JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

توضح هذه المقالة بروتوكولا لدراسة تفاعلات الحمض النووي والبروتين باستخدام نظام قياس تداخل الطبقة الحيوية (BLI) القائم على الستربتافيدين. يحدد الخطوات والاعتبارات الأساسية لاستخدام حركية الربط الأساسية أو المتقدمة لتحديد تقارب ربط التوازن (KD) للتفاعل.

Abstract

تدعم تفاعلات البروتين والحمض النووي العمليات الخلوية الأساسية. يعد فهم هذه التفاعلات أمرا بالغ الأهمية لتوضيح الآليات الجزيئية للمسارات المختلفة. يمكن أن تؤثر العوامل الرئيسية مثل بنية جزيء الحمض النووي وتسلسله وطوله بشكل كبير على ارتباط البروتين. قياس تداخل الطبقة الحيوية (BLI) هو تقنية خالية من الملصقات تقيس حركية الربط بين الجزيئات ، وتقدم نهجا مباشرا ودقيقا لدراسة تفاعلات البروتين والحمض النووي كميا. تتمثل إحدى المزايا الرئيسية ل BLI على الطرق التقليدية القائمة على الهلام في قدرتها على توفير بيانات في الوقت الفعلي حول حركية الربط ، مما يتيح قياسا دقيقا لثابت تفكك التوازن (KD) للتفاعلات الديناميكية بين البروتين والحمض النووي. تقدم هذه المقالة بروتوكولا أساسيا لتحديد قيمةKD للتفاعل بين بروتين تكرار الحمض النووي وبروتين النسخ المتماثل A (RPA) وركيزة الحمض النووي أحادي الشريطة (ssDNA). يربط RPA ssDNA بتقارب عال ولكن يجب أيضا إزاحته بسهولة لتسهيل تفاعلات البروتين اللاحقة داخل المسارات البيولوجية. في مقايسة BLI الموصوفة ، يتم تثبيت ssDNA الحيوي على جهاز استشعار حيوي مطلي بالستربتافيدين. ثم يتم قياس حركية الربط (الارتباط والتفكك) ل RPA بالحمض النووي المرتبط بالمستشعر الحيوي. يتم تحليل البيانات الناتجة لاشتقاق قيم دقيقة لثابت معدل الارتباط (ka) ، وثابت معدل التفكك (kd) ، وثابت ربط التوازن (KD) باستخدام برنامج النظام.

Introduction

تلعب البروتينات الخلوية دورا محوريا في تنظيم العمليات البيولوجية المعقدة التي تحدث داخل الكائنات الحية. يعتمد الأداء الأمثل لهذه المسارات على التفاعل بين البروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى داخل الخلية ، بما في ذلك التفاعلات مع البروتينات الشريكة والأحماض النووية1. وبالتالي ، فإن فهم تعقيدات العمليات الخلوية يتطلب فهما عميقا لديناميكيات تفاعلات البروتين والحمض النووي.

تقليديا ، تمت دراسة تفاعلات البروتين والحمض النووي باستخدام فحوصات إزاحة هلام الحركة الكهربية (EMSAs)2. في هذا الاختبار ، يتم تحضين البروتينات باستخدام قليل النوكليوتيدات الاصطناعية (إما الحمض النووي / الحمض النووي الريبي ، الذي يحتوي على أطوال أو تسلسلات محددة) لفترة قصيرة ، ثم يتم تشغيل التفاعل كهربائيا على هلام بولي أكريلاميد أصلي (PAGE)3،4،5. لتمكين تصور تفاعل البروتين قليل النوكليوتيدات ، عادة ما يتم تصنيف قليل النوكليوتيدات بشكل إشعاعي ب 32P أو تمييزها بجزيئات الفلورسنت. إذا تفاعل البروتين وربطه قليل النوكليوتيد ، فإن ارتباط البروتين يبطئ حركة الحمض النووي داخل الجل6،7. وبالتالي ، تسمى هذه الطريقة أيضا بتحول الهلام أو مقايسة التخلف الهلامي. على الرغم من استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع ، إلا أن هناك بعض القيود التي يجب مراعاتها أثناء استخدام هذه الطريقة للحصول على قيمKD ، بما في ذلك الدقة المنخفضة من الارتباط الضعيف أو الديناميكي ، ومتطلبات تركيز مرتفع بشكل كبير من البروتينات ، والمزيد من الجهد. بالإضافة إلى ذلك ، فإن EMSA ليست فحوصات في الوقت الفعلي ، وبالتالي ، لا يمكنها قياس حركية الربطبدقة 7،8.

ظهرت تقنيات مبتكرة مثل رنين البلازمون السطحي (SPR) وقياس تداخل الطبقة الحيوية (BLI) للتغلب على هذه القيود9،10،11،12. تقيس كلتا الطريقتين ثوابت معدل الارتباط / التفكك وثوابت التقارب بين الجزيئات بطريقة خالية من الملصقات. نظرا لأن البروتين غير مطلوب ليتم تمييزه ، فإن هذه التقنيات تقضي على خطر تغيير خصائص البروتين أو سد موقع الارتباط. في SPR ، يتفاعل الضوء المستقطب مع جهاز استشعار (فيلم موصل للمعادن ، عادة من الذهب) ، مما يولد موجة كثافة شحنة إلكترون تسمى البلازمون. يقلل هذا التفاعل من شدة الحزمة المنعكسة ويقيس الكاشف التغيير في الزاوية المحددة ، والمعروفة باسم زاوية الرنين13. لدراسة تفاعلات الترابط (الحمض النووي) - التحليل (البروتين) ، يتم تثبيت الترابط في خلية تدفق واحدة على شريحة المستشعر ، ويتم حقن المادة التحليلية في خلية التدفق التي تحتوي على الترابط الثابت عند ربط المادة التحليلية بالترابط ، هناك تغيير يمكن اكتشافه في معامل الانكسار بالقرب من سطح المستشعر ، مما يسمح بقياس التفاعلات الجزيئية14،15،16.

