HEK293 Süspansiyon Hücreleri Kullanılarak Yüksek Verimli Adeno İlişkili Vektör Partilerinin Üretimi

Özet

Burada, bir süspansiyon HEK293 hücre tabanlı AAV üretim protokolü sunulmakta olup, ticari satıcılardan araştırma amacıyla temin edilebilen bileşenleri kullanarak vektör üretimi için gereken zaman ve işçiliğin azaltılmasına neden olmaktadır.

Özet

Adeno ilişkili viral vektörler (AAV'ler), merkezi sinir sistemini (MSS) araştırmak için dikkate değer bir araçtır. AAV gibi yenilikçi kapsidler. PHP.eB, farelerde intravenöz enjeksiyon ile CNS'nin kapsamlı transdüksiyonunu gösterir. Karşılaştırılabilir transdüksiyon elde etmek için, CNS parankiminde doğrudan enjeksiyona kıyasla 100 kat daha yüksek bir titre (minimum 1 x 10¹¹ genom kopyası / fare) gereklidir. Grubumuzda, AAV dahil olmak üzere AAV üretimi. PHP.eB, yapışık HEK293T hücrelerine ve üçlü transfeksiyon yöntemine dayanır. Yapışık hücrelerle yüksek AAV verimleri elde etmek, emek ve malzeme yoğun bir süreç gerektirir. Bu kısıtlama, konik tüplerde süspansiyon bazlı hücre kültürü için bir protokolün geliştirilmesine yol açtı. Yapışık hücrelerde üretilen AAV'ler, süspansiyon üretim yöntemiyle karşılaştırıldı. Transfeksiyon reaktifleri Polietilenimin veya TransIt kullanılarak süspansiyon halindeki kültür karşılaştırıldı. AAV vektörleri, iyodiksanol gradyan ultrasantrifüjlemesi ve ardından bir santrifüj filtre kullanılarak tampon değişimi ve konsantrasyonu ile saflaştırıldı. Yapışık yöntemle ortalama 2.6 x 10¹² genom kopyası (GC) elde ederken, süspansiyon yöntemi ve Polietilenimin toplamda 7.7 x 10¹² GC ve TransIt toplamda 2.4 x 10¹³ GC verdi. Yapışık olarak üretilen vektörler arasında süspansiyon hücre sistemine göre in vivo transdüksiyon verimliliği açısından bir fark yoktur. Özetle, bir süspansiyon HEK293 hücre tabanlı AAV üretim protokolü tanıtıldı, bu da vektör üretimi için gereken zaman ve işçiliğin azalmasına neden olurken, araştırma amacıyla ticari satıcılardan temin edilen bileşenleri kullanarak 3 ila 9 kat daha yüksek verim elde etti.

Giriş

Adeno-ilişkili virüs (AAV) 1965 yılında keşfedildi ve o zamandan beri sayısız uygulamada kullanıldı¹. AAV'ler, sinirbilim araştırmalarında gen ve nöronal fonksiyonu incelemek, nörodevreleri haritalamak veya hastalık² için hayvan modelleri üretmek için uygulanmıştır. Geleneksel olarak, çoğu doğal serotip kan-beyin bariyerini geçmediğinden veya bunu yapmak için yüksek bir doza ihtiyaç duymadığından, bu doğrudan ilgilenilen bölgeye enjekte edilerek yapılır ^1,2,3.

AAV'nin keşfi ile. PHP.B⁴ ve AAV gibi yeni nesil kapsidler. PHP.eB⁵ ve AAV. CAP-B10⁶, basit bir sistemik enjeksiyon kullanarak merkezi sinir sistemini (CNS) hedeflemek mümkündür. Uzamsal haritalama, AAV tarafından hedeflenen hücreleri ortaya çıkarır. Hücresel düzeyde^{PHP.eB 6,7}. Spesifik promotörler/arttırıcılar ile kombinasyon halinde, bu kapsidler, sinirbilimcilerin non-invaziv AAV iletimi ile genleri ve beyin fonksiyonlarını incelemeleri için kapsamlı fırsatlar sunar ^4,8.

