使用 HEK293 悬浮细胞生产高产腺相关载体批次

摘要

本文介绍了一种悬浮液HEK293基于细胞的AAV生产方案，从而减少了使用商业供应商提供的用于研究目的的组件进行载体生产所需的时间和劳动力。

摘要

腺相关病毒载体 （AAV） 是研究中枢神经系统 （CNS） 的绝佳工具。创新衣壳，如AAV。PHP.eB，证明通过小鼠静脉注射对中枢神经系统进行广泛转导。为了实现可比的转导，与直接注射CNS实质相比，需要高出100倍的滴度（至少1 x 10¹¹ 个基因组拷贝/小鼠）。在我们集团中，AAV生产，包括AAV。PHP.eB 依赖于贴壁HEK293T细胞和三联转染方法。使用贴壁细胞实现高产量的AAV需要劳动和材料密集型过程。这种限制促使开发了一种在锥形管中基于悬浮液的细胞培养方案。将贴壁细胞中产生的AAV与悬浮液生产方法进行比较。比较使用转染试剂聚乙烯亚胺或TransIt的悬浮培养物。通过碘克沙醇梯度超速离心纯化AAV载体，然后使用离心过滤器进行缓冲液置换和浓缩。使用贴壁法，我们平均获得了 2.6 x 10¹² 个基因组拷贝 （GC），而悬浮法和聚乙烯亚胺总共产生了 7.7 x 10¹² GC，TransIt 总共产生了 2.4 x 10¹³ GC。与悬浮细胞系统相比，贴壁细胞产生的载体之间的 体内 转导效率没有差异。总之，引入了基于悬浮 HEK293 细胞的 AAV 生产方案，从而减少了载体生产所需的时间和劳动力，同时使用商业供应商提供的用于研究目的的组件实现了 3 至 9 倍的产量。

引言

腺相关病毒 （AAV） 于 1965 年被发现，此后被用于无数应用¹。AAV 已应用于神经科学研究，以研究基因和神经元功能、绘制神经回路或生成疾病² 的动物模型。传统上，这是通过直接在感兴趣的部位注射来完成的，因为大多数天然血清型不会穿过血脑屏障或需要高剂量才能这样做 ^1,2,3。

随着AAV的发现。PHP.B⁴ 和下一代衣壳，如 AAV。PHP.eB⁵ 和 AAV.CAP-B10⁶，可以使用简单的全身注射来靶向中枢神经系统（CNS）。空间映射揭示了AAV靶向的细胞。PHP.eB 在细胞水平 ^6,7.这些衣壳与特定的启动子/增强子相结合，为神经科学家提供了广泛的机会，通过非侵入性 AAV 递送来研究基因和大脑功能 ^4,8。

而 AAV 需要较低的剂量。PHP.eB（通常为 1 至 5 x 10¹¹ 个基因组拷贝 （GC）/小鼠）与 AAV9（4 x 10¹² GC/小鼠）⁷ 相比，与直接进样策略（通常为 1 x 10⁹ GC/μL 进样）相比，仍需要产生更多的载体。大多数天然血清型可以使用经典贴壁细胞培养系统结合碘克沙醇纯化9,10,11,12来生产。对于 AAV。PHP.eB 这需要一个劳动密集型的过程来培养和转染细胞，以获得足够的载体进行一次实验⁸。因此，开发了在锥形管中悬浮细胞培养中生产AAV。锥形管容量高达 300 mL，结构紧凑，既节省了培养箱空间，又节省了塑料。悬浮细胞比 15 cm 板上的贴壁细胞更容易大量培养和处理。实验方案的转染成分保持不变。因此，先前与贴壁系统一起使用的质粒可以很容易地用于基于悬浮细胞中生产的该方案。该方案已成功转移给实验室中的其他研究人员，并成功用于各种衣壳和构建体。

研究方案

所有实验程序均由荷兰皇家科学院（KNAW）的机构动物护理和使用委员会批准，并符合项目编号AVD8010020199126下的荷兰动物实验法。 在图1中，提供了完整协议的原理图概述。从接种细胞到AAV纯化，该方案需要6天才能完成。

