Herstellung von Adeno-assoziierten Vektorchargen mit hoher Ausbeute unter Verwendung von HEK293-Suspensionszellen

Zusammenfassung

Hier wird ein zellbasiertes AAV-Produktionsprotokoll für HEK293-Suspensionen vorgestellt, das zu einem reduzierten Zeit- und Arbeitsaufwand für die Vektorproduktion mit Komponenten führt, die für Forschungszwecke von kommerziellen Anbietern erhältlich sind.

Zusammenfassung

Adeno-assoziierte virale Vektoren (AAVs) sind ein bemerkenswertes Werkzeug zur Untersuchung des zentralen Nervensystems (ZNS). Innovative Kapside, wie z. B. AAV. PHP.eB, zeigen eine ausgedehnte Transduktion des ZNS durch intravenöse Injektion bei Mäusen. Um eine vergleichbare Transduktion zu erreichen, ist ein 100-fach höherer Titer (mindestens 1 x 10¹¹ Genomkopien/Maus) im Vergleich zur direkten Injektion in das ZNS-Parenchym erforderlich. In unserer Gruppe ist die AAV-Produktion, einschließlich AAV. PHP.eB setzt auf adhärente HEK293T Zellen und die dreifache Transfektionsmethode. Das Erreichen hoher AAV-Ausbeuten mit adhärenten Zellen erfordert einen arbeits- und materialintensiven Prozess. Diese Einschränkung veranlasste die Entwicklung eines Protokolls für suspensionsbasierte Zellkulturen in konischen Röhrchen. AAVs, die in adhärenten Zellen erzeugt wurden, wurden mit der Suspensionsherstellungsmethode verglichen. Kulturen in Suspension mit Transfektionsreagenzien Polyethylenimin oder TransIt wurden verglichen. AAV-Vektoren wurden durch Iodixanol-Gradienten-Ultrazentrifugation gereinigt, gefolgt von Pufferaustausch und Konzentration mit einem Zentrifugalfilter. Mit der adhärenten Methode erreichten wir insgesamt durchschnittlich 2,6 x 10¹² Genomkopien (GC), während die Suspensionsmethode und Polyethylenimin insgesamt 7,7 x 10¹² GC und TransIt insgesamt 2,4 x 10¹³ GC ergaben. Es gibt keinen Unterschied in der In-vivo-Transduktionseffizienz zwischen Vektoren, die mit Adhärent hergestellt wurden, im Vergleich zum Suspensionszellensystem. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein auf Suspensionszellen HEK293-Zellen basierendes AAV-Produktionsprotokoll eingeführt wird, das zu einem geringeren Zeit- und Arbeitsaufwand für die Vektorproduktion führt und gleichzeitig eine 3- bis 9-mal höhere Ausbeute mit Komponenten erzielt, die von kommerziellen Anbietern für Forschungszwecke erhältlich sind.

Einleitung

Das Adeno-assoziierte Virus (AAV) wurde 1965 entdeckt und seitdem in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt¹. AAVs wurden in der neurowissenschaftlichen Forschung eingesetzt, um Gen- und neuronale Funktionen zu untersuchen, Neuroschaltkreise zu kartieren oder Tiermodelle für Krankheiten^{herzustellen 2}. Traditionell geschieht dies durch Injektion direkt an der interessierenden Stelle, da die meisten natürlichen Serotypen die Blut-Hirn-Schranke nicht überwinden oder dafür eine hohe Dosis benötigen ^1,2,3.

Mit der Entdeckung von AAV. PHP.B⁴ und Kapside der nächsten Generation wie AAV. PHP.eB⁵ und AAV. CAP-B10⁶ ist es möglich, das Zentralnervensystem (ZNS) mit einer einfachen systemischen Injektion anzugreifen. Die räumliche Kartierung zeigt die Zellen, auf die AAV abzielt. PHP.eB auf zellulärer Ebene ^6,7. In Kombination mit spezifischen Promotoren/Enhancern bieten diese Kapside Neurowissenschaftlern umfangreiche Möglichkeiten, Gene und Gehirnfunktionen durch nicht-invasive AAV-Verabreichung zu untersuchen ^4,8.

