JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.

기사 소개

  • 요약
  • 초록
  • 서문
  • 프로토콜
  • 대표적 결과
  • 토론
  • 공개
  • 감사의 말
  • 자료
  • 참고문헌
  • 재인쇄 및 허가

요약

여기에서 현탁액 HEK293 셀 기반 AAV 생산 프로토콜이 제시되어 상용 공급업체에서 연구 목적으로 사용할 수 있는 구성 요소를 사용하여 벡터 생산에 필요한 시간과 노동력을 줄일 수 있습니다.

초록

아데노 관련 바이러스 벡터(AAV)는 중추신경계(CNS)를 조사하기 위한 놀라운 도구입니다. AAV와 같은 혁신적인 캡시드. PHP.eB, 생쥐에 정맥 주사를 통한 CNS의 광범위한 transduction을 보여줍니다. 비교 가능한 형질도입을 달성하려면 중추신경계 실질에 직접 주입하는 것과 비교하여 100배 더 높은 역가(최소 1 x 1011 게놈 복제/마우스)가 필요합니다. 우리 그룹에서는 AAV를 포함한 AAV 생산. PHP.eB는 부착 HEK293T 세포와 삼중 형질 주입 방법에 의존합니다. 부착 세포로 높은 AAV 수율을 달성하려면 노동 및 재료 집약적인 공정이 수반됩니다. 이러한 제약은 원뿔형 튜브에서 현탁 기반 세포 배양을 위한 프로토콜의 개발을 촉진했습니다. 부착 세포에서 생성된 AAV를 현탁액 생산 방법과 비교했습니다. 형질주입 시약인 폴리에틸렌이민 또는 TransIt을 이용한 현탁액에서의 배양을 비교하였다. AAV 벡터는 요오딕사놀 그래디언트 초원심분리에 의해 정제된 후 원심 필터를 사용하여 완충액 교환 및 농축에 의해 정제되었습니다. 부착 방법을 사용하면 평균 2.6 x 1012 게놈 사본(GC)을 얻을 수 있는 반면, 현탁법과 폴리에틸렌이민은 총 7.7 x 1012 GC를, TransIt은 총 2.4 x 1013 GC를 산출했습니다. 부유세포 시스템과 비교하여 부착체로 생산된 벡터 간의 in vivo transduction 효율에는 차이가 없습니다. 요약하면, 현탁액 HEK293 셀 기반 AAV 생산 프로토콜이 도입되어 벡터 생산에 필요한 시간과 노동력을 줄이는 동시에 연구 목적으로 상용 공급업체에서 제공하는 구성 요소를 사용하여 3배에서 9배 더 높은 수율을 달성할 수 있습니다.

서문

아데노 관련 바이러스(AAV)는 1965년에 발견되었으며 이후 수많은 응용 분야에서 사용되고 있습니다1. AAV는 유전자 및 신경 기능을 연구하거나, 신경 회로를 매핑하거나, 질병에 대한 동물 모델을 생성하기 위해 신경 과학 연구에 적용되었습니다2. 전통적으로, 이것은 대부분의 자연적인 혈청형이 혈액 뇌 장벽을 통과하지 않거나 그렇게 하기 위하여 과다 복용을 필요로 하지 않기 때문에, 관심사의 위치에 직접 주사해서 행해집니다 1,2,3.

AAV의 발견과 함께. PHP.B4 및 AAV와 같은 차세대 캡시드. PHP.eB5 및 AAV. CAP-B106의 경우, 간단한 전신 주사를 사용하여 중추신경계(CNS)를 표적으로 할 수 있습니다. 공간 매핑은 AAV의 표적이 되는 세포를 보여줍니다. 셀룰러 수준 6,7<....

프로토콜

모든 실험 절차는 네덜란드 왕립 과학 아카데미(KNAW)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 프로젝트 번호 AVD8010020199126에 따라 동물 실험에 관한 네덜란드 법률을 따랐습니다. 그림 1에는 전체 프로토콜에 대한 개략적인 개요가 나와 있습니다. 세포 파종에서 AAV 정제에 이르기까지 프로토콜을 완료하는 데 6일이 걸립니다.