1.试剂制备

1. 质粒纯化
   1. 按照制造商的描述进行质粒提取，并进行一些调整以确保质粒的无菌性。
   2. 使用无菌蒸馏水和无水乙醇制备70%乙醇。
   3. 在异丙醇离心步骤之后，将质粒干燥在流柜罩中，并向试管中加入无菌的70%乙醇。乙醇沉淀后，将质粒在流柜罩中干燥，并将质粒重悬于无菌蒸馏水中。注意使用灭菌的微量离心管。
   4. 取等分试样进行定量、限制性分析，并在需要时进行测序。建议检查倒置末端重复序列 （ITR） 的完整性，因为突变会对产量产生负面影响。将样品浓度调节至1μg/μL。
2. 10x 吐温裂解缓冲液的制备
   1. 将 30.3 g Tris 缓冲液和 2.033 g MgCl_{2.6H 2}O 溶于 400 mL 无菌蒸馏水中，将 pH 设置为 8.0，并将总体积增加到 450 mL。
   2. 保持吐温 20 无菌，将 50 mL 吐温 20 加入到罩中的缓冲溶液中，并使用 0.2 μM 真空过滤器过滤灭菌。
3. 碘克沙醇稀释液
   1. 以60%浓度提供碘克沙醇溶液。使用起始解决方案生成 15%、25% 和 40% 解决方案。
   2. 对于 15% 溶液，用 48 mL 5 M NaCl 和 48 mL PBS-MK（5x PBS 和 5 mM MgCl₂ 和 12.5 mM KCl）稀释 60 mL 60% 溶液，并加入蒸馏水至 240 mL。
   3. 对于 25% 溶液，稀释 67 mL 的 60% 溶液和 32 mL 的 PBS-MK。加入蒸馏水至 160 mL。充分混合并加入 1.6 mL 酚红溶液。
   4. 对于 40% 溶液，用 48 mL PBS-MK 稀释 160 mL 60% 溶液，并加入蒸馏水至 240 mL。对于 60% 溶液，将 1 mL 酚红加入 100 mL 60% 溶液中。
4. PBS 5%蔗糖溶液
   1. 将 25 g 蔗糖加入 500 mL 瓶不含钙或镁的 DPBS 中。摇匀并使用0.2μM瓶真空过滤器过滤。
5. 聚乙二醇 （PEG） 8000 溶液
   1. 将 400 g PEG 8000 和 24 g NaCl 溶解在无菌蒸馏水中，并调节至最终体积为 1000 mL。加热搅拌直至完全溶解。使用pH纸将pH调节至7.4。
   2. 使用0.2μM瓶真空过滤器过滤灭菌，以获得40%PEG 8000溶液。请注意，由于溶液储存在4°C的粘度，过滤将需要一段时间。

2. HEK293悬浮细胞的培养

1. 使用浸泡在70%乙醇中的湿巾进行清洁。清洁生物安全罩，准备和清洁培养细胞所需的所有材料。
2. 在 50 mL 锥形培养管中将 30 mL 悬浮细胞培养基预热至 37 °C。从液氮中回收病毒生产细胞。在37°C水浴中快速解冻细胞。在小瓶完全解冻之前，用浸泡在70%乙醇中的湿巾清洁它，然后将小瓶转移到生物安全罩中。
   注意：此处使用的病毒生产细胞的详细信息在 材料表中提供。
3. 将细胞快速转移到预热的 50 mL 锥形培养管中。在振荡培养箱中培养细胞，温度为37°C，80%湿度，8%CO₂，每分钟200转（RPM），振荡直径为50mm。传代细胞，一旦活力高于 90%，细胞密度高于 1-3 x 10⁶ 个细胞/mL。
   注意：使用的培养箱的振荡直径为 50 毫米;应针对不同的振荡直径调整培养条件。
4. 解冻后 3-4 天传代细胞。检查培养管，确保没有污染迹象;例如，真菌将显示为变色（黑色或绿色）环。
5. 使用 1 mL 条带制备每个样品 400 μL 0.4% 台盼蓝溶液。
6. 从培养箱中快速取出悬浮细胞。立即使用 1 mL 条带从试管中提取 500 μL。轻轻上下移液。
7. 将 100 μL 细胞悬液加入制备的台盼蓝管中。轻轻倒置试管混合;不要用移液混合，因为这会导致细胞死亡。将细胞送回培养箱。
8. 取 50 μL 台盼蓝处理的细胞悬液，并将其涂抹在血细胞计数器载玻片上。计数总活细胞，并计算第二天传代或转染所需的细胞悬液和培养基的量。
9. 在培养箱中加热介质10-15分钟。将细胞悬液加入加热的培养基中，然后返回培养箱。对于传代细胞 3 天（即周一至周四），设置为 0.5 x 10⁶ 个细胞/mL;对于传代细胞 4 天（即周四至周一），设置为 0.3 x 10⁶ 个细胞/mL。
   注意：根据制造商的说法，病毒生产细胞每 26 小时翻一番，传代前应在 3.5 x 10⁶ 和 5.5 x 10⁶ 之间。细胞最多可保存 20 次。

