Production de lots de vecteurs associés à l’adénographie à haut rendement à l’aide de cellules en suspension HEK293

Résumé

Ici, un protocole de production d’AAV à base de cellules HEK293 en suspension est présenté, ce qui permet de réduire le temps et la main-d’œuvre nécessaires à la production de vecteurs à l’aide de composants disponibles à des fins de recherche auprès de fournisseurs commerciaux.

Résumé

Les vecteurs viraux adéno-associés (AAV) sont un outil remarquable pour étudier le système nerveux central (SNC). Capsides innovantes, telles que l’AAV. PHP.eB, démontrent une transduction étendue du SNC par injection intraveineuse chez la souris. Pour obtenir une transduction comparable, un titre 100 fois plus élevé (au moins 1 x 10¹¹ copies du génome/souris) est nécessaire par rapport à l’injection directe dans le parenchyme du SNC. Dans notre groupe, la production d’AAV, y compris l’AAV. PHP.eB s’appuie sur des cellules HEK293T adhérentes et la méthode de triple transfection. L’obtention de rendements élevés d’AAV avec des cellules adhérentes implique un processus à forte intensité de main-d’œuvre et de matériel. Cette contrainte a incité le développement d’un protocole de culture cellulaire en suspension dans des tubes coniques. Les AAV générés dans les cellules adhérentes ont été comparés à la méthode de production en suspension. Culture en suspension à l’aide de réactifs de transfection Polyéthylénimine ou TransIt ont été comparées. Les vecteurs AAV ont été purifiés par ultracentrifugation par gradient d’iodixanol suivie d’un échange de tampon et d’une concentration à l’aide d’un filtre centrifuge. Avec la méthode adhérente, nous avons obtenu une moyenne de 2,6 x 10¹² copies du génome (GC) au total, tandis que la méthode en suspension et la polyéthylénimine ont donné 7,7 x 10¹² GC au total, et TransIt a donné 2,4 x 10¹³ GC au total. Il n’y a pas de différence dans l’efficacité de la transduction in vivo entre les vecteurs produits avec des adhérents et ceux du système de cellules en suspension. En résumé, un protocole de production d’AAV à base de cellules HEK293 en suspension est introduit, ce qui permet de réduire le temps et la main-d’œuvre nécessaires à la production de vecteurs tout en obtenant des rendements 3 à 9 fois plus élevés en utilisant des composants disponibles auprès de fournisseurs commerciaux à des fins de recherche.

Introduction

Le virus adéno-associé (AAV) a été découvert en 1965 et a depuis été utilisé dans une myriade d’applications¹. Les AAV ont été utilisés dans la recherche en neurosciences pour étudier les gènes et la fonction neuronale, cartographier les neurocircuits ou produire des modèles animaux pour la maladie². Traditionnellement, cela se fait en injectant directement sur le site d’intérêt, car la plupart des sérotypes naturels ne traversent pas la barrière hémato-encéphalique ou n’ont pas besoin d’une dose élevée pour le faire ^1,2,3.

Avec la découverte de l’AAV. PHP.B⁴ et les capsides de nouvelle génération telles que l’AAV. PHP.eB⁵ et AAV. CAP-B10⁶, il est possible de cibler le système nerveux central (SNC) par une simple injection systémique. La cartographie spatiale révèle les cellules ciblées par AAV. PHP.eB au niveau cellulaire ^6,7. En combinaison avec des promoteurs/amplificateurs spécifiques, ces capsides offrent de nombreuses possibilités aux neuroscientifiques d’étudier les gènes et la fonction cérébrale par administration non invasive d’AAV ^4,8.