يقيس قياس تداخل الطبقة الحيوية (BLI) نمط تداخل الضوء عندما يمر الضوء عبر ألياف ضوئية ذات طبقة حيوية ، تتكون من ترابط (طعم) وشريكه المرتبط (التحليل) ، في السطح السفلي لطرف المستشعر الحيوي. ينتقل الضوء عبر الطرف وينعكس على طرفي الطبقة الحيوية بسبب خصائص الطبقة الحيوية. يتناسب سمك الطبقة الحيوية مع عدد الجزيئات المرتبطة التي تؤثر على نمط الضوء المنعكس. من خلال مقارنة تغير منحنى الشدة النسبية مقابل يمكن تحديد الطول الموجي الناجم عن التداخل بين الضوء المنعكس من الواجهة المرجعية ومن واجهة الطبقة الحيوية / العازلة ، وتغيير سمك الطبقة الحيوية. عندما يرتبط المزيد من الجزيئات ، يحدث تحول أكبر ، مما يجعل BLI أداة قوية لدراسة التفاعلات الجزيئية الحيوية في الوقت الفعلي. يتم قياس التغيير في مخطط التداخل وتمثيله على مخطط الاستشعار كإزاحة طيفية17،18 (الشكل 1 أ). يمكن تحديد طبيعة تفاعل الربط بدقة باستخدام عناصر التحكم المناسبة ، مثل الإعداد الذي يفتقر إلى التركيزات المتغيرة للترابط لشريكالربط 19،20،21. بالمقارنة مع SPR ، فإن BLI فعالة من حيث التكلفة وسهلة الاستخدام ، مما يجعلها في متناول مجموعة واسعة من الباحثين. بالإضافة إلى ذلك ، تظل العينات المستخدمة في BLI سليمة إذا لم يكن هناك تحلل أو تجميع. هذا يسمح باستعادتها وإعادة استخدامها ، وبالتالي تقليل النفايات. تعمل أداة BLI بدون استخدام الموائع الدقيقة ، وبالتالي القضاء على عيوب نظام الموائع ، مثل الحاجة إلى الصيانة / الرعاية أو الانسداد أو استخدام المخازن المؤقتة المنزوعة من الغاز. كما أنه يقلل من مخاطر تلويث الجهاز بسبب عينات البروتين غير المفلترة أو الخام.

في تجربة BLI ، يتم إنشاء الطبقة الحيوية عن طريق تثبيت جزيء الطعم على المستشعر الحيوي. يمكن أن تتفاعل الطبقة الحيوية لأجهزة الاستشعار الحيوية مع علامات مختلفة ، مما يجعل من الممكن دراسة التفاعلات بين الجزيئات (بما في ذلك الأحماض النووية والبروتينات والأجسام المضادة والفيروسات والجزيئات الصغيرة وما إلى ذلك)22. يمكن استخدام استراتيجيات التقاط مختلفة ، بما في ذلك البيوتين / الستربتافيدين ، و 6X-His-tag / Ni-NTA ، و FLAG / anti-FLAG ، و GST / anti-GST ، والأجسام المضادة / المضادة ل FC ، لإنشاء هذا الشلل. يعد الحفاظ على بنية ونشاط الترابط الثابت أمرا بالغ الأهمية عند اختيار المستشعر الحيوي. تتأثر التغييرات في نمط التداخل بكمية الجزيء المرتبط وكذلك المصفوفة23. تتم دراسة تفاعلات البروتين والحمض النووي باستخدام مجسات قليل النوكليوتيدات الحيوية التي يمكن تثبيتها على أجهزة الاستشعار الحيوية المطلية بالستربتافيدين. عينات البروتين التي من المتوقع أن تتفاعل مع الطعم الثابت (قليل النوكليوتيدات) على اتصال مع قليل النوكليوتيدات لفترة محددة في مخزن مؤقت ملزم لقياس الارتباط ثم تتحول لاحقا إلى مخزن مؤقت فارغ لقياس التفكك. يظهر تمثيل تخطيطي لربط التحليلات والتغيرات المقابلة في منحنى الربط في الشكل 1 ب. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا دراسة تفاعلات البروتين والنوى من خلال مسار تجميد معكوس ، حيث يتم التقاط البروتين (الطعم) على المستشعر الحيوي ويتفاعل مع الحمض النووي (التحليل).

حاليا ، تتوفر أدوات متعددة تجاريا تعمل على مبدأ قياس تداخل الطبقة الحيوية. تعرف الأداة المباشرة والفعالة من حيث التكلفة باسم نظام Octet N1 ، والذي يتميز بقناة واحدة لنقل البيانات. يتطلب التشغيل اليدوي ، ويستهلك الحد الأدنى من حجم العينة (4 ميكرولتر) ، ويقوم بتحليل العينة في درجات الحرارة المحيطة9،23. يمكن لهذه الأداة أحادية القناة اكتشاف كفاءات الارتباط للبروتينات الأكبر من 10 كيلو دالتون وتقيس الصلات في نطاق الميكرومولار (ميكرومتر) إلى النانومولار (نانومتر)11،12. تتوفر أيضا بعض الأدوات التي تحتوي على 2 و 8 و 16 و 96 قناة للقراءة الآلية للبيانات ومتوافقة مع كل من تنسيقات البئر 96 أو 38419،20. يمكن أن تعمل بعض هذه الأدوات أيضا بين 4 درجات مئوية إلى 40 درجة مئوية ، واكتشاف الجزيئات الحيوية ذات الوزن الجزيئي المنخفض يصل إلى 150 Da ، وقياس الصلات داخل المليمولار إلى النطاق البيكومولار19،21. في حين أن النظام الموصوف فعال من حيث التكلفة ، فإن الأدوات الأغلى ثمنا ذات القنوات المتعددة توفر معالجة تلقائية عالية الإنتاجية. تستخدم هذه الأنظمة المتقدمة بشكل شائع في توصيف وتطوير جزيئات الدواءالبيولوجية 9،23.