Während für AAV eine niedrigere Dosis erforderlich ist. PHP.eB (typischerweise 1 bis 5 x 10¹¹ Genomkopien (GC)/Maus) im Vergleich zu AAV9 (4 x 10¹² GC/Maus)⁷, es muss noch mehr Vektor hergestellt werden als bei Direktinjektionsstrategien (typischerweise 1 x 10⁹ GC/μl Injektion). Die meisten natürlichen Serotypen können mit dem klassischen adhärenten Zellkultursystem in Kombination mit der Iodixanol-Aufreinigung hergestellt werden 9,10,11,12. Für AAV. PHP.eB Dies beinhaltet einen arbeitsintensiven Prozess zum Kultivieren und Transfizieren von Zellen, um genügend Vektoren für ein Experiment zu erhalten⁸. Daher wurde die Herstellung von AAV in Suspensionszellkultur in konischen Röhrchen entwickelt. Konische Röhrchen mit einem Fassungsvermögen von bis zu 300 ml sind kompakt und sparen sowohl Platz im Inkubator als auch Kunststoff. Suspensionszellen sind in großen Mengen viel einfacher zu kultivieren und zu handhaben als adhärente Zellen auf 15-cm-Platten. Die Transfektionskomponenten des Protokolls bleiben gleich. Daher können Plasmide, die zuvor mit dem adhärenten System verwendet wurden, problemlos in diesem Protokoll verwendet werden, basierend auf der Produktion in Suspensionszellen. Das Protokoll wurde erfolgreich auf andere Forscher im Labor übertragen und erfolgreich für verschiedene Kapside und Konstrukte verwendet.

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Protokoll

Alle Versuchsverfahren wurden vom institutionellen Tierpflege- und Verwendungsausschuss der Königlich Niederländischen Akademie der Wissenschaften (KNAW) genehmigt und entsprachen dem niederländischen Tierversuchsgesetz unter der Projektnummer AVD8010020199126. In Abbildung 1 ist ein schematischer Überblick über das gesamte Protokoll gegeben. Von der Aussaat der Zellen bis zur AAV-Aufreinigung dauert das Protokoll 6 Tage.