Alors qu’une dose plus faible est nécessaire pour l’AAV. PHP.eB (généralement 1 à 5 x 10¹¹ copies du génome (GC)/souris) par rapport à AAV9 (4 x 10¹² GC/souris)⁷, il faut produire encore plus de vecteurs par rapport aux stratégies d’injection directe (généralement 1 x 10⁹ GC/μL injection). La plupart des sérotypes naturels peuvent être produits en utilisant le système classique de culture cellulaire adhérente en combinaison avec la purification à l’iodixanol 9,10,11,12. Pour AAV. PHP.eB : cela implique un processus laborieux de culture et de transfection des cellules afin d’obtenir suffisamment de vecteurs pour une expérience⁸. Par conséquent, la production d’AAV en culture cellulaire en suspension dans des tubes coniques a été développée. Les tubes coniques, d’une capacité allant jusqu’à 300 ml, sont compacts, ce qui permet d’économiser à la fois de l’espace dans l’incubateur et des plastiques. Les cellules en suspension sont beaucoup plus faciles à cultiver et à manipuler en grande quantité que les cellules adhérentes sur des plaques de 15 cm. Les composants de transfection du protocole restent les mêmes. Par conséquent, les plasmides précédemment utilisés avec le système adhérent peuvent facilement être utilisés dans ce protocole basé sur la production dans des cellules en suspension. Le protocole a été transféré avec succès à d’autres chercheurs du laboratoire et utilisé avec succès pour diverses capsides et constructions.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Académie royale des sciences des Pays-Bas (KNAW) et étaient conformes à la loi néerlandaise sur l’expérimentation animale dans le cadre du projet numéro AVD8010020199126. La figure 1 présente un aperçu schématique de l’ensemble du protocole. De l’ensemencement des cellules à la purification des AAV, le protocole prend 6 jours.

1. Préparation des réactifs

1. Purification de plasmides
   1. Effectuer l’extraction des plasmides comme décrit par le fabricant avec quelques ajustements pour assurer la stérilité des plasmides.
   2. Préparez de l’éthanol à 70 % en utilisant de l’eau distillée stérile et de l’éthanol absolu.
   3. Après l’étape de centrifugation à l’isopropanol, sécher les plasmides dans la hotte de l’armoire d’écoulement et ajouter de l’éthanol stérile à 70 % dans les tubes. Après la précipitation de l’éthanol, sécher les plasmides dans la hotte de l’armoire à écoulement et remettre le plasmide en suspension dans de l’eau distillée stérile. Veillez à utiliser des tubes de microcentrifugation stérilisés.
   4. Prenez une aliquote pour la quantification, l’analyse de restriction et, si nécessaire, le séquençage. Il est conseillé de vérifier l’intégrité des répétitions terminales inversées (RTI) car les mutations peuvent avoir un impact négatif sur le rendement. Ajuster la concentration de l’échantillon à 1 μg/μL.
2. Préparation de 10x tampon de lyse Tween
   1. Dissoudre 30,3 g de tampon Tris et 2,033 g de MgCl_{2,6H 2}O dans 400 mL d’eau distillée stérile, régler le pH à 8,0 et augmenter le volume total à 450 mL.
   2. Gardez Tween 20 stérile, ajoutez 50 mL de Tween 20 à la solution tampon dans la hotte et filtrez la stérilisation à l’aide d’un filtre sous vide de 0,2 μM.
3. Dilutions d’iodixanol
   1. La solution d’iodixanol est fournie à une concentration de 60 %. Utilisez la solution de départ pour préparer des solutions à 15 %, 25 % et 40 %.
   2. Pour une solution à 15 %, diluer 60 mL de solution à 60 % avec 48 mL de 5 M NaCl et 48 mL de PBS-MK (5 x PBS avec 5 mM de MgCl₂ et 12,5 mM de KCl), et ajouter de l’eau distillée jusqu’à 240 mL.
   3. Pour une solution à 25 %, diluer 67 mL de solution à 60 % et 32 mL de PBS-MK. Ajouter de l’eau distillée jusqu’à 160 ml. Bien mélanger et ajouter 1,6 mL de solution de rouge de phénol.
   4. Pour une solution à 40 %, diluer 160 mL de solution à 60 % avec 48 mL de PBS-MK et ajouter de l’eau distillée jusqu’à 240 mL. Pour une solution à 60 %, ajouter 1 mL de rouge de phénol à 100 mL de solution à 60 %.
4. Solution de saccharose PBS à 5 %
   1. Ajouter 25 g de saccharose dans une bouteille de 500 mL de DPBS sans calcium ni magnésium. Bien agiter et filtrer à l’aide d’un filtre sous vide de bouteille de 0,2 μM.
5. Solution de polyéthylène glycol (PEG) 8000
   1. Dissoudre 400 g de PEG 8000 et 24 g de NaCl dans de l’eau distillée stérile et ajuster à un volume final de 1000 mL. Remuer avec chaleur jusqu’à dissolution complète. Ajustez le pH à 7,4 à l’aide de papier pH.
   2. Filtrer la stérilisation à l’aide d’un filtre sous vide de bouteille de 0,2 μM pour obtenir une solution PEG 8000 à 40 %. Notez que la filtration prendra un certain temps en raison de la viscosité de la solution stockée à 4 °C.