AAV için daha düşük bir doz gerekirken. PHP.eB (tipik olarak 1 ila 5 x 10¹¹ Genom Kopyası (GC)/fare) AAV9 (4 x 10¹² GC/fare)⁷ ile karşılaştırıldığında, doğrudan enjeksiyon stratejilerine (tipik olarak 1 x 10⁹ GC/μL enjeksiyon) kıyasla daha fazla vektör üretilmesi gerekir. Çoğu doğal serotip, iyodiksanol saflaştırması ^9,10,11,12 ile kombinasyon halinde klasik yapışık hücre kültürü sistemi kullanılarak üretilebilir. AAV için. PHP.eB bu, bir deney⁸ için yeterli vektörleri elde etmek için hücreleri kültürlemek ve transfekte etmek için emek yoğun bir süreç gerektirir. Bu nedenle, konik tüplerde süspansiyon hücre kültüründe AAV üretimi geliştirilmiştir. 300 mL'ye kadar kapasiteye sahip konik borular kompakttır ve hem inkübatör alanından hem de plastikten tasarruf sağlar. Süspansiyon hücrelerinin kültürlenmesi ve büyük miktarlarda işlenmesi, 15 cm'lik plakalar üzerindeki yapışık hücrelere göre çok daha kolaydır. Protokolün transfeksiyon bileşenleri aynı kalır. Bu nedenle, daha önce yapışık sistemle kullanılan plazmitler, süspansiyon hücrelerinde üretime dayalı olarak bu protokolde rahatlıkla kullanılabilir. Protokol, laboratuvardaki diğer araştırmacılara başarıyla aktarıldı ve çeşitli kapsidler ve yapılar için başarıyla kullanıldı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm deneysel prosedürler, Hollanda Kraliyet Bilimler Akademisi'nin (KNAW) kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından onaylandı ve AVD8010020199126 numaralı proje kapsamında Hollanda Hayvan Deneyleri Yasası'na uygundu. Şekil 1'de, protokolün tamamına şematik bir genel bakış sağlanmıştır. Tohumlama hücrelerinden AAV saflaştırmasına kadar, protokolün tamamlanması 6 gün sürer.

