Produção de lotes vetoriais associados a adeno de alto rendimento usando células de suspensão HEK293

Resumo

Aqui, um protocolo de produção de AAV baseado em células HEK293 de suspensão é apresentado, resultando em tempo e mão de obra reduzidos necessários para a produção de vetores usando componentes que estão disponíveis para fins de pesquisa de fornecedores comerciais.

Resumo

Os vetores virais adenoassociados (AAVs) são uma ferramenta notável para a investigação do sistema nervoso central (SNC). Capsídeos inovadores, como o AAV. PHP.eB, demonstram extensa transdução do SNC por injeção intravenosa em camundongos. Para obter transdução comparável, um título 100 vezes maior (minimamente 1 x^{10 11} cópias do genoma/camundongo) é necessário em comparação com a injeção direta no parênquima do SNC. Em nosso grupo, a produção de AAV, incluindo AAV. O PHP.eB baseia-se em células HEK293T aderentes e no método de tripla transfecção. Alcançar altos rendimentos de AAV com células aderentes envolve um processo trabalhoso e intensivo em material. Essa restrição motivou o desenvolvimento de um protocolo para cultura de células em suspensão em tubos cônicos. Os AAVs gerados em células aderentes foram comparados com o método de produção em suspensão. Foram comparadas culturas em suspensão utilizando os reagentes de transfecção Polietilenimina ou TransIt. Os vetores AAV foram purificados por ultracentrifugação com gradiente de iodixanol seguido de troca e concentração de tampão com filtro centrífugo. Com o método aderente, obteve-se uma média de 2,6 x 10¹² cópias do genoma (CG) no total, enquanto o método de suspensão e Polietilenimina produziram 7,7 x^{10 12} GC no total, e TransIt produziu 2,4 x 10¹³ GC no total. Não há diferença na eficiência de transdução in vivo entre vetores produzidos com aderência em relação ao sistema de células de suspensão. Em resumo, um protocolo de produção AAV baseado em células HEK293 de suspensão é introduzido, resultando em uma quantidade reduzida de tempo e mão de obra necessária para a produção de vetores, enquanto alcança rendimentos 3 a 9 vezes maiores usando componentes disponíveis de fornecedores comerciais para fins de pesquisa.

Introdução

O vírus adenoassociado (AAV) foi descoberto em 1965 e, desde então, tem sido usado em uma infinidade de^{aplicações1}. Os AAVs têm sido aplicados em pesquisas em neurociência para estudar genes e funções neuronais, mapear neurocircuitos ou produzir modelos animais para doenças². Tradicionalmente, isso é feito injetando-se diretamente no local de interesse, pois a maioria dos sorotipos naturais não atravessa a barreira hematoencefálica ou necessita de uma dose alta para fazê-lo ^1,2,3.

Com a descoberta da AAV. PHP.B⁴ e capsídeos de próxima geração, como AAV. PHP.eB⁵ e AAV. CAP-B10⁶, é possível atingir o sistema nervoso central (SNC) com uma simples injeção sistêmica. O mapeamento espacial revela as células alvo do AAV. PHP.eB a nível celular ^6,7. Em combinação com promotores/potencializadores específicos, esses capsídeos oferecem amplas oportunidades para neurocientistas estudarem genes e função cerebral por meio da liberação não invasiva de AAV ^4,8.