2. Culture de cellules en suspension HEK293

1. Utilisez des lingettes imbibées d’éthanol à 70 % pour le nettoyage. Nettoyez le capot de biosécurité, préparez et nettoyez tout le matériel nécessaire à la culture des cellules.
2. Préchauffer 30 mL de milieu de suspension à 37 °C dans un tube de culture conique de 50 mL. Récupérer des cellules de production virales à partir d’azote liquide. Décongeler rapidement les cellules dans un bain-marie à 37 °C. Juste avant que le flacon ne soit complètement décongelé, nettoyez-le avec une lingette imbibée d’éthanol à 70 % et transférez le flacon dans le capot de biosécurité.
   REMARQUE : Les détails des cellules de production virale utilisées ici sont fournis dans la table des matières.
3. Transférer rapidement les cellules dans le tube de culture conique préchauffé de 50 ml. Cellules de culture dans un incubateur à agitation à 37 °C, 80 % d’humidité, 8 % de CO₂, 200 tours par minute (RPM) et un diamètre d’agitation de 50 mm. Cellules de passage, une fois que la viabilité est supérieure à 90 % et que la densité cellulaire est supérieure à 1-3 x 10⁶ cellules/mL.
   REMARQUE : L’incubateur utilisé a un diamètre d’agitation de 50 mm ; Les conditions de culture doivent être ajustées pour un diamètre d’agitation différent.
4. Cellules de passage 3-4 jours après décongélation. Vérifier les tubes de culture pour s’assurer qu’il n’y a aucun signe de contamination ; Par exemple, le champignon apparaîtra sous la forme d’un anneau décoloré (noir ou vert).
5. Préparer 400 μL de solution de bleu de trypan à 0,4 % par échantillon à l’aide d’une bande de 1 mL.
6. Récupérez rapidement les cellules de suspension de l’incubateur. Extraire immédiatement 500 μL du tube à l’aide d’une bande de 1 mL. Pipeter doucement de haut en bas.
7. Ajouter 100 μL de suspension cellulaire dans le tube de bleu trypan préparé. Retournez doucement le tube pour mélanger ; Ne pas pipeter pour mélanger, car cela entraînerait la mort cellulaire. Remettre les cellules dans l’incubateur.
8. Prélever 50 μL de suspension cellulaire traitée au bleu trypan et l’appliquer sur la lame de l’hémocytomètre. Comptez le nombre total de cellules viables et calculez la quantité de suspension cellulaire et de milieu nécessaire pour le passage ou la transfection le lendemain.
9. Chauffer le milieu dans l’incubateur pendant 10-15 min. Ajouter la suspension cellulaire au milieu réchauffé et remettre dans l’incubateur. Pour les cellules de passage pendant 3 jours (c.-à-d. du lundi au jeudi), réglez sur 0,5 x 10⁶ cellules/mL ; pour les cellules de passage pendant 4 jours (c.-à-d. du jeudi au lundi), réglez à 0,3 x 10⁶ cellules/mL.
   REMARQUE : Selon le fabricant, les cellules de production virale doublent toutes les 26 heures et doivent être comprises entre 3,5 x 10⁶ et 5,5 x 10⁶ avant de passer. Les cellules peuvent être conservées jusqu’au passage 20.

3. Transfection

1. Jour 1
   1. À 24 h avant la transfection, cultiver 1 x 10⁶ cellules par mL dans 300 mL de milieu.
2. Jour 2
   1. Milieu chaud, plasmides et réactif de transfection à température ambiante. Pour connaître les montants à préparer, voir le tableau 1.
   2. Brièvement des plasmides et des réactifs vortex. Ajouter les plasmides au milieu préparé, vortex. Ajouter brièvement le réactif de transfection et le vortex. Ne pas agiter le mélange après cette étape. Incuber à température ambiante pendant 30 min.
   3. En attendant, comptez les cellules préparées le jour 1. Les cellules doivent être entre 2 et 2,5 x 10,⁶ cellules par ml et > viables à 95 %.
   4. Après l’incubation, ajoutez le mélange de transfection dans les cellules tout en remuant doucement le tube. Incuber pendant 72-96 h.