يصف البروتوكول الحالي الخطوات المتبعة في قياس معلمات ربط بروتين النسخ المتماثل A (RPA) بالحمض النووي أحادي الشريطة (ss-DNA) باستخدام نظام قياس تداخل الطبقة الحيوية اليدوي أحادي القناة. RPA هو مركب بروتين غير متجانس مرتبط ب ssDNA يلعب دورا مهما في جميع جوانب استقلاب الحمض النووي تقريبا ، بما في ذلك تكرار الحمض النووي وإصلاحه وإعادةتركيبه 24. نظرا لتقاربه العالي مع ssDNA (الذي يقاس ليكون في النطاق النانوي النانوي) ، يمكنه الارتباط بسرعة ب ssDNA المتولد أثناء معاملات الحمض النووي المختلفة ، وحمايته من التحلل النووي ، ومنع الارتباط المرتجل للبروتينات النهائية الأخرى. يلعب RPA أيضا دورا مهما في منع تكوين الهياكل الثانوية والثالثية غير القانونية ، مثل G-quadruplexes25. يتكون RPA البشري من ثلاث وحدات فرعية: RPA70 (70 كيلو دالتون) و RPA32 (32 كيلو دالتون) و RPA14 (14 كيلو دالتون) ، وتسمى أيضا RPA 1 و RPA 2 و RPA 3 ، على التوالي24،26،27. تحتوي هذه الوحدات الفرعية على ستة طيات ربط قليلة النوكليوتيدات / قليل السكاريد (طيات OB) المسماة من A إلى F. من بين هذه المجالات ، توجد مجالات ربط الحمض النووي (DBDs) على الوحدات الفرعية RPA1 (DBD-A ، DBD-B ، DBD-C) و RPA2 (DBD-D)28. كان يعتقد في البداية أنه اعتمادا على طول الحمض النووي ، تعرض RPA أوضاع ربط مختلفة حيث تم إشراك DBDs المختلفة بأطوال محددة من الحمضالنووي 29. ساعدت البيانات من الدراسات الهيكلية والجزيئية الحديثة في تحسين هذه النماذج لتشير إلى أن ارتباط DBDs المختلفة ل RPA أكثر ديناميكية مما اقترحفي البداية 30،31،32،33،34،35،36. هذه الميزة لخاصية الربط الديناميكي ضرورية لوظيفة RPA لأن RPA يجب أن تكون قادرة على الارتباط بإحكام بركيزة الحمض النووي أثناء معاملات معينة من الحمض النووي ؛ ومع ذلك ، يجب أن يكون قادرا أيضا على النزوح من الركيزة لتسليم الركيزة إلى البروتين التالي أثناء العملية البيولوجية. باستخدام تقنيات كيميائية حيوية مختلفة ، تم تحديدKD ل RPA ليكون حوالي 0.4 نانومتر للركيزة ss-(polydT) 30 ، و 80 نانومتر و 200 نانومتر لركائز ss-(polydA) 257 و dG- (polydG) 602 على التوالي ، كما تم قياسها بواسطة تباين الاستقطاب الفلوري (FPA) 37،38. يظهر RPA أيضا تفضيلا أعلى بمقدار 50 ضعفا للارتباط بالتسلسلات الغنية بالبيريميدين مقارنة بالبيورينات. على الرغم من أن التقنيات الكيميائية الحيوية المختلفة قد حددت قياسات KD المختلفة ل RPA ، إلا أن جميع القياسات كانت في نطاق nanomolar ، مما يشير إلى تقارب RPA العالي للارتباط ب ssDNA. باستخدام الفحص المجهري الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي (TIRFM) ، تم اكتشاف أنه بناء على طول الحمض النووي ، يرتبط RPA بوضعين على الأقل للربط: أحدهما تم تعريفه عند التفكك السريع(KD ، 680 pM) ومركب التفكك البطيء (Kd ، 60 pM)33،39. نظرا لمشاركتها المحورية في جميع مسارات التمثيل الغذائي للحمض النووي تقريبا ، كان هناك اهتمام كبير بإنشاء مثبطات يمكن أن تعيق التفاعل بين RPA والحمض النووي أحادي الشريطة (ssDNA). هذه المثبطات الكيميائية حيوية في تعطيل استجابة تلف الحمض النووي ، مما يجعل الخلايا السرطانية أكثر عرضة للعوامل الضارة بالحمض النووي المستخدمة في العلاجات السريرية. يسمح استخدام اختبار BLI بإجراء تقييم كمي دقيق لفعالية المثبط في تعديل وظيفة ربط RPA40،41.

يسمح إعداد BLI بإعدادات مميزة: الحركية الأساسية والمتقدمة. في وضع الحركية الأساسي ، يتكون الاختبار من ثلاث مراحل أساسية: إنشاء خط الأساس ، والارتباط ، والتفكك. ومع ذلك ، قبل إجراء هذا الاختبار ، يجب طلاء المستشعرات الحيوية بشكل منفصل ، إما باستخدام الجهاز أو يدويا على مقعد المختبر. على العكس من ذلك ، يمتد وضع الحركية المتقدم إلى ما هو أبعد من الخطوات الثلاث الأساسية ، مما يسمح بدمج خطوات إضافية. يمكن أن تخدم هذه الخطوات التكميلية أغراضا مختلفة ، مثل تكييف المستشعر الحيوي لتعديلات المخزن المؤقت أو تسهيل اكتشاف تفاعلات البروتين اللاحقة. تسمح الحركية المتقدمة أيضا بتجريد المستشعر الحيوي من المادة المراد تحليلها بطريقة تجديد جيدة لإعادة الاستخدام المحتمل ، بشرط أن يظل الطعم والمستشعر الحيوي سليمين. بشكل عام ، يتم استخدام الحركية المتقدمة على الحركية الأساسية عندما تشارك خطوات متعددة في الفحص ، أو يجب إجراء الفحص بتنسيق أكثر تعقيدا.

يحدد هذا البروتوكول كلتا الطريقتين باستخدام نفس الطعم [3'Bio-ss-poly (dT) 32] والتحليل (RPA). سيتم استخدام جهاز استشعار حيوي مطلي بالستربتافيدين لتثبيت الطعم ، وسيتم الحصول على قياساتKD للمادة التحليلية. يصف هذا البروتوكول نهجا كاملا لإجراء اختبار BLI باستخدام قياس تداخل الطبقة الحيوية للأداة أحادية القناة ، والذي يغطي إعداد طعم المستشعر الحيوي ، واعتبارات المخزن المؤقت ، ومخطط تفصيلي خطوة بخطوة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير الطعم ، التحليل ، المخازن المؤقتة وتنظيف حامل السقوط

