Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Burada, bir süspansiyon HEK293 hücre tabanlı AAV üretim protokolü sunulmakta olup, ticari satıcılardan araştırma amacıyla temin edilebilen bileşenleri kullanarak vektör üretimi için gereken zaman ve işçiliğin azaltılmasına neden olmaktadır.
Adeno ilişkili viral vektörler (AAV'ler), merkezi sinir sistemini (MSS) araştırmak için dikkate değer bir araçtır. AAV gibi yenilikçi kapsidler. PHP.eB, farelerde intravenöz enjeksiyon ile CNS'nin kapsamlı transdüksiyonunu gösterir. Karşılaştırılabilir transdüksiyon elde etmek için, CNS parankiminde doğrudan enjeksiyona kıyasla 100 kat daha yüksek bir titre (minimum 1 x 1011 genom kopyası / fare) gereklidir. Grubumuzda, AAV dahil olmak üzere AAV üretimi. PHP.eB, yapışık HEK293T hücrelerine ve üçlü transfeksiyon yöntemine dayanır. Yapışık hücrelerle yüksek AAV verimleri elde etmek, emek ve malzeme yoğun bir süreç gerektirir. Bu kısıtlama, konik tüplerde süspansiyon bazlı hücre kültürü için bir protokolün geliştirilmesine yol açtı. Yapışık hücrelerde üretilen AAV'ler, süspansiyon üretim yöntemiyle karşılaştırıldı. Transfeksiyon reaktifleri Polietilenimin veya TransIt kullanılarak süspansiyon halindeki kültür karşılaştırıldı. AAV vektörleri, iyodiksanol gradyan ultrasantrifüjlemesi ve ardından bir santrifüj filtre kullanılarak tampon değişimi ve konsantrasyonu ile saflaştırıldı. Yapışık yöntemle ortalama 2.6 x 1012 genom kopyası (GC) elde ederken, süspansiyon yöntemi ve Polietilenimin toplamda 7.7 x 1012 GC ve TransIt toplamda 2.4 x 1013 GC verdi. Yapışık olarak üretilen vektörler arasında süspansiyon hücre sistemine göre in vivo transdüksiyon verimliliği açısından bir fark yoktur. Özetle, bir süspansiyon HEK293 hücre tabanlı AAV üretim protokolü tanıtıldı, bu da vektör üretimi için gereken zaman ve işçiliğin azalmasına neden olurken, araştırma amacıyla ticari satıcılardan temin edilen bileşenleri kullanarak 3 ila 9 kat daha yüksek verim elde etti.
Adeno-ilişkili virüs (AAV) 1965 yılında keşfedildi ve o zamandan beri sayısız uygulamada kullanıldı1. AAV'ler, sinirbilim araştırmalarında gen ve nöronal fonksiyonu incelemek, nörodevreleri haritalamak veya hastalık2 için hayvan modelleri üretmek için uygulanmıştır. Geleneksel olarak, çoğu doğal serotip kan-beyin bariyerini geçmediğinden veya bunu yapmak için yüksek bir doza ihtiyaç duymadığından, bu doğrudan ilgilenilen bölgeye enjekte edilerek yapılır 1,2,3.
AAV'nin keşfi ile. PHP.B
Tüm deneysel prosedürler, Hollanda Kraliyet Bilimler Akademisi'nin (KNAW) kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından onaylandı ve AVD8010020199126 numaralı proje kapsamında Hollanda Hayvan Deneyleri Yasası'na uygundu. Şekil 1'de, protokolün tamamına şematik bir genel bakış sağlanmıştır. Tohumlama hücrelerinden AAV saflaştırmasına kadar, protokolün tamamlanması 6 gün sürer.
1. Reaktif hazırlama
Çoğu akademik laboratuvar, AAV üretimi için yapışık HEK293T hücreleri kullanır 8,9. Bu, doğrudan enjeksiyon için küçük miktarlarda AAV gerektiğinde nispeten iyi çalışsa da, AAV gibi sistemik kapsidlerle benzer transdüksiyon elde etmek için 100 kat daha yüksek bir titre (minimum 1 x 1011 GC / fare) gereklidir. PHP.eB (İngilizce).
Bu protokolde, konik tüplerde kültüre edilen süspansiyon HEK293 hücrel.......
AAV'nin sistemik uygulaması, CNS'ye gen transferi için güçlü bir araçtır; ancak AAV üretimi pahalı ve zahmetli bir süreçtir. Süspansiyon hücreleri kullanılarak, 15cm2'lik plakalar üzerindeki HEK293T yapışan kültüre kıyasla işçilik ve plastikler azaltılır. Ayrıca, burada uygulanan konik boruların kullanımı kolaydır ve laboratuvar alanı kullanımını en üst düzeye çıkarır. Protokol iki araştırmacı tarafından oluşturuldu ve daha sonra laboratuvardaki diğer kişiler taraf?.......
İlk test için Mirus tarafından ücretsiz bir TransIT numunesi sağlandı ve ardından reaktif daha sonra kullanılmak üzere satın alındı. Yazarların rapor edecek başka bir rakip mali çıkarı yoktur.
Bu çalışma, Hollanda Kraliyet Sanat ve Bilim Akademisi (KNAW) araştırma fonundan bir hibe ve Start2Cure'dan (0-TI-01) bir hibe ile desteklenmiştir. Protokolün kurulumundaki katkıları ve tavsiyeleri için Leisha Kopp'a teşekkür ederiz. Figürler Biorender kullanılarak oluşturuldu.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm - 50Pk | Beckman Coulter | 342414 | |
Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4x1000, | eppendorf | 5920701002 | |
Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml | Infors HT/ TPP | 587633 | |
Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets | eppendorf | 5820747005 | |
Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes | eppendorf | 5948000315 | |
Distilled Water | Gibco | 15230147 | |
DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040091 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2 | Fisher | FB12566504 | |
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45 | Fisher | FB12566505 | |
Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube | Infors HT/ TPP | 31362 | |
Holder for 600 ml cell culture tube | Infors HT/ TPP | 66129 | |
Incubator Minitron 50 mm | Infors HT | 500043 | |
LV-MAX Production Medium | Gibco | A3583401 | |
N-Tray Universal | Infors HT/ TPP | 31321 | |
OptiPrep - Iodixanol | Serumwerk bernburg | 1893 | |
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Poly-sciences | 24765-100 | |
Phenol red solution | Sigma-Aldrich | 72420100 | |
Poly(ethylene glycol) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
TransIT-VirusGEN | Mirus | Mir 6706 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 5250061 | |
TubeSpin Bioreactors-50ml | TTP | 87050 | |
TubeSpin Bioreactors-600ml | TTP | 87600 | |
Viral Production Cells | Gibco | A35347 | |
Vivaspin 20 MWCO 100 000 | Cytvia | 28932363 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
ISSN 1940-087X
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır
Sitemizdeki deneyiminizi iyileştirmek için çerezleri kullanıyoruz
Sitemizi kullanmaya devam ederek ya da "Devam et" butonuna tıklayarak, çerezleri kabul edebilirsiniz.