1. Reaktif hazırlama

1. Plazmit saflaştırma
   1. Plazmitlerin sterilitesini sağlamak için birkaç ayarlama ile üretici tarafından tarif edildiği gibi plazmit ekstraksiyonu gerçekleştirin.
   2. Steril damıtılmış su ve mutlak etanol kullanarak% 70 etanol hazırlayın.
   3. İzopropanol santrifüj adımından sonra, akış kabini davlumbazındaki plazmitleri kurutun ve tüplere steril %70 etanol ekleyin. Etanol çökeltildikten sonra, plazmitleri akış kabini davlumbazında kurutun ve plazmiti steril damıtılmış suda yeniden süspanse edin. Sterilize edilmiş mikrosantrifüj tüpleri kullanmaya özen gösterin.
   4. Niceleme, kısıtlama analizi ve gerekirse sıralama için bir alikot alın. Mutasyonların verim üzerinde olumsuz bir etkisi olabileceğinden, ters çevrilmiş terminal tekrarlarının (ITR'ler) bütünlüğünün kontrol edilmesi tavsiye edilir. Numune konsantrasyonunu 1 μg/μL'ye ayarlayın.
2. 10x Tween lizis tamponunun hazırlanması
   1. 30.3 g Tris tamponu ve 2.033 g MgCl_2.6H 2O'yu 400mL steril damıtılmış suda çözün, pH'ı 8.0'a ayarlayın ve toplam hacmi 450 mL'ye yükseltin.
   2. Tween 20'yi steril tutun, davlumbazdaki tampon solüsyona 50 mL Tween 20 ekleyin ve 0,2 μM vakum filtresi kullanarak filtre sterilizasyonu yapın.
3. İodiksanol dilüsyonları
   1. İodiksanol çözeltisi% 60 konsantrasyonda sağlanır. %15, %25 ve %40 çözümler yapmak için başlangıç çözümünü kullanın.
   2. % 15'lik çözelti için, 60 mL% 60'lık çözeltiyi 48 mL 5 M NaCl ve 48 mL PBS-MK (5 mM MgCl₂ ve 12.5 mM KCl ile 5x PBS) ile seyreltin ve 240 mL'ye kadar damıtılmış su ekleyin.
   3. % 25 çözelti için, 67 mL% 60 çözelti ve 32 mL PBS-MK seyreltin. 160 mL'ye kadar damıtılmış su ekleyin. İyice karıştırın ve 1.6 mL fenol kırmızısı çözeltisi ekleyin.
   4. % 40'lık çözelti için, 160 mL% 60'lık çözeltiyi 48 mL PBS-MK ile seyreltin ve 240 mL'ye kadar damıtılmış su ekleyin. % 60 çözelti için, 100 mL % 60 çözeltiye 1 mL fenol kırmızısı ekleyin.
4. PBS %5 sükroz çözeltisi
   1. Kalsiyum veya magnezyum içermeyen 500 mL'lik bir DPBS şişesine 25 g sükroz ekleyin. İyice çalkalayın ve 0,2 μM şişe vakum filtresi kullanarak filtreleyin.
5. Polietilen glikol (PEG) 8000 çözeltisi
   1. 400 g PEG 8000 ve 24 g NaCl'yi steril damıtılmış suda çözün ve 1000 mL'lik bir nihai hacme ayarlayın. Tamamen eriyene kadar ısıtarak karıştırın. pH kağıdı kullanarak pH'ı 7.4'e ayarlayın.
   2. Filtre, %40 PEG 8000 çözeltisi elde etmek için 0,2 μM şişe vakum filtresi kullanarak sterilize edilir. Çözelti deposunun 4 °C'deki viskozitesi nedeniyle filtrelemenin biraz zaman alacağını unutmayın.

2. HEK293 süspansiyon hücrelerinin kültürü

1. Temizlik için %70 etanole batırılmış mendiller kullanın. Biyogüvenlik kapağını temizleyin, hücrelerin kültürlenmesi için gerekli tüm malzemeleri hazırlayın ve temizleyin.
2. 50 mL'lik bir konik kültür tüpünde 30 mL süspansiyon hücresi ortamını 37 °C'ye kadar önceden ısıtın. Viral üretim hücrelerini sıvı nitrojenden alın. Hücreleri 37 °C'lik bir su banyosunda hızla çözdürün. Flakon tamamen çözülmeden hemen önce, %70 etanole batırılmış bir mendille temizleyin ve flakonu biyogüvenlik başlığına aktarın.
   NOT: Burada kullanılan viral üretim hücrelerinin detayları Malzeme Tablosunda verilmiştir.
3. Hücreleri önceden ısıtılmış 50 mL'lik konik kültür tüpüne hızlı bir şekilde aktarın. 37 °C, %80 nem, %8 CO₂, dakikada 200 devir (RPM) ve 50 mm çalkalama çapı olan çalkalama inkübatörlerinde kültür hücreleri. Geçiş hücreleri, canlılık% 90'ın üzerinde olduğunda ve hücre yoğunluğu 1-3 x 10⁶ hücre / mL'nin üzerinde olduğunda.
   NOT: Kullanılan inkübatörün çalkalama çapı 50 mm'dir; Kültür koşulları, farklı bir çalkalama çapı için ayarlanmalıdır.
4. Çözüldükten 3-4 gün sonra geçiş hücreleri. Kontaminasyon belirtisi olmadığından emin olmak için kültür tüplerini kontrol edin; Örneğin, mantar renksiz (siyah veya yeşil) bir halka olarak görünecektir.
5. 1 mL'lik bir şerit kullanarak numune başına 400 μL %0.4 tripan mavisi çözeltisi hazırlayın.
6. Süspansiyon hücrelerini inkübatörden hızlı bir şekilde alın. Hemen 1 mL'lik bir şerit kullanarak tüpten 500 μL çıkarın. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin.
7. Hazırlanan tripan mavisi tüpe 100 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Karıştırmak için tüpü yavaşça ters çevirin; Hücre ölümüne yol açacağından karıştırmak için pipet yapmayın. Hücreleri inkübatöre geri döndürün.
8. 50 μL tripan mavisi ile muamele edilmiş hücre süspansiyonu alın ve hemositometre lamına uygulayın. Toplam canlı hücreleri sayın ve ertesi gün geçiş veya transfeksiyon için gereken hücre süspansiyonu ve ortam miktarını hesaplayın.
9. İnkübatörde 10-15 dakika ılık ortam. Isıtılmış ortama hücre süspansiyonu ekleyin ve inkübatöre geri dönün. 3 gün boyunca (yani Pazartesi-Perşembe) hücreleri geçirmek için 0,5 x 10⁶ hücre/mL olarak ayarlayın; 4 gün boyunca (yani Perşembe-Pazartesi) hücreleri geçirmek için 0,3 x 10⁶ hücre/mL olarak ayarlayın.
   NOT: Üreticiye göre, viral üretim hücreleri her 26 saatte bir ikiye katlanır ve geçmeden önce 3,5 x 10⁶ ile 5,5 x 10⁶ arasında olmalıdır. Hücreler 20. geçişe kadar saklanabilir.