Enquanto uma dose mais baixa é necessária para AAV. PHP.eB (tipicamente 1 a 5 x 10¹¹ Cópias do Genoma (GC)/rato) em comparação com AAV9 (4 x^{10 12} GC/rato)⁷, ainda é necessário produzir mais vetor em comparação com as estratégias de injeção direta (tipicamente 1 x 10⁹ GC/μL injecção). A maioria dos sorotipos naturais pode ser produzida utilizando o sistema clássico de cultura celular aderente em combinação com a purificação do iodixanol 9,10,11,12. Para AAV. PHP.eB isso implica um processo trabalhoso para cultivar e transfectar células para obter vetores suficientes para um experimento⁸. Portanto, desenvolveu-se a produção de AAV em cultura de células de suspensão em tubos cônicos. Os tubos cônicos, com capacidade de até 300 mL, são compactos, economizando espaço na incubadora e plásticos. As células de suspensão são muito mais fáceis de cultivar e manusear em grandes quantidades do que as células aderentes em placas de 15 cm. Os componentes de transfecção do protocolo permanecem os mesmos. Portanto, plasmídeos previamente utilizados com o sistema aderente podem ser facilmente utilizados neste protocolo baseado na produção em células de suspensão. O protocolo foi transferido com sucesso para outros pesquisadores no laboratório e usado com sucesso para vários capsídeos e construtos.

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Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais da Royal Netherlands Academy of Sciences (KNAW) e estavam de acordo com a Lei Holandesa de Experimentação Animal sob o projeto número AVD8010020199126. Na Figura 1, uma visão geral esquemática do protocolo completo é fornecida. Da semeadura das células à purificação do AAV, o protocolo leva 6 dias para ser concluído.

1. Preparação dos reagentes

1. Purificação de plasmídeos
   1. Realizar extração de plasmídios conforme descrito pelo fabricante com alguns ajustes para garantir a esterilidade dos plasmídeos.
   2. Preparar etanol 70% usando água destilada estéril e etanol absoluto.
   3. Após a etapa de centrifugação do isopropanol, seque os plasmídeos na capela de fluxo e adicione etanol 70% estéril aos tubos. Após a precipitação do etanol, secar os plasmídeos na capela de fluxo e ressuspender o plasmídeo em água destilada estéril. Tome cuidado ao usar tubos de microcentrífuga esterilizados.
   4. Pegue uma alíquota para quantificação, análise de restrição e, se necessário, sequenciamento. É aconselhável verificar a integridade das repetições terminais invertidas (ITRs), pois as mutações podem ter um impacto negativo no rendimento. Ajustar a concentração da amostra para 1 μg/μL.
2. Preparação de tampão de lise Tween 10x
   1. Dissolver 30,3 g de tampão Tris e 2,033 g MgCl_{2,6H 2}O em 400 mL de água destilada estéril, ajustar o pH para 8,0 e aumentar o volume total para 450 mL.
   2. Manter Tween 20 estéril, adicionar 50 mL de Tween 20 à solução tampão no exaustor e filtrar esterilizar usando um filtro a vácuo de 0,2 μM.
3. Diluições de iodicxanol
   1. A solução de iodixanol é fornecida na concentração de 60%. Use a solução inicial para fazer soluções de 15%, 25% e 40%.
   2. Para solução a 15%, diluir 60 mL de solução a 60% com 48 mL de NaCl 5 M e 48 mL de PBS-MK (5x PBS com 5 mM MgCl₂ e 12,5 mM KCl) e adicionar água destilada até 240 mL.
   3. Para solução a 25%, diluir 67 ml de solução a 60% e 32 ml de PBS-MK. Adicionar água destilada até 160 mL. Misture bem e adicione 1,6 mL de solução de vermelho de fenol.
   4. Para solução a 40%, diluir 160 ml de solução a 60% com 48 ml de PBS-MK e adicionar água destilada até 240 ml. Para a solução a 60%, adicionar 1 ml de vermelho de fenol a 100 ml de solução a 60%.
4. Solução de sacarose a 5% PBS
   1. Adicionar 25 g de sacarose a um frasco de 500 mL de DPBS sem cálcio ou magnésio. Agite bem e filtre usando um filtro a vácuo de garrafa de 0,2 μM.
5. Solução de polietilenoglicol (PEG) 8000
   1. Dissolver 400 g de PEG 8000 e 24 g de NaCl em água destilada estéril e ajustar para um volume final de 1000 mL. Mexa com o aquecimento até dissolver completamente. Ajuste o pH para 7,4 usando papel pH.
   2. Esterilizar o filtro usando um filtro a vácuo de garrafa de 0,2 μM para obter uma solução de PEG 8000 a 40%. Observe que a filtração levará um tempo devido à viscosidade do armazenamento da solução a 4 °C.