1. 시약 준비

  1. 플라스미드 정제
    1. 플라스미드의 무균성을 보장하기 위해 몇 가지 조정을 통해 제조업체가 설명한 대로 플라스미드 추출을 수행합니다.
    2. 멸균 증류수와 절대 에탄올을 사용하여 70% 에탄올을 준비합니다.
    3. 이소프로판올 원심분리 단계 후 플로우 캐비닛 후드에서 플라스미드를 건조시키고 멸균 70% 에탄올을 튜브에 추가합니다. 에탄올 침전 후 플로우 캐비닛 후드에서 플라스미드를 건조시키고 플라스미드를 멸균 증류수에 재현탁시킵니다. 멸균된 미세 원심분리기 튜브를 사용하도록 주의하십시오.
    4. 정량화, 제한 분석 및 필요한 경우 염기서열분석을 위해 부분 표본을 채취합니다. 돌연변이가 수율에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로 역말단 반복....

대표적 결과

대부분의 학술 실험실은 AAV 생산을 위해 부착 HEK293T 세포를 사용합니다 8,9. 이는 직접 주입에 소량의 AAV가 필요할 때 비교적 잘 작동하지만, AAV와 같은 전신 캡시드와 유사한 transduction을 달성하려면 100배 더 높은 titer(최소 1 x 1011 GC/mouse)가 필요합니다. PHP.eB입니다.

이 프로토콜에서는 원뿔형 튜브에서 배양된 현탁액 HEK293 세.......

토론

AAV의 전신 투여는 중추신경계로의 유전자 전달을 위한 강력한 도구입니다. 그러나 AAV의 생산은 비용이 많이 들고 힘든 과정입니다. 부유 셀을 사용하면 15cm2 플레이트에 HEK293T 부착 배양에 비해 노동력과 플라스틱이 줄어 듭니다. 또한 여기에 구현된 원뿔형 튜브는 다루기 쉽고 실험실 공간 사용을 극대화합니다. 이 프로토콜은 두 명의 연구원에 의해 설정되었으며 이후 실험실의 다른 사?.......

공개

Mirus는 초기 테스트를 위해 TransIT의 무료 샘플을 제공했으며, 그 후 추가 사용을 위해 시약을 구입했습니다. 저자는 보고할 다른 경쟁적인 재정적 이해관계가 없습니다.

감사의 말

이 연구는 네덜란드 왕립 예술 과학 아카데미(KNAW) 연구 기금과 Start2Cure(0-TI-01)의 보조금으로 지원되었습니다. 프로토콜 설정에 대한 의견과 조언을 해주신 Leisha Kopp에게 감사드립니다. 피규어는 Biorender를 사용하여 생성되었습니다.

....

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm - 50PkBeckman Coulter342414
Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4x1000, eppendorf5920701002
Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 mlInfors HT/ TPP587633
Aerosol-tight caps, for 750 mL round bucketseppendorf5820747005
Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubeseppendorf5948000315
Distilled WaterGibco15230147
DNase I recombinant, RNase-freeRoche4716728001
DNase I recombinant, RNase-freeRoche4716728001
DPBS, calcium, magnesiumGibco14040091
DPBS, no calcium, no magnesiumGibco14190144
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2FisherFB12566504
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45FisherFB12566505
Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tubeInfors HT/ TPP31362
Holder for 600 ml cell culture tubeInfors HT/ TPP66129
Incubator Minitron 50 mmInfors HT500043
LV-MAX Production MediumGibcoA3583401
N-Tray UniversalInfors HT/ TPP31321
OptiPrep - IodixanolSerumwerk bernburg1893
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)Poly-sciences24765-100
Phenol red solution Sigma-Aldrich72420100
Poly(ethylene glycol) 8000Sigma-Aldrich89510
TransIT-VirusGENMirusMir 6706
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco5250061
TubeSpin Bioreactors-50mlTTP87050
TubeSpin Bioreactors-600mlTTP87600
Viral Production CellsGibcoA35347
Vivaspin 20 MWCO 100 000Cytvia28932363

참고문헌

  1. Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases. Front Mol Neurosci. 15, 988914 (2022).
  2. Pietersz, K. L., et al.

재인쇄 및 허가

JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기

허가 살펴보기

더 많은 기사 탐색

206

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

개인 정보 보호

이용 약관

정책

연구

교육

JoVE 소개

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유