1. Reagenzien-Vorbereitung

1. Plasmid-Aufreinigung
   1. Führen Sie die Plasmidextraktion wie vom Hersteller beschrieben mit einigen Anpassungen durch, um die Sterilität der Plasmide zu gewährleisten.
   2. Bereiten Sie 70% Ethanol mit sterilem destilliertem Wasser und absolutem Ethanol zu.
   3. Nach dem Isopropanol-Zentrifugationsschritt trocknen Sie die Plasmide in der Durchflussschrankhaube und geben Sie steriles 70%iges Ethanol in die Röhrchen. Nach der Ethanolfällung trocknen Sie die Plasmide in der Haube des Durchflussschranks und resuspendieren Sie das Plasmid in sterilem destilliertem Wasser. Achten Sie darauf, sterilisierte Mikrozentrifugenröhrchen zu verwenden.
   4. Nehmen Sie ein Aliquot zur Quantifizierung, Restriktionsanalyse und, falls erforderlich, Sequenzierung. Es wird empfohlen, die Integrität der invertierten terminalen Wiederholungen (ITRs) zu überprüfen, da sich Mutationen negativ auf den Ertrag auswirken können. Stellen Sie die Probenkonzentration auf 1 μg/μl ein.
2. Herstellung von 10x Tween-Lysepuffer
   1. Lösen Sie 30,3 g Tris-Puffer und 2,033 g MgCl 2,6H ₂O in 400 ml sterilem destilliertem Wasser, stellen Sie den pH-Wert auf 8,0 ein und erhöhen Sie das Gesamtvolumen auf 450 ml.
   2. Halten Sie Tween 20 steril, geben Sie 50 ml Tween 20 in die Pufferlösung in der Haube und sterilisieren Sie sie mit einem 0,2-μM-Vakuumfilter.
3. Jodixanol-Verdünnungen
   1. Jodixanollösung wird in einer Konzentration von 60% bereitgestellt. Verwenden Sie die Ausgangslösung, um 15 %, 25 % und 40 % Lösungen herzustellen.
   2. Für eine 15%ige Lösung verdünnen Sie 60 ml 60% ige Lösung mit 48 ml 5 M NaCl und 48 ml PBS-MK (5x PBS mit 5 mM MgCl₂ und 12,5 mM KCl) und fügen Sie destilliertes Wasser bis zu 240 ml hinzu.
   3. Für 25% ige Lösung verdünnen Sie 67 ml 60% ige Lösung und 32 ml PBS-MK. Fügen Sie destilliertes Wasser bis zu 160 ml hinzu. Gut mischen und 1,6 ml Phenolrotlösung hinzufügen.
   4. Für 40% ige Lösung 160 ml 60% ige Lösung mit 48 ml PBS-MK verdünnen und destilliertes Wasser bis zu 240 ml hinzufügen. Für eine 60%ige Lösung fügen Sie 1 ml Phenolrot zu 100 ml 60% iger Lösung hinzu.
4. PBS 5%ige Saccharoselösung
   1. Geben Sie 25 g Saccharose in eine 500-ml-Flasche DPBS ohne Kalzium oder Magnesium. Gut schütteln und mit einem 0,2 μM Flaschenvakuumfilter filtrieren.
5. Polyethylenglykol (PEG) 8000 Lösung
   1. 400 g PEG 8000 und 24 g NaCl in sterilem destilliertem Wasser auflösen und auf ein Endvolumen von 1000 ml einstellen. Unter Erhitzen umrühren, bis es sich vollständig aufgelöst hat. Stellen Sie den pH-Wert mit pH-Papier auf 7,4 ein.
   2. Filtersterilisieren Sie mit einem 0,2-μM-Flaschenvakuumfilter, um eine 40%ige PEG 8000-Lösung zu erhalten. Beachten Sie, dass die Filtration aufgrund der Viskosität des Lösungslagers bei 4 °C eine Weile dauern kann.

2. Kultur von HEK293-Suspensionszellen

1. Verwenden Sie zur Reinigung in 70% Ethanol getränkte Tücher. Reinigen Sie die Biosicherheitshaube, bereiten Sie alle Materialien vor, die für die Kultivierung von Zellen benötigt werden.
2. 30 ml Suspensionszellenmedium in einem konischen 50-ml-Kultivierungsröhrchen auf 37 °C vorwärmen. Gewinnen Sie virale Produktionszellen aus flüssigem Stickstoff. Zellen in einem 37 °C warmen Wasserbad schnell auftauen. Reinigen Sie das Fläschchen kurz vor dem vollständigen Auftauen mit einem in 70 % Ethanol getränkten Tuch und geben Sie das Fläschchen in die Biosicherheitshaube.
   HINWEIS: Die Details der hier verwendeten viralen Produktionszellen sind in der Materialtabelle angegeben.
3. Übertragen Sie die Zellen schnell in das vorgewärmte konische 50-ml-Kultivierungsröhrchen. Kultivieren Sie Zellen in einem Schüttelinkubator bei 37 °C, 80 % Luftfeuchtigkeit, 8 % CO₂, 200 Umdrehungen pro Minute (RPM) und einem Schütteldurchmesser von 50 mm. Passagezellen, sobald die Lebensfähigkeit über 90% und die Zelldichte über 1-3 x 10⁶ Zellen/ml liegt.
   HINWEIS: Der verwendete Inkubator hat einen Schütteldurchmesser von 50 mm; Die Kulturbedingungen sollten für einen anderen Schütteldurchmesser angepasst werden.
4. Passagezellen 3-4 Tage nach dem Auftauen. Überprüfen Sie die Kulturröhrchen, um sicherzustellen, dass keine Anzeichen einer Kontamination vorliegen. Zum Beispiel erscheint der Pilz als verfärbter (schwarzer oder grüner) Ring.
5. Bereiten Sie 400 μl 0,4%ige Trypanblaulösung pro Probe mit einer 1-ml-Stripette vor.
6. Schnelle Entnahme von Suspensionszellen aus dem Inkubator. Extrahieren Sie sofort 500 μl mit einem 1-ml-Streifen aus dem Röhrchen. Vorsichtig auf und ab pipettieren.
7. 100 μl Zellsuspension in das vorbereitete trypanblaue Röhrchen geben. Drehen Sie das Rohr vorsichtig um, um es zu mischen; Pipettieren Sie nicht zum Mischen, da dies zum Zelltod führt. Zellen in den Inkubator zurücklegen.
8. Nehmen Sie 50 μl mit Trypanblau behandelte Zellsuspension und tragen Sie sie auf den Hämozytometer-Objektträger auf. Zählen Sie die Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen und berechnen Sie die Menge an Zellsuspension und Medium, die für die Passage oder Transfektion am nächsten Tag benötigt wird.
9. Warmes Medium im Inkubator für 10-15 min. Geben Sie die Zellsuspension in das erwärmte Medium und kehren Sie zum Inkubator zurück. Für die Übergabe von Zellen für 3 Tage (d. h. Montag-Donnerstag) auf 0,5 x 10⁶ Zellen/ml eingestellt; für die Passage von Zellen für 4 Tage (d. h. Donnerstag-Montag), eingestellt auf 0,3 x 10⁶ Zellen/ml.
   HINWEIS: Laut Hersteller verdoppeln sich die Zellen der Virusproduktion alle 26 Stunden und sollten vor dem Passieren zwischen 3,5 x 10⁶ und 5,5 x 10⁶ liegen. Die Zellen können bis zum Durchgang 20 aufbewahrt werden.