  1. إعداد الجهاز: قم بتشغيل الجهاز قبل ساعة واحدة على الأقل من بدء التجربة. سيسمح ذلك للمصباح بالإحماء.
  2. تحضير المخازن المؤقتة للتجريد والتنظيف
    1. المخزن المؤقت للتجريد: تحضير 50 مل من 0.15 م من حمض الفوسفوريك [درجة الحموضة 2.0]).
    2. مخزن التنظيف: قم بإعداد 10 مل من 0.5 نيوتن حمض الهيدروكلوريك.
  3. تحضير المخزن المؤقت BLI
    1. قم بإعداد 50 مل من 1x BLI buffer (50 ملي مولار Tris pH 7.5 ، 1 ملي EDTA ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.1 مجم / مل BSA ، 1 ملي DTT ، 0.05٪ توين 20). قم بتخزين هذا المخزن المؤقت عند 4 درجات مئوية. قبل إعداد هذا الاختبار ، قم بإحضار المخزن المؤقت إلى درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يوصى بشدة بإعداد مخازن مؤقتة جديدة للفحص ، حيث قد تخضع المحاليل المؤقتة القديمة لتغييرات في الأس الهيدروجيني أو تكوين الركام وقد يكون لها تلوث جرثومي ، مما قد يضر بقابلية التكرار ودقة النتائج. لا ينصح باستخدام المخازن المؤقتة التي تم تخزينها لأكثر من أسبوعين.
  4. تحضير الطعم / الركيزة
    1. قم بإعداد 12.5 نانومتر من الركيزة 3'Bio-ss-poly (dT) 32 (5 'TTT TTT TTT TTT 3'Bio) باستخدام المخزن المؤقت BLI.
  5. تحضير مخزون تركيز البروتين
    1. تحضير أربعة تركيزات من RPA (5 نانومتر، 10 نانومتر، 20 نانومتر، 40 نانومتر) باستخدام المخزن المؤقت لصحة الجسمين الشبكي. يتم الحصول على أعلى تركيز للبروتين (40 نانومتر) عن طريق تخفيف بروتين المخزون في المخزن المؤقت ل BLI. يتم تحضير التخفيفات اللاحقة عن طريق التخفيف التسلسلي لمحلول العمل 40 نانومتر. تأكد من الاحتفاظ بجميع مخزونات البروتين على الجليد طوال التجربة للحفاظ على الاستقرار.
  6. تنظيف حامل السقوط
    1. أضف 4 ميكرولتر من الماء المقطر ونظف حامل القطرات بمنديل خال من النسالة (كرر 3 مرات). بعد ذلك ، كرر هذه الخطوة باستخدام 4 ميكرولتر من 70٪ من الإيثانول ونظفها بمنديل خال من النسالة. تضمن هذه الخطوة إزالة الملوثات السطحية وجزيئات الغبار.
    2. أضف 4 ميكرولتر من 0.5 نيوتن حمض الهيدروكلوريك واتركه في حامل الإسقاط لمدة 1 دقيقة. نظفه بمنديل خال من النسالة وكرر هذه الخطوة مرة أخرى. هذا يضمن التنظيف العميق لحامل القطرات. التنظيف العميق مفيد بشكل خاص لتنظيف حامل القطرات الجافة من الاستخدام السابق.
    3. 1كرر الخطوة 1 لغسل حامل القطرات بالماء المقطر و 70٪ من الإيثانول وامسحه حتى يجف بمنديل خال من النسالة. حامل الإسقاط جاهز الآن للاستخدام.