3. 转染

1. 第1天
   1. 转染前 24 小时，在 300 mL 培养基中培养 1 x 10 6^个细胞/ mL。
2. 第2天
   1. 将培养基、质粒和转染试剂加热至室温。有关准备的金额，请参见 表 1。
   2. 简要涡旋质粒和试剂。将质粒加入制备的培养基中，涡旋。加入转染试剂并短暂涡旋。在此步骤之后不要搅拌混合物。在室温下孵育 30 分钟。
   3. 同时，对第 1 天制备的细胞进行计数。细胞应介于 2 至 2.5 x 10 x 6^个细胞/ mL 之间，存活率> 95%。
   4. 孵育后，将转染混合物滴加到细胞中，同时轻轻旋转试管。孵育72-96小时。

4. 收获细胞

1. 第5天
   1. 加入 33 mL 10x 细胞裂解缓冲液（500 mM Tris pH 8,10% 吐温 20,20 mM MgCl₂），轻轻振荡混合，并在 37 °C 下振荡孵育 1.5 小时。
   2. 在4°C下以3428× g 离心60分钟。通过0.45μM PES真空过滤器过滤以澄清细胞裂解物，将澄清的裂解物留在过滤器的容器中。
      注意：过滤后可选：取 50 μL 样品进行定量 PCR （Q-PCR）。
   3. 将 90 mL 40% PEG 8000 溶液加入 360 mL 过滤的细胞裂解物中。
   4. 用70%乙醇清洁搅拌棒并加入样品中。在冰上或在冷藏室中以300RPM搅拌1小时。在4°C下孵育，无需搅拌过夜。
      注意：已经测试了1小时至72小时的孵育时间。孵育时间越长，对总蛋白沉淀量有负面影响。