3. Transfektion

1. Tag 1
   1. 24 h vor der Transfektion 1 x 10⁶ Zellen pro ml in 300 ml Medium kultivieren.
2. Tag 2
   1. Warmes Medium, Plasmide und Transfektionsreagenz auf Raumtemperatur. Die vorzubereitenden Beträge sind Tabelle 1 zu entnehmen.
   2. Kurz Plasmide und Reagenzien vortexen. Fügen Sie dem vorbereiteten Medium Plasmide hinzu, Vortex. Transfektionsreagenz zugeben und kurz vortexen. Rühren Sie die Mischung nach diesem Schritt nicht um. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   3. In der Zwischenzeit die am Tag 1 vorbereiteten Zellen zählen. Die Zellen sollten zwischen 2 und 2,5 x 10⁶ Zellen pro ml und > 95% lebensfähig sein.
   4. Geben Sie nach der Inkubation die Transfektionsmischung tropfenweise in die Zellen, während Sie das Röhrchen vorsichtig schwenken. 72-96 h inkubieren.

4. Ernte der Zellen

1. Tag 5
   1. 33 ml 10x Zelllysepuffer (500 mM Tris pH 8, 10% Tween 20, 20 mM MgCl₂) zugeben, durch leichtes Schütteln mischen und bei 37 °C 1,5 h unter Schütteln inkubieren.
   2. Zentrifugieren Sie bei 3428 x g bei 4 °C für 60 min. Filtrieren Sie durch einen 0,45 μM PES-Vakuumfilter, um das Zelllysat zu klären, und lassen Sie das geklärte Lysat im Behälter des Filters.
      HINWEIS: Optional nach der Filtration: Entnehmen Sie 50 μl Probe für die quantitative PCR (Q-PCR).
   3. 90 ml 40%ige PEG 8000-Lösung zu 360 ml gefiltertem Zelllysat geben.
   4. Reinigen Sie den Rührstab mit 70% Ethanol und geben Sie ihn in die Probe. Auf Eis oder im Kühlraum bei 300 U/min 1 h umrühren. Über Nacht bei 4 °C ohne Rühren inkubieren.
      HINWEIS: Es wurden Inkubationszeiten von 1 h bis 72 h getestet. Längere Inkubationszeiten wirken sich negativ auf die gesamte Proteinausfällung aus.