2. الحركية الأساسية

  1. إعداد الأداة والبرنامج
    1. افتح البرنامج وحدد Basic Kinetics على اللوحة اليسرى (الشكل التكميلي 1).
    2. قم بإزالة رف المستشعرات الحيوية من الدرج (الذي تم الحصول عليه من مصادر تجارية) وضع لوحا سعة 96 بئرا في الدرج. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت BLI إلى البئر الأول. بعد ذلك ، ضع صينية المستشعرات الحيوية مرة أخرى أعلى اللوحة المكونة من 96 بئرا ، مع التأكد من إدخال كل مستشعر حيوي في البئر المقابل له. يجب الآن غمر المستشعر الحيوي الأول في مخزن BLI في البئر الأول.
    3. في البرنامج ، انقر فوق Hydrate وقم بتشغيل المؤقت لمدة 10 دقائق ، مما يسمح للمستشعر الحيوي الفردي بالترطيب لمدة 10 دقائق على الأقل. تعمل الخطوة على ترطيب المستشعر الحيوي لجعله جاهزا لفحص BLI.
    4. أثناء ترطيب المستشعر الحيوي ، يتم وضع الماصة 250 ميكرولتر من BLI في أنبوبين سعة 0.5 مل. قم بتسمية أحدهما بأنه "A" (ارتباط) والآخر باسم "D" (الانفصال).
    5. املأ التفاصيل الموجودة على البرنامج (الاسم: طلاء الركيزة ووصف الفحص: RPA- 3'Bio-ss-poly (dT) 32: الحركية الأساسية).
    6. اضبط إعداد التشغيل لكل خطوة: خط الأساس (30 ثانية)، الاقتران (120 ثانية)، التفكك (120 ثانية) (الجدول 1). احتفظ بشاكر الأنبوب وحامل الإسقاط. يتم ضبط سرعة شاكر على 2200 دورة في الدقيقة (المدى ، 1000-2600 دورة في الدقيقة) ، مما يمنع تأثيرات النقل الجماعي الناجمة عن الانتشار المحدود بالقرب من سطح المستشعر الحيوي.
      ملاحظة: يوصى بتحسين المدة لكل خطوة (خط الأساس، التحميل، الارتباط، الفصل) عند إعداد مقايسة حركية ملزمة لتحسين الحصول على البيانات.
  2. إنشاء منحنى خط الأساس
    1. ضع الأنبوب A في حامل الأنبوب وقم بتوصيل المستشعر الحيوي المائي بنظام BLI. حرك حامل الأنبوب أسفل المستشعر الحيوي (الموضع أ ، الشكل 2).
      ملاحظة: يجب عدم تجفيف المستشعرات الحيوية تماما في أي وقت أثناء التجربة. إذا تركت لتجف ، يمكن أن تكون قراءات التجربة منحرفة بشكل كبير.
    2. اضغط على تشغيل واتبع التعليمات الواردة في رسالة المطالبة.
    3. بعد الانتهاء من خط الأساس الأولي ، افتح الغطاء وأضف 4 ميكرولتر من المخزن المؤقت BLI إلى حامل الإسقاط. حركه إلى اليمين أسفل نفس المستشعر الحيوي (الموضع B ، الشكل 2). أغلق الغطاء وراقب منحنى BLI على البرنامج (الشكل 3 ، المنحنى الأزرق).
    4. بعد الانتهاء ، افتح الغطاء لاستبدال الأنبوب "A" ب "D" وحركه أسفل المستشعر الحيوي (الموضع A ، الشكل 2). أغلق الغطاء واستمر في خطوة التفكك. بعد الانتهاء، افتح الغطاء وافصل المستشعر الحيوي وضعه مرة أخرى في الدرج وتأكد من غمس المستشعر الحيوي في المخزن المؤقت LI.
    5. قم بإزالة العينة / المخزن المؤقت ، وتنظيف حامل القطرة بمحلول مؤقت قبل تجفيفه بمناديل خالية من النسالة ، وقم بإزالة الأنبوب "D" من حامل الأنبوب.
  3. طلاء الركيزة
    1. ضع الأنبوب A في حامل الأنبوب وقم بتوصيل المستشعر الحيوي المائي بنظام BLI. حرك حامل الأنبوب أسفل المستشعر الحيوي واضغط على تشغيل.
    2. بعد خطوة خط الأساس الأولي ، أضف 4 ميكرولتر من الركيزة 12.5 نانومتر [3'Bio-ss-poly (dT) 32] إلى حامل الإسقاط وحركها أسفل المستشعر الحيوي. أغلق الغطاء وراقب منحنى BLI على البرنامج. تأكد من أن هذه الاستجابة أعلى من خط الأساس (الشكل 3).
      ملاحظة: يمكن تحسين تركيز الركيزة عن طريق طلاء أجهزة الاستشعار الحيوية بتركيزات مختلفة (تركيز واحد فقط لكل مستشعر حيوي) ومراقبة منحنيات الربط. يكفي منحنى الربط بإشارة أعلى بشكل واضح مقارنة بخط الأساس لتأكيد طلاء الركيزة. قد يؤدي التحميل الزائد على المستشعر الحيوي إلى عائق أو ازدحام على السطح. يوضح الشكل 3منحنيات خمسة تركيزات من الركيزة 3'Bio-ss-poly (dT) 32 الحيوية. بالإضافة إلى ذلك ، بعد اكتمال خطوة تحميل الطعم ، يمكن غمس المستشعرات الحيوية في مخزن مؤقت يحجب الستربتافيدين (biocytin) لمدة 30 ثانية ، متبوعا بالغسيل في مخزن BLI. سيؤدي ذلك إلى منع سطح الستربتافيدين غير المرتبط ويمنع الارتباط غير المحدد.
    3. بعد الانتهاء من خطوة الاقتران ، افتح الغطاء واستبدل الأنبوب "A" بالأنبوب "D." حركه أسفل المستشعر الحيوي وأغلق الغطاء.
    4. بعد اكتمال خطوة التفكك، افتح الغطاء وافصل المستشعر الحيوي وضعه في درج المستشعر الحيوي الذي يحتوي على المخزن المؤقت LI. تأكد من غمس المستشعر الحيوي بالكامل في المخزن المؤقت وترطيبه بشكل كاف للخطوات التالية. نظف حامل القطرة باستخدام عازلة الفحص ، وجففه بمناديل خالية من النسالة ، وقم بإزالة الأنبوب "D" من حامل الأنبوب. المستشعر الحيوي مغطى الآن بركيزة 3'Bio-ss-poly (dT) 32 .
  4. ربط البروتين
    1. ماصة 250 ميكرولتر من BLI عازلة في عشرة أنابيب ميكروفوج سوداء سعة 0.5 مل. قم بتسميتهم من A1 إلى A5 ومن D1 إلى D5.
    2. في لوحة أخرى مكونة من 96 بئرا ، أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتجريد في البئر ، بما يتوافق مع موضع المستشعر الحيوي الرطب.
    3. قبل بدء الفحص ، قم بتنظيف حامل الإسقاط 3x باستخدام المخزن المؤقت BLI.
