml cell culture tube	Infors HT/ TPP	66129
Incubator Minitron 50 mm	Infors HT	500043
LV-MAX Production Medium	Gibco	A3583401
N-Tray Universal	Infors HT/ TPP	31321
OptiPrep - Iodixanol	Serumwerk bernburg	1893
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)	Poly-sciences	24765-100
Phenol red solution	Sigma-Aldrich	72420100
Poly(ethylene glycol) 8000	Sigma-Aldrich	89510
TransIT-VirusGEN	Mirus	Mir 6706
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	5250061
TubeSpin Bioreactors-50ml	TTP	87050
TubeSpin Bioreactors-600ml	TTP	87600
Viral Production Cells	Gibco	A35347
Vivaspin 20 MWCO 100 000	Cytvia	28932363