3. Transfeksiyon

1. 1. Gün
   1. Transfeksiyondan 24 saat önce, 300 mL ortamda / mL başına 1 x 10⁶ hücre kültürleyin.
2. 2. Gün
   1. Sıcak ortam, plazmitler ve transfeksiyon reaktifi oda sıcaklığına. Hazırlanacak miktarlar için Tablo 1'e bakınız.
   2. Kısaca plazmitleri ve reaktifleri girdaplayın. Hazırlanan ortama, girdaba plazmitler ekleyin. Transfeksiyon reaktifi ekleyin ve kısaca girdap yapın. Bu adımdan sonra karışımı çalkalamayın. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
   3. Bu arada, 1. günde hazırlanan hücreleri sayın. Hücreler mL başına 2 ila 2,5 x 10⁶ hücre arasında olmalı ve > %95 canlı olmalıdır.
   4. İnkübasyondan sonra, damla damla transfeksiyon karışımını tüpleri hafifçe döndürürken hücrelere ekleyin. 72-96 saat inkübe edin.

4. Hücrelerin toplanması

1. 5. Gün
   1. 33 mL 10x hücre lizis tamponu (500 mM Tris pH 8,% 10 Tween 20, 20 mM MgCl₂) ekleyin, hafifçe çalkalayarak karıştırın ve 37 ° C'de 1.5 saat çalkalayarak inkübe edin.
   2. 3428 x g'da 4 °C'de 60 dakika santrifüjleyin. Hücre lizatını berraklaştırmak için 0.45 μM PES vakum filtresinden süzün ve arıtılmış lizatı filtrenin kabında bırakın.
      NOT: Filtrasyondan sonra isteğe bağlı: kantitatif PCR (Q-PCR) için 50 μL numune alın.
   3. 360 mL filtrelenmiş hücre lizatına 90 mL %40 PEG 8000 çözeltisi ekleyin.
   4. Karıştırma çubuğunu %70 etanol ile temizleyin ve numuneye ekleyin. Buz üzerinde veya soğuk odada 300 RPM'de 1 saat karıştırın. Gece boyunca karıştırmadan 4 °C'de inkübe edin.
      NOT: 1 saat ila 72 saat arasındaki inkübasyon süreleri test edilmiştir. Daha uzun inkübasyon süreleri, genel protein çökelmesi üzerinde olumsuz bir etkiye sahiptir.