    4. افتح ملفا جديدا على البرنامج وحدد Basic Kinetics على اللوحة اليسرى. قم بتسمية الفحص وإضافة الوصف حسب الحاجة (الشكل التكميلي 2). اضبط إعدادات التشغيل كما هو مطلوب (الجدول 1).
    5. ضع الأنبوب المسمى A1 في حامل الأنبوب وقم بتوصيل المستشعر الحيوي المطلي ب 3'Bio-ss-poly (dT) 32 بنظام LI. حرك الأنبوب أسفل المستشعر الحيوي واضغط على تشغيل.
    6. بعد الانتهاء من خطوة خط الأساس الأولية، افتح الغطاء، وأضف 4 ميكرولتر من المخزن المؤقت BLI إلى حامل الإسقاط، ثم حركه أسفل المستشعر الحيوي. سيكون هذا هو تركيز البروتين 0 نانومتر ويكون بمثابة منحنى مرجعي.
    7. بعد الانتهاء من خطوة الاقتران ، استبدل الأنبوب A1 ب D1 وحركه أسفل المستشعر الحيوي.
    8. بمجرد اكتمال خطوة التفكك، قم بإزالة المستشعر الحيوي وضعه مرة أخرى في درجه. تأكد من غمس المستشعر الحيوي بالكامل في المخزن المؤقت وترطيبه بشكل كاف للخطوات التالية. قم بإزالة الأنبوب D1 ، ونظف حامل القطرة بمحلول الفحص ، وجففه بمنديل خال من النسالة.
    9. بعد ذلك ، سيتم الحصول على منحنى الربط لمخزون 5 نانومتر RPA. املأ تفاصيل العينة (التركيز: 5 نانومتر ، الوزن الجزيئي: 116 كيلو دالتون] ، واضغط على Calc. سيؤدي ذلك إلى حساب تركيز البروتين بالميكروغرام / ميكرولتر.
    10. قم بتوصيل المستشعر الحيوي المطلي ب 3'Bio-ss-poly (dT) 32 وضع الأنبوب A2 في حامل الأنبوب. حركه أسفل المستشعر الحيوي واضغط على تشغيل.
    11. بعد خط الأساس، أضف 4 ميكرولتر من 5 نانومتر RPA إلى حامل الإسقاط وحركه أسفل المستشعر الحيوي. أغلق الغطاء وراقب منحنى الارتباط. يمكن تصور ارتباط البروتين بالطعم من خلال منحنى يمتد أعلى من منحنى خط الأساس. بعد خطوة الاقتران ، استبدل A2 ب D2 ، وحركها أسفل المستشعر الحيوي ، وأكمل خطوة التفكك.
    12. قم بإزالة المستشعر الحيوي ، واغمسه في مخزن التجريد لمدة 30 ثانية ، ثم اغمسه في المخزن المؤقت BLI لمدة 3 دقائق.
      ملاحظة: تعتمد كفاءة التجديد على الطعم المجمد والتحليل المعطل. يمكن لبعض أجهزة الاستشعار الحيوية المجمدة أن تتحمل عشر دورات تجديد أو أكثر. يمكننا تجريد الركيزة البيوتينيل 3'Bio-ss-poly (dT) 32 أكثر من ثلاث مرات (الشكل التكميلي 3) دون ملاحظة تغيير ملحوظ في الاستجابة.
    13. كرر الخطوات 2.4.9-2.4.12 للتركيزات الثلاثة الأخرى من RPA 10 نانومتر و 20 نانومتر و 40 نانومتر. تأكد من تجريد المستشعر الحيوي لكل تركيز.
      ملاحظة: بالنسبة لمقايسات BLI ، يوصي الخبراء باستخدام أربعة تركيزات (باستثناء المنحنى المرجعي) ، تمتد تقريبا من 0.1x إلى 10x منKD المتوقع لقياسات حركية دقيقة. هنا ، تم الحصول على التركيزات الأربعة عن طريق التخفيفات المتسلسلة.
  5. تحليل البيانات وحساب قيمKD
    1. قبل حساب قيمةKD ، من الضروري فحص جهاز الاستشعار بصريا لكل تركيز من ربط RPA على الركيزة 3'Bio-ss-poly (dT) 32 . تأكد من زيادة إشارة BLI مع زيادة تركيز RPA حتى يتم تشبع الحمض النووي الثابت (الشكل 4).
      ملاحظة: للحصول على نتائج موثوقة ، تأكد من أن أربعة تركيزات بروتين على الأقل مرتبطة بنجاح بالركيزة ، باستثناء تركيز التحليل 0 نانومتر. ارجع إلى قسم المناقشة لاستكشاف أخطاء الأخطاء المحتملة وإصلاحها.
    2. في جدول "قائمة التشغيل" ، تحقق من المرجع لتركيز تحليل 0 نانومتر ليكون بمثابة منحنى مرجعي. تحقق من التحليل لجميع تركيزات المادة التحليلية.
    3. بعد ذلك ، حدد كل من بداية الاقتران وبدء التفكك لتصحيح الخطوة. سيؤدي ذلك إلى محاذاة بداية الارتباط بنهاية خط الأساس وبداية الانفصال مع نهاية الارتباط ، والذي يحدث عادة بسبب أنماط انعكاس مختلفة بين حامل السقوط والأنبوب إذا كان المخزن المؤقت متطابقا جيدا.
    4. حدد التركيب العام (1:1) لهذا الفحص. يحسب التحليل العالمي قيمKD لمجموعة كاملة من تركيزات البروتين ، بينما يكون التحليل المحلي لتركيز بروتين واحد.
      ملاحظة: يسمح البرنامج المصاحب للأداة فقط بالتركيب بنسبة 1: 1. قد يكون هذا تحذيرا محتملا عندما يتوقع أن يتناسب الطعم والتحليل مع نماذج التركيب الأخرى. يمكن تصدير البيانات من هذا البرنامج إلى برامج تخطيط أخرى وتتناسب مع نماذج التركيب المطلوبة.
    5. بعد ذلك، حدد تحليل. سيؤدي هذا إلى حساب قيمKD و ka /k d (الجدول 2). يعتبر الخطأ ka و kd في حدود 10٪ من القيمة مقبولا بشكل عام.
      ملاحظة: تأكد من أن هذه القيم ضمن الحدود المعقولة. إذا كان الخطأ أقل من 10٪ ، فهذا يشير إلى أن ملاءمة البيانات موثوقة لدراسة التفاعلات بين الجزيئات البيولوجية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يكونKD المحسوب (ثابت تفكك التوازن) باستخدام قيم ka و kd دقيقا بما فيه الكفاية لمعظم التطبيقات العملية18.
    6. لتصدير البيانات الملائمة ، انقر بزر الماوس الأيمن على الرسم البياني الذي تم إنشاؤه باستخدام البيانات التي تم تحليلها. اختر تصدير البيانات، ثم حدد نص/بيانات. انقر فوق ملف وتصفح لحفظ البيانات بتنسيق ".dat". يمكن فتح هذا الملف في Microsoft Excel واستخدامه في برامج أخرى لرسم الرسم البياني.
      ملاحظة: يأخذ التركيب العالمي في الاعتبار جميع بيانات منحنى الربط داخل المجموعة ، بينما يركز التركيب المحلي فقط على المعلمات الحركية لكل تركيز تحليلي فردي.