2. Cultura de células de suspensão HEK293

1. Use lenços umedecidos embebidos em etanol 70% para limpeza. Limpar a coifa de biossegurança, preparar e limpar todos os materiais necessários para a cultura das células.
2. Pré-aquecer 30 mL de meio de célula de suspensão a 37 °C em um tubo de cultura cônico de 50 mL. Recuperar células de produção viral de nitrogênio líquido. Descongele rapidamente as células em banho-maria a 37 °C. Pouco antes de o frasco para injetáveis ser completamente descongelado, limpe-o com um lenço embebido em etanol a 70% e transfira o frasco para injetáveis para a tampa de biossegurança.
   NOTA: Os detalhes das células de produção viral usadas aqui são fornecidos na Tabela de Materiais.
3. Transfira rapidamente as células para o tubo de cultura cônico pré-aquecido de 50 mL. Células de cultura em incubadora de agitação a 37 °C, 80% de umidade, 8% de CO₂, 200 rotações por min (RPM) e um diâmetro de agitação de 50 mm. Células de passagem, uma vez que a viabilidade está acima de 90% e a densidade celular está acima de 1-3 x 10⁶ células/mL.
   OBS: A incubadora utilizada possui diâmetro de agitação de 50 mm; As condições de cultura devem ser ajustadas para um diâmetro de agitação diferente.
4. Células de passagem 3-4 dias após o descongelamento. Verifique o(s) tubo(s) de cultura para se certificar de que não há sinais de contaminação; Por exemplo, o fungo aparecerá como um anel descolorido (preto ou verde).
5. Preparar 400 μL de solução de azul de tripano a 0,4% por amostra utilizando uma stripette de 1 ml.
6. Recupere rapidamente as células de suspensão da incubadora. Extrair imediatamente 500 μL do tubo utilizando uma stripette de 1 ml. Pipete suavemente para cima e para baixo.
7. Adicionar 100 μL de suspensão celular ao tubo azul de tripano preparado. Inverta suavemente o tubo para misturar; Não pipetar para misturar, pois isso levará à morte celular. Células de retorno à incubadora.
8. Tomar 50 μL de suspensão de células tratadas com azul de tripano e aplicá-lo na lâmina do hemocitômetro. Conte o total de células viáveis e calcule a quantidade de suspensão celular e meio necessário para a passagem ou transfecção no dia seguinte.
9. Meio quente na incubadora por 10-15 min. Adicione a suspensão celular ao meio aquecido e retorne à incubadora. Para células de passagem por 3 dias (ou seja, de segunda a quinta-feira), ajuste para 0,5 x 10⁶ células/mL; para células de passagem por 4 dias (ou seja, de quinta-feira a segunda-feira), definido como 0,3 x 10⁶ células/mL.
   NOTA: De acordo com o fabricante, as células de produção viral dobram a cada 26 h e devem estar entre 3,5 x 10⁶ e 5,5 x 10⁶ antes da passagem. As celas podem ser mantidas por até a passagem 20.

3. Transfecção

1. Dia 1
   1. T24 h antes da transfecção, cultura 1 x 10⁶ células por mL em 300 mL de meio.
2. Dia 2
   1. Meio quente, plasmídeos e reagente de transfecção à temperatura ambiente. Para os montantes a preparar, ver Quadro 1.
   2. Brevemente plasmídeos de vórtice e reagentes. Adicione plasmídeos ao meio preparado, vórtice. Adicione o reagente de transfecção e o vórtice brevemente. Não agite a mistura após esta etapa. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
   3. Enquanto isso, conte as células preparadas no dia 1. As células devem estar entre 2 e 2,5 x 10⁶ células por mL e > 95% viáveis.
   4. Após a incubação, gota a gota, adicione a mistura de transfecção às células enquanto gira suavemente o tubo. Incubar por 72-96 h.