5. İodiksanol saflaştırma

1. 6. Gün
   1. PEG çökeltilmiş kültür hacmi numunesinin tamamını temiz, büyük bir konik tüpe aktarın ve 2820 x g ve 4 ° C'de 15 dakika santrifüjleyin.
   2. Süpernatanı atın ve PEG peletini kalsiyum ve magnezyum ile 15 mL DPBS'de yeniden süspanse edin. Peletin yeniden askıya alınması zordur; Bunu dikkatli bir şekilde yapmak için zaman ayırın.
   3. Yeniden askıya alınan parçayı 50 mL'lik temiz bir tüpe aktarın. PEG, biyoreaktör tüpünün yanlarında kalacaktır. Tüm PEG çökeltisini toplamaya dikkat ederek fazladan 10 mL ekleyin. Toplam 25-30 mL hacim için hepsini 50 mL'lik bir kaba aktarın.
   4. 40 μL DNaseI (10 U/μL) ekleyin. 1 saat 37°C'de inkübatöre koyun.
      NOT: DNaz inkübasyonundan sonra isteğe bağlı: Q-PCR için 50 μL numune alın.
   5. PEG çökeltme için kullanılan karıştırma çubuklarını klorür çözeltisi ve ardından %70 etanol ile iyice temizleyin. Bir sonraki deney için karıştırma çubuklarını %70 etanol içinde bırakın.
   6. 25 mm x 89 mm'lik bir poliallomer tüpü, her tüpte 15,5 mL konsantre hücre lizatı içeren bir cam Pasteur pipeti kullanarak doldurun. Hücre lizatı ekledikten sonra, cam Pasteur pipetini yenisiyle değiştirin.
   7. % 15 -% 60 arasında iyodiksanol çözeltileri ekleyin:% 15 iyodiksanol çözeltisinin 9 mL'sini hücre lizatının altına hafifçe infüze edin. Daha sonra, %25 ve %40 iyodiksanol çözeltilerinden 5 mL ekleyin ve son olarak, %60 iyodiksanol çözeltisinden 5 mL ekleyin.
   8. İodiksanol katmanlarını rahatsız etmemeye dikkat ederek hava kabarcıklarının çoğunu gidermek için DPBS +/+ içeren bir şırınga kullanarak tüpü doldurun. Bir elektrik tüpü kabı kullanarak tüpü kapatın.
   9. Bir ultrasantrifüjde 16 °C'de 490.000 x g'de 1 saat 10 dakika boyunca sallanmayan bir rotorda santrifüjleyin. Ultrasantrifüjden çıkarın, tüpleri metal bir tokada birleştirin ve toplama tüplerini hazırlayın. Eğirme sırasında dökülme ihtimaline karşı davlumbazdaki rotoru açın.
   10. Bir adet 50 mL'lik tüp (rotor tüpünü atmak için), bir adet 15 mL'lik tüp (virüs toplamak için), 5 mL'lik bir şırınga ve gradyan başına 30G ve 19G'lik bir iğne hazırlayın.
   11. 30G'lik bir iğne ile tüpün üst kısmında bir delik açın. İğneyi yerinde bırakın. Şırınganın üzerine 19G'lik bir iğne yerleştirin.
   12. Tüpü, fenol kırmızı göstergesi ile görülebilen %40/%60 arayüzünün hemen altında dikkatlice delin. İğne eğiminin %40'lık katmana baktığından emin olun.
   13. Baskın olmayan elinizi kullanarak 30G iğnesini tüpün üstünden çıkarın. İğne eğimliyken, virüsü / iyodiksanol'ü yavaşça çıkarın. Amaç 3 mL ile 4.5 mL arasında ekstrakte etmektir. Yaklaşık yarısına kadar ve %40/berrak tabakanın içine, eğimin aşağı bakması için iğneyi döndürün ve protein tabakasından toplanmayı önlemek için çıkarmaya devam edin.
   14. 50 mL'lik tüpü baskın olmayan elinizle hazırlayın, tüpü 50 mL'lik tüpe yerleştirirken iğneyi dikkatlice çıkarın ve atın. AAV / iyodiksanol süspansiyonunu DPBS'de 5 mL'ye kadar doldurarak 15x seyreltin.
   15. Bir santrifüj filtre tüpüne aktarın ve 3428 x g, 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Akışı atın; Filtrenin tutucusunu yavaşça çıkarın ve alt kabı bir atık şişesine koyun. Filtrelemek ve yeniden süspanse etmek için 15 mL PBS-%5 sükroz ekleyin.
   16. 3428 x g'da 4 °C'de 20 dakika santrifüjleyin. Arabellek değişimini en az 3 kez tekrarlayın. Virüsü (~150-250 μL) 4 °C'de (PHP. B varyantları maksimum 3 ay) veya alikot 50 μL alikotlar halinde ve uzun süre -80 ° C'de saklayın.
       BILGINIZE: PHP. B kapsid varyantları donmaya/çözülmeye karşı hassastır, bu nedenle bundan kaçınılmalıdır.
   17. Titrasyonu önceki protokol^10'da açıklandığı gibi gerçekleştirin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Çoğu akademik laboratuvar, AAV üretimi için yapışık HEK293T hücreleri kullanır ^8,9. Bu, doğrudan enjeksiyon için küçük miktarlarda AAV gerektiğinde nispeten iyi çalışsa da, AAV gibi sistemik kapsidlerle benzer transdüksiyon elde etmek için 100 kat daha yüksek bir titre (minimum 1 x 10¹¹ GC / fare) gereklidir. PHP.eB (İngilizce).