3. إعداد الجهاز لتشغيل الحركية المتقدمة

  1. افتح البرنامج وحدد Advanced Kinetics على اللوحة اليسرى (الشكل التكميلي 1).
  2. ضع طبقا سعة 96 بئرا في الدرج الذي يحتوي على المستشعرات الحيوية. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت BLI في خمسة آبار. ضع صينية المستشعرات الحيوية على اللوحة المكونة من 96 بئرا بحيث تغمس خمسة مستشعرات حيوية في البئر الذي يحتوي على المخزن المؤقت.
  3. في البرنامج ، انقر فوق Hydrate وقم بتشغيل المؤقت لمدة 10 دقائق ، مما يسمح للمستشعر الحيوي الفردي بالترطيب لمدة 10 دقائق على الأقل.
  4. أثناء ترطيب المستشعرات الحيوية ، تقوم الماصة 250 ميكرولتر من BLI في عشرة أنابيب طرد مركزي سوداء سعة 0.5 مل. قم بتسميتهم على أنها A1 إلى A5 و D1 إلى D5.
  5. املأ التفاصيل الموجودة على البرنامج (الاسم: طلاء الركيزة ووصف الفحص: RPA-3'Bio-ss-poly (dT) 32: الحركية المتقدمة).
  6. أدخل مدة كل خطوة (الشكل التكميلي 4). خط الأساس الأولي (30 ثانية) ، التحميل (120 ثانية) ، خط الأساس (30 ثانية) ، الارتباط (120 ثانية) ، التفكك (120 ثانية). اضبط إعدادات التشغيل كما هو مطلوب (الجدول 1).
    1. املأ التفاصيل الموجودة على البرنامج (التركيز: 0 نانومتر ، الوزن الجزيئي: 116 كيلو دالتون) واضغط على Calc.
  7. ضع الأنبوب A1 في حامل الأنبوب وقم بتوصيل المستشعر الحيوي. حرك حامل الأنبوب أسفل المستشعر الحيوي واضغط على تشغيل للحصول على خط الأساس الأولي.
  8. أضف 4 ميكرولتر من الركيزة 12.5 نانومتر إلى حامل الإسقاط وحركها أسفل المستشعر الحيوي. أغلق الغطاء. سيؤدي ذلك إلى تحميل الركيزة على المستشعر الحيوي. استبدل A1 ب D1 في حامل الأنبوب وحركه أسفل المستشعر الحيوي. سيعطي هذا منحنى خط الأساس.
  9. نظف حامل القطرة بمنديل خال من النسالة وقم بتحميل 4 ميكرولتر من المخزن المؤقت LI. حركه أسفل المستشعر الحيوي وأغلق الغطاء. سيكون هذا هو تركيز البروتين 0 نانومتر وسيكون بمثابة المنحنى المرجعي.
  10. بعد الانتهاء من خطوة الاقتران ، حرك أنبوب D2 أسفل المستشعر الحيوي. تابع خطوة التفكك. السماح بإكمال التفكك.
  11. افصل المستشعر الحيوي ، وقم بإزالة D2 من حامل الأنبوب ، ونظف حامل السقوط بمنديل خال من النسالة.
  12. أدخل التفاصيل (التركيز: 5 نانومتر ، الوزن الجزيئي: 116 كيلو دالتون) للتشغيل التالي واضغط على Calc.
  13. قم بتوصيل المستشعر الحيوي الثاني بنظام BLItz ، ضع الأنبوب A2 في حامل الأنبوب ، وحركه أسفل المستشعر الحيوي.
  14. بعد إنشاء خط الأساس الأولي ، أضف 4 ميكرولتر من الركيزة 12.5 نانومتر إلى حامل الإسقاط. حركه أسفل المستشعر الحيوي وأغلق الغطاء. استبدل الأنبوب A2 ب D3 وحركه أسفل المستشعر الحيوي. بعد ذلك ، أضف 4 ميكرولتر من مخزون 10 نانومتر من RPA إلى حامل الأنبوب وحركه تحت المستشعر الحيوي.
  15. بعد الاقتران ، حرك D4 أسفل المستشعر الحيوي للتفكك.
  16. كرر الخطوات 3.1.12-3.1.15 للتركيزات الثلاثة اللاحقة من RPA (10 نانومتر ، 20 نانومتر ، 40 نانومتر). يتم عرض منحنيات الربط لهذه التركيزات في الشكل 5.
  17. يمكن تركيب تحليل البيانات وقيمةKD في نفس الإجراء مثل الحركية الأساسية ل BLI (الخطوة 2.5 ، الجدول 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

في BLI ، ينعكس الضوء الأبيض من واجهة الطبقة الحيوية / المخزن المؤقت والواجهة المرجعية الداخلية إلى مقياس الطيف. ويسجل مخطط التداخل الناتج، ويقاس التحول الطيفي على مدى فترة زمنية ويصور على أنه استجابة منحنيات ربط بالنانومتر. يظهر الشكل 1 شكل تمثيلي يوضح طرف...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

توفر القدرة على تحليل حركية ربط أي بروتين بركيسته باستخدام BLI وسائل لعزل وتوصيف العوامل المحددة (مثل تسلسل أو هيكل أو طول الحمض النووي) التي تحكم تفاعلات البروتين والحمض النووي داخل الخلية19. يسمح نظام Octet N1 ، الذي يعتمد على مبادئ قياس تداخل الطبقة الحيوية ، ب?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من خلال منح من المؤسسة الوطنية للعلوم (1929346) وجمعية السرطان الأمريكية (RSG-21-028-01). ونود أيضا أن نشكر أعضاء مختبر بالاكريشنان على المناقشات المفيدة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 mL Micro Centrifuge TubesGlobe Scientific111554A
96 Well Standard Black MicroplateDot Scientific4ti-0223
Biotinylated poly dT OligonucleotideIDT
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153-10G
Dithiothreitol (DTT)Dot ScientificDSD11000-10
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Dot ScientificDSE57020-500
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-500
Kimtec Science Kimwipes Kimtech34120
Octet N1 SoftwareSartorius 1.4.0.13
Octet SA Biosensor Sartorius 18-5019
PBS pH 7.2 (10x)Gibco1666711
Personal Assay Octet N1 SystemSartorius 
Phosphoric Acid Ward's Science470302-024
Sodium Chloride (NaCl)Dot ScientificDSS23020-5000
Tris BaseDot ScientificDST60040-5000
Tween20 Bio-Rad170-6531

