使用 HEK293 悬浮细胞生产高产腺相关载体批次

摘要

本文介绍了一种悬浮液HEK293基于细胞的AAV生产方案，从而减少了使用商业供应商提供的用于研究目的的组件进行载体生产所需的时间和劳动力。

摘要

腺相关病毒载体 （AAV） 是研究中枢神经系统 （CNS） 的绝佳工具。创新衣壳，如AAV。PHP.eB，证明通过小鼠静脉注射对中枢神经系统进行广泛转导。为了实现可比的转导，与直接注射CNS实质相比，需要高出100倍的滴度（至少1 x 10¹¹ 个基因组拷贝/小鼠）。在我们集团中，AAV生产，包括AAV。PHP.eB 依赖于贴壁HEK293T细胞和三联转染方法。使用贴壁细胞实现高产量的AAV需要劳动和材料密集型过程。这种限制促使开发了一种在锥形管中基于悬浮液的细胞培养方案。将贴壁细胞中产生的AAV与悬浮液生产方法进行比较。比较使用转染试剂聚乙烯亚胺或TransIt的悬浮培养物。通过碘克沙醇梯度超速离心纯化AAV载体，然后使用离心过滤器进行缓冲液置换和浓缩。使用贴壁法，我们平均获得了 2.6 x 10¹² 个基因组拷贝 （GC），而悬浮法和聚乙烯亚胺总共产生了 7.7 x 10¹² GC，TransIt 总共产生了 2.4 x 10¹³ GC。与悬浮细胞系统相比，贴壁细胞产生的载体之间的 体内 转导效率没有差异。总之，引入了基于悬浮 HEK293 细胞的 AAV 生产方案，从而减少了载体生产所需的时间和劳动力，同时使用商业供应商提供的用于研究目的的组件实现了 3 至 9 倍的产量。

引言

腺相关病毒 （AAV） 于 1965 年被发现，此后被用于无数应用¹。AAV 已应用于神经科学研究，以研究基因和神经元功能、绘制神经回路或生成疾病² 的动物模型。传统上，这是通过直接在感兴趣的部位注射来完成的，因为大多数天然血清型不会穿过血脑屏障或需要高剂量才能这样做 ^1,2,3。

随着AAV的发现。PHP.B⁴ 和下一代衣壳，如 AAV。PHP.eB⁵ 和 AAV.CAP-B10⁶，可以使用简单的全身注射来靶向中枢神经系统（CNS）。空间映射揭示了AAV靶向的细胞。PHP.eB 在细胞水平 ^6,7.这些衣壳与特定的启动子/增强子相结合，为神经科学家提供了广泛的机会，通过非侵入性 AAV 递送来研究基因和大脑功能 ^4,8。<....

研究方案

所有实验程序均由荷兰皇家科学院（KNAW）的机构动物护理和使用委员会批准，并符合项目编号AVD8010020199126下的荷兰动物实验法。 在图1中，提供了完整协议的原理图概述。从接种细胞到AAV纯化，该方案需要6天才能完成。

1.试剂制备

1. 质粒纯化
   1. 按照制造商的描述进行质粒提取，并进行一些调整以确保质粒的无菌性。
   2. 使用无菌蒸馏水和无水乙醇制备70%乙醇。
   3. 在异丙醇离心步骤之后，将质粒干燥在流柜罩中，并向试管中加入无菌的70%乙醇。乙醇沉淀后，将质粒在流柜罩中干燥，并将质粒重悬于无菌蒸馏水中。注意使用灭菌的微量离心管。
   4. 取等分试样进行定量、限制性分析，并在需要时进行测序。建议检查倒置末端重复序列 （ITR） 的完整性，因为突变会对产量产生负面影响。将样品浓度调节至1μg/μL。
2. 10x 吐温裂解缓冲液的制备
   1. 将 30.3 g Tris 缓冲液和 2.033 g MgCl_{2.6H 2}O 溶于 400 mL 无菌蒸馏水中，将 pH 设置为 8.0，并将总体积增加到 450 mL。
   2. 保持吐温 20 无菌，将 50 mL 吐温 20 加入到罩中的缓冲溶液中，并使用 0.....

讨论

AAV的全身给药是基因转移到中枢神经系统的有力工具;然而，AAV的生产是一个昂贵而费力的过程。通过使用悬浮细胞，与在 15 cm² 板上贴壁培养HEK293T相比，减少了劳动力和塑料。此外，这里采用的锥形管易于操作，并最大限度地利用了实验室空间。该协议由两名研究人员制定，随后由实验室中的其他人应用。三位独立研究人员的一系列生产平均每批产生足够的载体来注射6-7只小鼠。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm - 50Pk	Beckman Coulter	342414
Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4x1000,	eppendorf	5920701002
Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml	Infors HT/ TPP	587633
Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets	eppendorf	5820747005
Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes	eppendorf	5948000315
Distilled Water	Gibco	15230147
DNase I recombinant, RNase-free	Roche	4716728001
DNase I recombinant, RNase-free	Roche	4716728001
DPBS, calcium, magnesium	Gibco	14040091
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2	Fisher	FB12566504
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45	Fisher	FB12566505
Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube	Infors HT/ TPP	31362
Holder for 600 ml cell culture tube	Infors HT/ TPP	66129
Incubator Minitron 50 mm	Infors HT	500043
LV-MAX Production Medium	Gibco	A3583401
N-Tray Universal	Infors HT/ TPP	31321
OptiPrep - Iodixanol	Serumwerk bernburg	1893
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)	Poly-sciences	24765-100
Phenol red solution	Sigma-Aldrich	72420100
Poly(ethylene glycol) 8000	Sigma-Aldrich	89510
TransIT-VirusGEN	Mirus	Mir 6706
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	5250061
TubeSpin Bioreactors-50ml	TTP	87050
TubeSpin Bioreactors-600ml	TTP	87600
Viral Production Cells	Gibco	A35347
Vivaspin 20 MWCO 100 000	Cytvia	28932363