4. Colheita das células

1. Dia 5
   1. Adicionar 33 ml de tampão de lise celular 10x (500 mM Tris pH 8, 10% Tween 20, 20 mM MgCl₂), agitar suavemente e incubar a 37 °C durante 1,5 h com agitação.
   2. Centrifugar a 3428 x g a 4 °C durante 60 min. Filtrar através de um filtro a vácuo de PES 0,45 μM para clarificar o lisado celular, deixando o lisado clarificado no recipiente do filtro.
      NOTA: Opcional após a filtração: colher 50 μL de amostra para PCR quantitativo (Q-PCR).
   3. Adicionar 90 mL de solução de PEG 8000 a 40% a 360 mL de lisado celular filtrado.
   4. Limpe a barra de agitação com etanol 70% e adicione à amostra. Mexa no gelo ou na câmara fria a 300 RPM por 1 h. Incubar a 4 °C sem mexer durante a noite.
      NOTA: Foram testados tempos de incubação de 1 h a 72 h. Tempos de incubação mais longos têm um efeito negativo sobre a precipitação global de proteínas.

5. Purificação de iodicanol

1. Dia 6
   1. Transfira toda a amostra de volume de cultura precipitada de PEG para um tubo cônico grande e limpo e centrífuga a 2820 x g e 4°C por 15 min.
   2. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet de PEG em 15 mL de DPBS com cálcio e magnésio. O pellet é difícil de ressuspender; Tire um tempo para fazer isso com cuidado.
   3. Transfira a peça ressuspensa para um tubo limpo de 50 mL. O PEG permanecerá nas laterais do tubo do biorreator. Adicione mais 10 mL, tomando o cuidado de reunir todo o precipitado de PEG. Transfira tudo para um recipiente de 50 mL para um volume total de 25-30 mL.
   4. Adicionar 40 μL de DNaseI (10 U/μL). Colocar na incubadora por 1 h 37°C.
      NOTA: Opcional após a incubação da DNase: tomar 50 μL de amostra para Q-PCR.
   5. Barras de agitação limpas que foram usadas para precipitação de PEG bem com solução de cloreto seguida de etanol 70%. Deixe as barras de agitação em etanol 70% para o próximo experimento.
   6. Preencher um tubo de polialômero de 25 mm x 89 mm usando uma pipeta de vidro Pasteur com 15,5 mL de lisado celular concentrado em cada tubo. Depois de adicionar o lisado celular, troque a pipeta de vidro Pasteur por uma nova.
   7. Adicionar soluções de iodixanol a 15%-60%: infundir suavemente 9 ml da solução de iodixanol a 15% sob o lisado celular. Em seguida, adicionar 5 mL das soluções de iodixanol a 25% e 40% e, por último, adicionar 5 mL da solução de iodixanol a 60%.
   8. Tampe o tubo usando uma seringa com DPBS +/+ para remover a maioria das bolhas de ar, tomando cuidado para não perturbar as camadas de iodixanol. Sele o tubo usando um topper de tubo elétrico.
   9. Centrifugar em rotor não oscilante por 1 h 10 min a 490.000 x g a 16 °C em uma ultracentrífuga. Retire da ultracentrífuga, monte os tubos em um fecho metálico e prepare os tubos de coleta. Abra o rotor no capô em caso de derramamentos durante a fiação.
   10. Preparar um tubo de 50 mL (para descartar o tubo rotor), um tubo de 15 mL (para coletar vírus), uma seringa de 5 mL e uma agulha de 30G e 19G por gradiente.
   11. Puncione um orifício na parte superior do tubo com uma agulha de 30G. Deixe a agulha no lugar. Coloque uma agulha 19G na seringa.
   12. Puncione cuidadosamente o tubo logo abaixo da interface de 40%/60%, que pode ser vista pelo indicador vermelho de fenol. Certifique-se de que o bisel da agulha está voltado para a camada de 40%.
   13. Retire a agulha 30G da parte superior do tubo usando a mão não dominante. Com a agulha chanfrada, extraia lentamente o vírus/iodixanol. O objetivo é extrair entre 3 mL e 4,5 mL. Cerca da metade do caminho e bem na camada de 40%/transparente, gire a agulha para que o bisel fique virado para baixo e continue a extrair para evitar a coleta da camada de proteína.
   14. Preparar o tubo de 50 mL com a mão não dominante, extrair cuidadosamente a agulha enquanto coloca o tubo no tubo de 50 mL e descartar. Diluir a suspensão de AAV/iodixanol 5x em DPBS enchendo até 15 mL.
   15. Transfira para um tubo de filtro centrífugo e centrífuga a 3428 x g, 4 °C por 10 min. Escoamento de descarte; Remova suavemente o suporte do filtro e coloque o recipiente inferior em uma garrafa de resíduos. Adicionar 15 mL de sacarose PBS-5% para filtrar e ressuspender.
   16. Centrifugar a 3428 x g a 4 °C durante 20 min. Repita a troca de buffer pelo menos 3x. Armazenar vírus (~150-250 μL) a 4 °C (PHP. B variantes no máximo 3 meses) ou alíquota em alíquotas de 50 μL e armazenar a -80 °C a longo prazo.
       NOTA: PHP. As variantes do capsídeo B são sensíveis ao congelamento/descongelamento, por isso isso deve ser evitado.
   17. Realizar titulação conforme descrito em protocolo anterior¹⁰.