4. Récolte des cellules

1. Jour 5
   1. Ajouter 33 mL de tampon de lyse cellulaire 10x (500 mM Tris pH 8, 10 % Tween 20, 20 mM MgCl₂), mélanger en agitant doucement et incuber à 37 °C pendant 1,5 h en agitant.
   2. Centrifuger à 3428 x g à 4 °C pendant 60 min. Filtrer à travers un filtre sous vide PES de 0,45 μM pour clarifier le lysat cellulaire, en laissant le lysat clarifié dans le récipient du filtre.
      REMARQUE : Facultatif après filtration : prélever 50 μL d’échantillon pour la PCR quantitative (Q-PCR).
   3. Ajouter 90 mL de solution de PEG 8000 à 40 % à 360 mL de lysat cellulaire filtré.
   4. Nettoyez le barreau avec de l’éthanol à 70 % et ajoutez-le à l’échantillon. Remuer sur glace ou dans la chambre froide à 300 tr/min pendant 1 h. Incuber à 4 °C sans remuer pendant la nuit.
      REMARQUE : Des temps d’incubation de 1 h à 72 h ont été testés. Des temps d’incubation plus longs ont un effet négatif sur la précipitation globale des protéines.

5. Purification à l’iodixanol

1. Jour 6
   1. Transférer l’échantillon de volume de culture précipité dans un grand tube conique propre et centrifuger à 2820 x g et 4°C pendant 15 min.
   2. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de PEG dans 15 mL de DPBS avec du calcium et du magnésium. Le plomb est difficile à remettre en suspension ; Prenez le temps de le faire avec soin.
   3. Transférez la partie remise en suspension dans un tube propre de 50 ml. Le PEG restera sur les côtés du tube du bioréacteur. Ajouter 10 ml supplémentaires en prenant soin de recueillir tout le précipité PEG. Transférez le tout dans un contenant de 50 ml pour un volume total de 25 à 30 ml.
   4. Ajouter 40 μL de DNaseI (10 U/μL). Placer dans l’incubateur pendant 1 h 37°C.
      REMARQUE : Facultatif après l’incubation de DNase : prélever 50 μL d’échantillon pour la Q-PCR.
   5. Nettoyez les barres d’agitation utilisées pour la précipitation du PEG avec une solution de chlorure suivie d’éthanol à 70 %. Laissez les barres d’agitation dans de l’éthanol à 70 % pour la prochaine expérience.
   6. Remplir un tube en polyallomère de 25 mm x 89 mm à l’aide d’une pipette Pasteur en verre avec 15,5 mL de lysat cellulaire concentré dans chaque tube. Après avoir ajouté du lysat cellulaire, remplacez la pipette Pasteur en verre par une nouvelle.
   7. Ajouter des solutions d’iodixanol de 15 % à 60 % : infuser doucement 9 mL de la solution d’iodixanol à 15 % sous le lysat cellulaire. Ensuite, ajoutez 5 mL des solutions d’iodixanol à 25 % et 40 %, et enfin, ajoutez 5 mL de la solution d’iodixanol à 60 %.
   8. Complétez le tube à l’aide d’une seringue avec DPBS +/+ pour éliminer la plupart des bulles d’air, en prenant soin de ne pas perturber les couches d’iodixanol. Scellez le tube à l’aide d’un surmatelas électrique.
   9. Centrifuger dans un rotor sans rotation pendant 1 h 10 min à 490 000 x g à 16 °C dans une ultracentrifugeuse. Retirer de l’ultracentrifugeuse, assembler les tubes dans un fermoir métallique et préparer les tubes de prélèvement. Ouvrez le rotor dans le capot en cas de déversement pendant l’essorage.
   10. Préparez un tube de 50 ml (pour jeter le tube du rotor), un tube de 15 ml (pour recueillir le virus), une seringue de 5 ml et une aiguille de 30 G et 19 G par gradient.
   11. Percez un trou dans le haut du tube avec une aiguille de 30G. Laissez l’aiguille en place. Placez une aiguille de 19 G sur la seringue.
   12. Percez soigneusement le tube juste en dessous de l’interface 40%/60%, ce qui est visible par l’indicateur rouge phénol. Assurez-vous que le biseau de l’aiguille est face à la couche de 40 %.
   13. Retirez l’aiguille 30G du haut du tube en utilisant la main non dominante. Avec l’aiguille biseautée, extrayez lentement le virus/iodixanol. L’objectif est d’extraire entre 3 mL et 4,5 mL. À peu près à mi-chemin et bien dans la couche 40%/claire, tournez l’aiguille pour que le biseau soit orienté vers le bas et continuez à extraire pour éviter la collecte de la couche de protéines.
   14. Préparez le tube de 50 ml avec la main non dominante, extrayez soigneusement l’aiguille tout en plaçant le tube dans le tube de 50 ml et jetez-le. Diluer la suspension AAV/iodixanol 5x dans DPBS en remplissant jusqu’à 15 mL.
   15. Transférer dans un tube filtrant centrifuge et centrifuger à 3428 x g, 4 °C pendant 10 min. Jeter l’écoulement continu ; Retirez délicatement le support du filtre et versez le récipient inférieur dans une bouteille à déchets. Ajouter 15 mL de saccharose PBS-5 % au filtrat et remettre en suspension.
   16. Centrifuger à 3428 x g à 4 °C pendant 20 min. Répétez l’échange de tampon au moins 3 fois. Stocker le virus (~150-250 μL) à 4 °C (PHP. B (3 mois maximum) ou aliquote dans des aliquotes de 50 μL et stockées à -80 °C à long terme.
       NOTE : PHP. Les variantes de la capside B sont sensibles au gel/dégel, il faut donc éviter cela.
   17. Effectuer le titrage comme décrit dans un protocole précédent¹⁰.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

