Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Özet

Burada, bir süspansiyon HEK293 hücre tabanlı AAV üretim protokolü sunulmakta olup, ticari satıcılardan araştırma amacıyla temin edilebilen bileşenleri kullanarak vektör üretimi için gereken zaman ve işçiliğin azaltılmasına neden olmaktadır.

Özet

Adeno ilişkili viral vektörler (AAV'ler), merkezi sinir sistemini (MSS) araştırmak için dikkate değer bir araçtır. AAV gibi yenilikçi kapsidler. PHP.eB, farelerde intravenöz enjeksiyon ile CNS'nin kapsamlı transdüksiyonunu gösterir. Karşılaştırılabilir transdüksiyon elde etmek için, CNS parankiminde doğrudan enjeksiyona kıyasla 100 kat daha yüksek bir titre (minimum 1 x 1011 genom kopyası / fare) gereklidir. Grubumuzda, AAV dahil olmak üzere AAV üretimi. PHP.eB, yapışık HEK293T hücrelerine ve üçlü transfeksiyon yöntemine dayanır. Yapışık hücrelerle yüksek AAV verimleri elde etmek, emek ve malzeme yoğun bir süreç gerektirir. Bu kısıtlama, konik tüplerde süspansiyon bazlı hücre kültürü için bir protokolün geliştirilmesine yol açtı. Yapışık hücrelerde üretilen AAV'ler, süspansiyon üretim yöntemiyle karşılaştırıldı. Transfeksiyon reaktifleri Polietilenimin veya TransIt kullanılarak süspansiyon halindeki kültür karşılaştırıldı. AAV vektörleri, iyodiksanol gradyan ultrasantrifüjlemesi ve ardından bir santrifüj filtre kullanılarak tampon değişimi ve konsantrasyonu ile saflaştırıldı. Yapışık yöntemle ortalama 2.6 x 1012 genom kopyası (GC) elde ederken, süspansiyon yöntemi ve Polietilenimin toplamda 7.7 x 1012 GC ve TransIt toplamda 2.4 x 1013 GC verdi. Yapışık olarak üretilen vektörler arasında süspansiyon hücre sistemine göre in vivo transdüksiyon verimliliği açısından bir fark yoktur. Özetle, bir süspansiyon HEK293 hücre tabanlı AAV üretim protokolü tanıtıldı, bu da vektör üretimi için gereken zaman ve işçiliğin azalmasına neden olurken, araştırma amacıyla ticari satıcılardan temin edilen bileşenleri kullanarak 3 ila 9 kat daha yüksek verim elde etti.

Giriş

Adeno-ilişkili virüs (AAV) 1965 yılında keşfedildi ve o zamandan beri sayısız uygulamada kullanıldı1. AAV'ler, sinirbilim araştırmalarında gen ve nöronal fonksiyonu incelemek, nörodevreleri haritalamak veya hastalık2 için hayvan modelleri üretmek için uygulanmıştır. Geleneksel olarak, çoğu doğal serotip kan-beyin bariyerini geçmediğinden veya bunu yapmak için yüksek bir doza ihtiyaç duymadığından, bu doğrudan ilgilenilen bölgeye enjekte edilerek yapılır 1,2,3.

AAV'nin keşfi ile. PHP.B

Protokol

Tüm deneysel prosedürler, Hollanda Kraliyet Bilimler Akademisi'nin (KNAW) kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından onaylandı ve AVD8010020199126 numaralı proje kapsamında Hollanda Hayvan Deneyleri Yasası'na uygundu. Şekil 1'de, protokolün tamamına şematik bir genel bakış sağlanmıştır. Tohumlama hücrelerinden AAV saflaştırmasına kadar, protokolün tamamlanması 6 gün sürer.

1. Reaktif hazırlama

  1. Plazmit saflaştırma
    1. Plazmitlerin sterilitesini sağlamak için birkaç ayarlama ile üretici tarafından tarif edildiği gibi plazmit ekstraksiyonu gerçekleştirin.
    2. Steri....

Temsili Sonuçlar

Çoğu akademik laboratuvar, AAV üretimi için yapışık HEK293T hücreleri kullanır 8,9. Bu, doğrudan enjeksiyon için küçük miktarlarda AAV gerektiğinde nispeten iyi çalışsa da, AAV gibi sistemik kapsidlerle benzer transdüksiyon elde etmek için 100 kat daha yüksek bir titre (minimum 1 x 1011 GC / fare) gereklidir. PHP.eB (İngilizce).

Bu protokolde, konik tüplerde kültüre edilen süspansiyon HEK293 hücrel.......

Tartışmalar

AAV'nin sistemik uygulaması, CNS'ye gen transferi için güçlü bir araçtır; ancak AAV üretimi pahalı ve zahmetli bir süreçtir. Süspansiyon hücreleri kullanılarak, 15cm2'lik plakalar üzerindeki HEK293T yapışan kültüre kıyasla işçilik ve plastikler azaltılır. Ayrıca, burada uygulanan konik boruların kullanımı kolaydır ve laboratuvar alanı kullanımını en üst düzeye çıkarır. Protokol iki araştırmacı tarafından oluşturuldu ve daha sonra laboratuvardaki diğer kişiler taraf?.......

Açıklamalar

İlk test için Mirus tarafından ücretsiz bir TransIT numunesi sağlandı ve ardından reaktif daha sonra kullanılmak üzere satın alındı. Yazarların rapor edecek başka bir rakip mali çıkarı yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Hollanda Kraliyet Sanat ve Bilim Akademisi (KNAW) araştırma fonundan bir hibe ve Start2Cure'dan (0-TI-01) bir hibe ile desteklenmiştir. Protokolün kurulumundaki katkıları ve tavsiyeleri için Leisha Kopp'a teşekkür ederiz. Figürler Biorender kullanılarak oluşturuldu.

....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm - 50PkBeckman Coulter342414
Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4x1000, eppendorf5920701002
Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 mlInfors HT/ TPP587633
Aerosol-tight caps, for 750 mL round bucketseppendorf5820747005
Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubeseppendorf5948000315
Distilled WaterGibco15230147
DNase I recombinant, RNase-freeRoche4716728001
DNase I recombinant, RNase-freeRoche4716728001
DPBS, calcium, magnesiumGibco14040091
DPBS, no calcium, no magnesiumGibco14190144
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2FisherFB12566504
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45FisherFB12566505
Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tubeInfors HT/ TPP31362
Holder for 600 ml cell culture tubeInfors HT/ TPP66129
Incubator Minitron 50 mmInfors HT500043
LV-MAX Production MediumGibcoA3583401
N-Tray UniversalInfors HT/ TPP31321
OptiPrep - IodixanolSerumwerk bernburg1893
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)Poly-sciences24765-100
Phenol red solution Sigma-Aldrich72420100
Poly(ethylene glycol) 8000Sigma-Aldrich89510
TransIT-VirusGENMirusMir 6706
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco5250061
TubeSpin Bioreactors-50mlTTP87050
TubeSpin Bioreactors-600mlTTP87600
Viral Production CellsGibcoA35347
Vivaspin 20 MWCO 100 000Cytvia28932363

Referanslar

  1. Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases. Front Mol Neurosci. 15, 988914 (2022).
  2. Pietersz, K. L., et al.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

This article has been published

Video Coming Soon

Sitemizdeki deneyiminizi iyileştirmek için çerezleri kullanıyoruz

Sitemizi kullanmaya devam ederek ya da "Devam et" butonuna tıklayarak, çerezleri kabul edebilirsiniz.