5. 碘克沙醇纯化

1. 第6天
   1. 将整个PEG沉淀培养体积样品转移到干净的大锥形管中，并以2820× g 和4°C离心15分钟。
   2. 弃去上清液，将PEG沉淀重悬于15mL含有钙和镁的DPBS中。颗粒难以复苏;花点时间仔细做这件事。
   3. 将重悬部分转移到干净的 50 mL 试管中。PEG将保留在生物反应器管的侧面。额外添加 10 mL，注意收集所有 PEG 沉淀物。全部转移到 50 mL 容器中，总体积为 25-30 mL。
   4. 加入 40 μL DNaseI （10 U/μL）。置于培养箱中1小时37°C。
      注意：DNase孵育后可选：取50μL样品进行Q-PCR。
   5. 用氯化物溶液和70%乙醇充分用于PEG沉淀的清洁搅拌棒。将搅拌棒留在70%乙醇中进行下一个实验。
   6. 使用玻璃巴斯德移液管在25 mm x 89 mm聚异构体管中填充每个管中的15.5 mL浓缩细胞裂解物。加入细胞裂解物后，将玻璃巴斯德移液管换成新的移液管。
   7. 加入 15%-60% 的碘克沙醇溶液：将 9 mL 的 15% 碘克沙醇溶液轻轻注入细胞裂解物下方。接下来，加入 5 mL 的 25% 和 40% 碘克沙醇溶液，最后加入 5 mL 的 60% 碘克沙醇溶液。
   8. 使用带有 DPBS +/+ 的注射器将管子加满以去除大部分气泡，注意不要干扰碘克沙醇层。使用电气管顶密封管。
   9. 在超速离心机中以490,000× g 在16°C的非摆动转子中离心1小时10分钟。从超速离心机中取出，将管组装在金属扣中，并准备收集管。打开引擎盖中的转子，以防在旋转过程中溢出。
   10. 准备一个 50 mL 管（用于丢弃转子管）、一个 15 mL 管（用于收集病毒）、一个 5 mL 注射器以及每个梯度的 30G 和 19G 针头。
   11. 用 30G 针头在管子顶部刺一个孔。将针头留在原位。将 19G 针头放在注射器上。
   12. 小心地刺穿 40%/60% 接口下方的管子，酚红指示器可以看到。确保针斜面朝向 40% 层。
   13. 用非惯用手从管顶部取下 30G 针头。将针头斜面朝上，慢慢提取病毒/碘克沙醇。目标是提取 3 mL 至 4.5 mL。大约一半并进入 40%/透明层，旋转针头使斜面朝下并继续提取以避免从蛋白质层收集。
   14. 用非惯用手准备 50 mL 管，小心地拔出针头，同时将管放入 50 mL 管中并丢弃。通过填充最多 15 mL，在 DPBS 中稀释 AAV/碘克沙醇悬浮液 5 倍。
   15. 转移到离心过滤管中，并以3428× g，4°C离心10分钟。丢弃流通;轻轻取下过滤器的支架，然后将底部容器倒入废液瓶中。加入 15 mL PBS-5% 蔗糖滤液并重悬。
   16. 在4°C下以3428× g 离心20分钟。重复缓冲液更换至少 3 次。将病毒（~150-250μL）储存在4°C（PHP.B变体最多3个月）或等分试样等分到50μL等分试样中，并在-80°C下长期储存。
       注意：PHP。B衣壳变体对冻融敏感，因此应避免这种情况。
   17. 按照先前方案¹⁰ 中所述进行滴定。

结果

大多数学术实验室使用贴壁HEK293T细胞来生产 AAV ^8,9。虽然当直接注射需要少量 AAV 时，这相对有效，但需要高出 100 倍的滴度（至少 1 x 10¹¹ GC/小鼠）才能实现与全身衣壳（如 AAV）类似的转导。PHP.eB的。

在该方案中，使用在锥形管中培养的悬浮HEK293细胞建立AAV的生产。可以在 50 mL 试管中进行小规模培养，也可以在 600 mL 试管?...

讨论

AAV的全身给药是基因转移到中枢神经系统的有力工具;然而，AAV的生产是一个昂贵而费力的过程。通过使用悬浮细胞，与在 15 cm² 板上贴壁培养HEK293T相比，减少了劳动力和塑料。此外，这里采用的锥形管易于操作，并最大限度地利用了实验室空间。该协议由两名研究人员制定，随后由实验室中的其他人应用。三位独立研究人员的一系列生产平均每批产生足够的载体来注射6-7只小鼠。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm - 50Pk	Beckman Coulter	342414
Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4x1000,	eppendorf	5920701002
Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml	Infors HT/ TPP	587633
Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets	eppendorf	5820747005
Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes	eppendorf	5948000315
Distilled Water	Gibco	15230147
DNase I recombinant, RNase-free	Roche	4716728001
DNase I recombinant, RNase-free	Roche	4716728001
DPBS, calcium, magnesium	Gibco	14040091
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2	Fisher	FB12566504
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45	Fisher	FB12566505
Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube	Infors HT/ TPP	31362
Holder for 600 ml cell culture tube	Infors HT/ TPP	66129
Incubator Minitron 50 mm	Infors HT	500043
LV-MAX Production Medium	Gibco	A3583401
N-Tray Universal	Infors HT/ TPP	31321
OptiPrep - Iodixanol	Serumwerk bernburg	1893
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)	Poly-sciences	24765-100
Phenol red solution	Sigma-Aldrich	72420100
Poly(ethylene glycol) 8000	Sigma-Aldrich	89510
TransIT-VirusGEN	Mirus	Mir 6706
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	5250061
TubeSpin Bioreactors-50ml	TTP	87050
TubeSpin Bioreactors-600ml	TTP	87600
Viral Production Cells	Gibco	A35347
Vivaspin 20 MWCO 100 000	Cytvia	28932363