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Resultados

A maioria dos laboratórios acadêmicos utiliza células HEK293T aderentes para a produção de AAV ^8,9. Embora isso funcione relativamente bem quando pequenas quantidades de AAV são necessárias para injeção direta, um título 100 vezes maior (minimamente 1 x 10¹¹ GC/mouse) é necessário para obter transdução semelhante com capsídeos sistêmicos, como AAV. PHP.eB.

Nesse protocolo, foi estabelecida a produção de AAV...

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Discussão

A administração sistêmica de AAV é uma poderosa ferramenta para a transferência gênica para o SNC; no entanto, a produção de AAV é um processo caro e trabalhoso. Com o uso de células de suspensão, a mão de obra e os plásticos são reduzidos em comparação com a cultura aderente de HEK293T em placas de 15^cm2 . Além disso, os tubos cônicos implementados aqui são fáceis de manusear e maximizam o uso do espaço do laboratório. O protocolo foi montado por dois pesquisadores e, posteriormente, apl...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm - 50Pk	Beckman Coulter	342414
Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4x1000,	eppendorf	5920701002
Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml	Infors HT/ TPP	587633
Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets	eppendorf	5820747005
Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes	eppendorf	5948000315
Distilled Water	Gibco	15230147
DNase I recombinant, RNase-free	Roche	4716728001
DNase I recombinant, RNase-free	Roche	4716728001
DPBS, calcium, magnesium	Gibco	14040091
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2	Fisher	FB12566504
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45	Fisher	FB12566505
Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube	Infors HT/ TPP	31362
Holder for 600 ml cell culture tube	Infors HT/ TPP	66129
Incubator Minitron 50 mm	Infors HT	500043
LV-MAX Production Medium	Gibco	A3583401
N-Tray Universal	Infors HT/ TPP	31321
OptiPrep - Iodixanol	Serumwerk bernburg	1893
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)	Poly-sciences	24765-100
Phenol red solution	Sigma-Aldrich	72420100
Poly(ethylene glycol) 8000	Sigma-Aldrich	89510
TransIT-VirusGEN	Mirus	Mir 6706
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	5250061
TubeSpin Bioreactors-50ml	TTP	87050
TubeSpin Bioreactors-600ml	TTP	87600
Viral Production Cells	Gibco	A35347
Vivaspin 20 MWCO 100 000	Cytvia	28932363