5. Jodixanol-Reinigung

1. Tag 6
   1. Die gesamte PEG-gefällte Kulturvolumenprobe wird in ein sauberes, großes konisches Röhrchen überführt und 15 Minuten lang bei 2820 x g und 4 °C zentrifugiert.
   2. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das PEG-Pellet in 15 ml DPBS mit Kalzium und Magnesium. Das Pellet lässt sich nur schwer resuspendieren; Nehmen Sie sich die Zeit, dies sorgfältig zu tun.
   3. Übertragen Sie den resuspendierten Teil in ein sauberes 50-ml-Röhrchen. PEG verbleibt an den Seiten des Bioreaktorrohrs. Fügen Sie weitere 10 ml hinzu und achten Sie darauf, den gesamten PEG-Niederschlag zu sammeln. Alles in einen 50-ml-Behälter für ein Gesamtvolumen von 25-30 ml umfüllen.
   4. Fügen Sie 40 μl DNaseI (10 U/μl) hinzu. Für 1 h 37°C in den Inkubator stellen.
      HINWEIS: Optional nach Inkubation von DNase: Entnehmen Sie 50 μl Probe für die Q-PCR.
   5. Reinigen Sie Rührstäbe, die für die PEG-Fällung verwendet wurden, gut mit Chloridlösung, gefolgt von 70% Ethanol. Lassen Sie die Rührstäbchen in 70% Ethanol für das nächste Experiment.
   6. Füllen Sie ein 25 mm x 89 mm großes Polyallomerröhrchen mit einer Glaspasteurpipette mit 15,5 ml konzentriertem Zelllysat in jedem Röhrchen. Tauschen Sie nach der Zugabe von Zelllysat die Glaspipette Pasteur gegen eine neue aus.
   7. Fügen Sie Iodixanollösungen von 15%-60% hinzu: Ziehen Sie 9 ml der 15%igen Iodixanollösung vorsichtig unter das Zelllysat. Als nächstes fügen Sie 5 ml der 25% und 40% igen Iodixanollösungen und zuletzt 5 ml der 60% igen Iodixanollösung hinzu.
   8. Verschließen Sie das Röhrchen mit einer Spritze mit DPBS +/+, um die meisten Luftblasen zu entfernen, und achten Sie darauf, die Iodixanolschichten nicht zu stören. Verschließen Sie das Rohr mit einem elektrischen Schlauchaufsatz.
   9. 1 h 10 min bei 490.000 x g bei 16 °C in einer Ultrazentrifuge in einem Ausschwingrotor zentrifugieren. Aus der Ultrazentrifuge nehmen, die Röhrchen in einem Metallverschluss zusammensetzen und Sammelröhrchen vorbereiten. Öffnen Sie den Rotor in der Haube, falls während des Schleuderns etwas verschüttet wird.
   10. Bereiten Sie ein 50-ml-Röhrchen (zum Entsorgen des Rotorröhrchens), ein 15-ml-Röhrchen (zum Auffangen von Viren), eine 5-ml-Spritze und eine 30-g- und 19-g-Nadel pro Gradient vor.
   11. Stechen Sie mit einer 30G-Nadel ein Loch in die Oberseite des Röhrchens. Lassen Sie die Nadel an Ort und Stelle. Legen Sie eine 19G-Nadel auf die Spritze.
   12. Durchstechen Sie das Röhrchen vorsichtig knapp unter der 40%/60%-Grenzfläche, die an der Phenolrotanzeige zu erkennen ist. Stellen Sie sicher, dass die Nadelfase zur 40%-Schicht zeigt.
   13. Entfernen Sie die 30G-Nadel mit der nicht dominanten Hand von der Oberseite des Röhrchens. Extrahieren Sie mit abgeschrägter Nadel langsam das Virus/Iodixanol. Ziel ist es, zwischen 3 ml und 4,5 ml zu extrahieren. Drehen Sie die Nadel etwa auf halbem Weg und weit in die 40%/klare Schicht hinein, damit die Fase nach unten zeigt, und extrahieren Sie weiter, um eine Ansammlung aus der Proteinschicht zu vermeiden.
   14. Bereiten Sie das 50-ml-Röhrchen mit der nicht dominanten Hand vor, ziehen Sie die Nadel vorsichtig heraus, während Sie das Röhrchen in das 50-ml-Röhrchen legen und entsorgen. Verdünnen Sie die AAV/Iodixanol-Suspension 5x in DPBS, indem Sie bis zu 15 ml füllen.
   15. In ein Zentrifugalfilterrohr umfüllen und bei 3428 x g, 4 °C 10 min zentrifugieren. Durchfluss verwerfen; Entfernen Sie vorsichtig den Halter des Filters und kippen Sie den unteren Behälter in eine Abfallflasche. Fügen Sie 15 ml PBS-5% Saccharose hinzu, um zu filtrieren und zu resuspendieren.
   16. Zentrifugieren Sie bei 3428 x g bei 4 °C für 20 min. Wiederholen Sie den Pufferaustausch mindestens 3x. Viren (~150-250 μl) bei 4 °C (PHP. B-Varianten (maximal 3 Monate) oder in 50 μl Aliquote aliquotieren und langfristig bei -80 °C lagern.
       HINWEIS: PHP. B-Kapsidvarianten reagieren empfindlich auf Einfrieren/Auftauen, daher sollte dies vermieden werden.
   17. Führen Sie die Titration wie in einem früheren Protokoll^{beschrieben durch 10}.

