Produzione di lotti vettoriali adeno-associati ad alto rendimento utilizzando celle di sospensione HEK293

Riepilogo

Qui, viene presentato un protocollo di produzione AAV basato su celle HEK293 in sospensione, con conseguente riduzione del tempo e della manodopera necessari per la produzione di vettori utilizzando componenti disponibili per scopi di ricerca da fornitori commerciali.

Abstract

I vettori virali adeno-associati (AAV) sono uno strumento straordinario per lo studio del sistema nervoso centrale (SNC). Capsidi innovativi, come l'AAV. PHP.eB, dimostrano un'ampia trasduzione del SNC mediante iniezione endovenosa nei topi. Per ottenere una trasduzione comparabile, è necessario un titolo 100 volte superiore (almeno 1 x 10¹¹ copie del genoma/topo) rispetto all'iniezione diretta nel parenchima del SNC. Nel nostro gruppo, la produzione di AAV, tra cui AAV. PHP.eB si basa su cellule HEK293T aderenti e sul metodo della tripla trasfezione. Ottenere rese elevate di AAV con cellule aderenti comporta un processo ad alta intensità di manodopera e materiale. Questo vincolo ha portato allo sviluppo di un protocollo per la coltura cellulare in sospensione in provette coniche. Gli AAV generati nelle cellule aderenti sono stati confrontati con il metodo di produzione della sospensione. Sono state confrontate colture in sospensione utilizzando reagenti di trasfezione polietilenimmina o TransIt. I vettori AAV sono stati purificati mediante ultracentrifugazione a gradiente di iodixanolo seguita da scambio di tamponi e concentrazione utilizzando un filtro centrifugo. Con il metodo aderente, abbiamo ottenuto una media di 2,6 x 10¹² copie del genoma (GC) totali, mentre il metodo della sospensione e la polietilenimmina hanno prodotto 7,7 x 10¹² GC in totale e TransIt ha prodotto 2,4 x 10¹³ GC in totale. Non vi è alcuna differenza nell'efficienza di trasduzione in vivo tra i vettori prodotti con aderente rispetto al sistema di celle in sospensione. In sintesi, viene introdotto un protocollo di produzione AAV basato su celle HEK293 in sospensione, che consente di ridurre il tempo e la manodopera necessari per la produzione di vettori e di ottenere rendimenti da 3 a 9 volte superiori utilizzando componenti disponibili presso i fornitori commerciali per scopi di ricerca.

Introduzione

Il virus adeno-associato (AAV) è stato scoperto nel 1965 e da allora è stato utilizzato in una miriade di applicazioni¹. Gli AAV sono stati applicati nella ricerca neuroscientifica per studiare la funzione genica e neuronale, mappare i neurocircuiti o produrre modelli animali per la malattia². Tradizionalmente, questo viene fatto iniettando direttamente nel sito di interesse, poiché la maggior parte dei sierotipi naturali non attraversa la barriera emato-encefalica o ha bisogno di una dose elevata per farlo ^1,2,3.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Accademia Reale Olandese delle Scienze (KNAW) ed erano conformi alla legge olandese sulla sperimentazione animale con il numero di progetto AVD8010020199126. Nella Figura 1 viene fornita una panoramica schematica del protocollo completo. Dalla semina delle cellule alla purificazione dell'AAV, il protocollo richiede 6 giorni per essere completato.

1. Preparazione dei reagenti

1. Purificazione dei plasmidi
   1. Eseguire l'estrazione dei plasmidi come descritto dal produt....

Discussione

La somministrazione sistemica di AAV è un potente strumento per il trasferimento genico al sistema nervoso centrale; tuttavia, la produzione di AAV è un processo costoso e laborioso. Utilizzando le cellule in sospensione, la manodopera e la plastica sono ridotte rispetto alla coltura aderente di HEK293T su piastre da 15 cm² . Inoltre, i tubi conici qui implementati sono facili da maneggiare e massimizzano l'uso dello spazio del laboratorio. Il protocollo è stato messo a punto da due ricercatori e successiva.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm - 50Pk	Beckman Coulter	342414
Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4x1000,	eppendorf	5920701002
Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml	Infors HT/ TPP	587633
Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets	eppendorf	5820747005
Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes	eppendorf	5948000315
Distilled Water	Gibco	15230147
DNase I recombinant, RNase-free	Roche	4716728001
DNase I recombinant, RNase-free	Roche	4716728001
DPBS, calcium, magnesium	Gibco	14040091
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2	Fisher	FB12566504
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45	Fisher	FB12566505
Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube	Infors HT/ TPP	31362
Holder for 600 ml cell culture tube	Infors HT/ TPP	66129
Incubator Minitron 50 mm	Infors HT	500043
LV-MAX Production Medium	Gibco	A3583401
N-Tray Universal	Infors HT/ TPP	31321
OptiPrep - Iodixanol	Serumwerk bernburg	1893
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)	Poly-sciences	24765-100
Phenol red solution	Sigma-Aldrich	72420100
Poly(ethylene glycol) 8000	Sigma-Aldrich	89510
TransIT-VirusGEN	Mirus	Mir 6706
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	5250061
TubeSpin Bioreactors-50ml	TTP	87050
TubeSpin Bioreactors-600ml	TTP	87600
Viral Production Cells	Gibco	A35347
Vivaspin 20 MWCO 100 000	Cytvia	28932363