Bu protokolde, konik tüplerde kültüre edilen süspansiyon HEK293 hücrel...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

AAV'nin sistemik uygulaması, CNS'ye gen transferi için güçlü bir araçtır; ancak AAV üretimi pahalı ve zahmetli bir süreçtir. Süspansiyon hücreleri kullanılarak, 15^cm2'lik plakalar üzerindeki HEK293T yapışan kültüre kıyasla işçilik ve plastikler azaltılır. Ayrıca, burada uygulanan konik boruların kullanımı kolaydır ve laboratuvar alanı kullanımını en üst düzeye çıkarır. Protokol iki araştırmacı tarafından oluşturuldu ve daha sonra laboratuvardaki diğer kişiler taraf?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm - 50Pk	Beckman Coulter	342414
Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4x1000,	eppendorf	5920701002
Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml	Infors HT/ TPP	587633
Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets	eppendorf	5820747005
Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes	eppendorf	5948000315
Distilled Water	Gibco	15230147
DNase I recombinant, RNase-free	Roche	4716728001
DNase I recombinant, RNase-free	Roche	4716728001
DPBS, calcium, magnesium	Gibco	14040091
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2	Fisher	FB12566504
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45	Fisher	FB12566505
Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube	Infors HT/ TPP	31362
Holder for 600 ml cell culture tube	Infors HT/ TPP	66129
Incubator Minitron 50 mm	Infors HT	500043
LV-MAX Production Medium	Gibco	A3583401
N-Tray Universal	Infors HT/ TPP	31321
OptiPrep - Iodixanol	Serumwerk bernburg	1893
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)	Poly-sciences	24765-100
Phenol red solution	Sigma-Aldrich	72420100
Poly(ethylene glycol) 8000	Sigma-Aldrich	89510
TransIT-VirusGEN	Mirus	Mir 6706
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	5250061
TubeSpin Bioreactors-50ml	TTP	87050
TubeSpin Bioreactors-600ml	TTP	87600
Viral Production Cells	Gibco	A35347
Vivaspin 20 MWCO 100 000	Cytvia	28932363