La plupart des laboratoires universitaires utilisent des cellules HEK293T adhérentes pour la production d’AAV ^8,9. Bien que cela fonctionne relativement bien lorsque de petites quantités d’AAV sont nécessaires pour l’injection directe, un titre 100 fois plus élevé (au minimum 1 x 10¹¹ GC/souris) est nécessaire pour obtenir une transduction similaire avec des capsides systémiques telles que l’AAV. PHP.eB.

Dans ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

L’administration systémique d’AAV est un outil puissant pour le transfert de gènes vers le SNC ; cependant, la production d’AAV est un processus coûteux et laborieux. En utilisant des cellules en suspension, la main-d’œuvre et les plastiques sont réduits par rapport à la culture adhérente de HEK293T sur des plaques de 15 cm² . De plus, les tubes coniques mis en œuvre ici sont faciles à manipuler et maximisent l’utilisation de l’espace de laboratoire. Le protocole a été mis en place par d...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm - 50Pk	Beckman Coulter	342414
Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4x1000,	eppendorf	5920701002
Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml	Infors HT/ TPP	587633
Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets	eppendorf	5820747005
Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes	eppendorf	5948000315
Distilled Water	Gibco	15230147
DNase I recombinant, RNase-free	Roche	4716728001
DNase I recombinant, RNase-free	Roche	4716728001
DPBS, calcium, magnesium	Gibco	14040091
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2	Fisher	FB12566504
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45	Fisher	FB12566505
Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube	Infors HT/ TPP	31362
Holder for 600 ml cell culture tube	Infors HT/ TPP	66129
Incubator Minitron 50 mm	Infors HT	500043
LV-MAX Production Medium	Gibco	A3583401
N-Tray Universal	Infors HT/ TPP	31321
OptiPrep - Iodixanol	Serumwerk bernburg	1893
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)	Poly-sciences	24765-100
Phenol red solution	Sigma-Aldrich	72420100
Poly(ethylene glycol) 8000	Sigma-Aldrich	89510
TransIT-VirusGEN	Mirus	Mir 6706
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	5250061
TubeSpin Bioreactors-50ml	TTP	87050
TubeSpin Bioreactors-600ml	TTP	87600
Viral Production Cells	Gibco	A35347
Vivaspin 20 MWCO 100 000	Cytvia	28932363