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Ergebnisse

Die meisten akademischen Labore verwenden adhärente HEK293T Zellen für die AAV-Produktion ^8,9. Während dies relativ gut funktioniert, wenn kleine Mengen AAV für die Direktinjektion benötigt werden, ist ein 100-fach höherer Titer (mindestens 1 x 10¹¹ GC/Maus) erforderlich, um eine ähnliche Transduktion mit systemischen Kapsiden wie AAV zu erreichen. PHP.eB.

In diesem Protokoll wurde die Herstellung von AAV unter Verwen...

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Diskussion

Die systemische Verabreichung von AAV ist ein wirksames Werkzeug für den Gentransfer in das ZNS; Die Herstellung von AAV ist jedoch ein teurer und mühsamer Prozess. Durch die Verwendung von Suspensionszellen werden Arbeitsaufwand und Kunststoffe im Vergleich zur adhärenten Kultur von HEK293T auf 15 cm² Platten reduziert. Darüber hinaus sind die hier implementierten konischen Röhrchen einfach zu handhaben und maximieren die Nutzung des Laborraums. Das Protokoll wurde von zwei Forschern erstellt und anschli...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm - 50Pk	Beckman Coulter	342414
Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4x1000,	eppendorf	5920701002
Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml	Infors HT/ TPP	587633
Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets	eppendorf	5820747005
Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes	eppendorf	5948000315
Distilled Water	Gibco	15230147
DNase I recombinant, RNase-free	Roche	4716728001
DNase I recombinant, RNase-free	Roche	4716728001
DPBS, calcium, magnesium	Gibco	14040091
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2	Fisher	FB12566504
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45	Fisher	FB12566505
Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube	Infors HT/ TPP	31362
Holder for 600 ml cell culture tube	Infors HT/ TPP	66129
Incubator Minitron 50 mm	Infors HT	500043
LV-MAX Production Medium	Gibco	A3583401
N-Tray Universal	Infors HT/ TPP	31321
OptiPrep - Iodixanol	Serumwerk bernburg	1893
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)	Poly-sciences	24765-100
Phenol red solution	Sigma-Aldrich	72420100
Poly(ethylene glycol) 8000	Sigma-Aldrich	89510
TransIT-VirusGEN	Mirus	Mir 6706
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	5250061
TubeSpin Bioreactors-50ml	TTP	87050
TubeSpin Bioreactors-600ml	TTP	87600
Viral Production Cells	Gibco	A35347
Vivaspin 20 MWCO 100 000	Cytvia	28932363