References

  1. Kalodimos, C. G., et al. Structure and flexibility adaptation in non-specific and specific protein-DNA complexes. Science. 305 (5682), 386-389 (2004).
  2. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9 (23), 6505-6525 (1981).
  3. Lane, D., Prentki, P., Chandler, M. Use of gel retardation to analyze protein-nucleic acid interactions. Microbiol Rev. 56 (4), 509-528 (1992).
  4. Dyer, R. B., Herzog, N. K. Immunodepletion EMSA: A novel method to identify proteins in a protein-DNA complex. Nucleic Acids Res. 23 (16), 3345-3346 (1995).
  5. Dudley, R. K. A laboratory guide to in vitro studies of protein-DNA interactions. FEBS Lett. 306, 2-3 (1991).
  6. Tsai, C., Smider, V., Hwang, B. J., Chu, G. Electrophoretic mobility shift assays for protein-DNA complexes involved in DNA repair. Methods Mol Biol. 920, 53-78 (2012).
  7. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).
  8. Heffler, M. A., Walters, R. D., Kugel, J. F. Using electrophoretic mobility shift assays to measure equilibrium dissociation constants: GAL4-p53 binding DNA as a model system. Biochem Mol Biol Educ. 40 (6), 383-387 (2012).
  9. Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. J Vis Exp. (84), e51383(2014).
  10. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J Pharm Biomed Anal. 72, 150-154 (2013).
  11. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
  12. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).
  13. Schasfoort, R. B. M., Tudos, A. J. Handbook of surface plasmon resonance. , RSC Pub. (2008).
  14. Douzi, B. Surface plasmon resonance: A sensitive tool to study protein-protein interactions. Methods Mol Biol. 2715, 363-382 (2024).
  15. Douzi, B. Protein-protein interactions: Surface plasmon resonance. Methods Mol Biol. 1615, 257-275 (2017).
  16. Drescher, D. G., Selvakumar, D., Drescher, M. J. Analysis of protein interactions by surface plasmon resonance. Adv Protein Chem Struct Biol. 110, 1-30 (2018).
  17. Martin, S. R., Ramos, A., Masino, L. Biolayer interferometry: Protein-RNA interactions. Methods Mol Biol. 2263, 351-368 (2021).
  18. Apiyo, D. Biomolecular binding kinetics assays on the Octet BLI platform. , https://www.sartorius.com/resource/blob/742330/05671fe2de45d16bd72b8078ac28980d/octet-biomolecular-binding-kinetics-application-note-4014-en-1--data.pdf (2022).
  19. Barrows, J. K., Van Dyke, M. W. Biolayer interferometry for DNA-protein interactions. PLoS One. 17 (2), e0263322(2022).
  20. Desai, M., Di, R., Fan, H. Application of biolayer interferometry (BLI) for studying protein-protein interactions in transcription. J Vis Exp. (149), e59687(2019).
  21. Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic acid interactions by biolayer interferometry. Curr Protoc Protein Sci. 79, 19.25.1-19.25.26 (2015).
  22. Petersen, R. L. Strategies using bio-layer interferometry biosensor technology for vaccine research and development. Biosensors (Basel). 7 (4), 49(2017).
  23. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization. Comb Chem High Throughput Screen. 12 (8), 791-800 (2009).
  24. Wold, M. S. Replication protein A: A heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism. Annu Rev Biochem. 66, 61-92 (1997).
  25. Qureshi, M. H., Ray, S., Sewell, A. L., Basu, S., Balci, H. Replication protein A unfolds G-quadruplex structures with varying degrees of efficiency. J Phys Chem B. 116 (19), 5588-5594 (2012).
  26. Wold, M. S., Kelly, T. Purification and characterization of replication protein A, a cellular protein required for in vitro replication of simian virus 40 DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (8), 2523-2527 (1988).
  27. Bochkareva, E., Korolev, S., Lees-Miller, S. P., Bochkarev, A. Structure of the RPA trimerization core and its role in the multistep DNA-binding mechanism of RPA. EMBO J. 21 (7), 1855-1863 (2002).
  28. Brosey, C. A., et al. NMR analysis of the architecture and functional remodeling of a modular multidomain protein, RPA. J Am Chem Soc. 131 (18), 6346-6347 (2009).
  29. Fanning, E., Klimovich, V., Nager, A. R. A dynamic model for replication protein A (RPA) function in DNA processing pathways. Nucleic Acids Res. 34 (15), 4126-4137 (2006).
  30. Gibb, B., et al. Protein dynamics during presynaptic-complex assembly on individual single-stranded DNA molecules. Nat Struct Mol Biol. 21 (10), 893-900 (2014).
  31. Nguyen, B., et al. Diffusion of human replication protein A along single-stranded DNA. J Mol Biol. 426 (19), 3246-3261 (2014).
  32. Brosey, C. A., et al. Functional dynamics in replication protein A DNA binding and protein recruitment domains. Structure. 23 (6), 1028-1038 (2015).
  33. Chen, R., Subramanyam, S., Elcock, A. H., Spies, M., Wold, M. S. Dynamic binding of replication protein a is required for DNA repair. Nucleic Acids Res. 44 (12), 5758-5772 (2016).
  34. Kemmerich, F. E., et al. Force regulated dynamics of RPA on a DNA fork. Nucleic Acids Res. 44 (12), 5837-5848 (2016).
  35. Pokhrel, N., et al. Dynamics and selective remodeling of the DNA-binding domains of RPA. Nat Struct Mol Biol. 26 (2), 129-136 (2019).
  36. Wang, Q. M., et al. Human replication protein A induces dynamic changes in single-stranded DNA and RNA structures. J Biol Chem. 294 (38), 13915-13927 (2019).
  37. Wyka, I. M., Dhar, K., Binz, S. K., Wold, M. S. Replication protein A interactions with DNA: Differential binding of the core domains and analysis of the DNA interaction surface. Biochemistry. 42 (44), 12909-12918 (2003).
  38. Kim, C., Snyder, R. O., Wold, M. S. Binding properties of replication protein A from human and yeast cells. Mol Cell Biol. 12 (7), 3050-3059 (1992).
  39. Caldwell, C. C., Spies, M. Dynamic elements of replication protein A at the crossroads of DNA replication, recombination, and repair. Crit Rev Biochem Mol Biol. 55 (5), 482-507 (2020).
  40. Mishra, A. K., Dormi, S. S., Turchi, A. M., Woods, D. S., Turchi, J. J. Chemical inhibitor targeting the replication protein A-DNA interaction increases the efficacy of Pt-based chemotherapy in lung and ovarian cancer. Biochem Pharmacol. 93 (1), 25-33 (2015).
  41. Gavande, N. S., et al. Structure-guided optimization of replication Protein A (RPA)-DNA interaction inhibitors. ACS Med Chem Lett. 11 (6), 1118-1124 (2020).
  42. Ana Jug, T. B., Janez Ilaš, Biolayer interferometry and its applications in drug discovery and development. TrAC Trends Anal Chem. 176, 117741(2024).
  43. Gator Bio, I. Using BLI for viral and lipid-based vector analytics. , News Medical. https://www.news-medical.net/whitepaper/20230322/Using-BLI-for-viral-and-lipid-based-vector-analytics.aspx (2023).
  44. Noy-Porat, T., et al. Characterization of antibody-antigen interactions using biolayer interferometry. STAR Protoc. 2 (4), 100836(2021).
  45. Onyekachi Ononye, S. S., et al. Biochemical impact of p300-mediated acetylation of replication protein A: Implications for DNA metabolic pathway choice. bioRxiv. , (2024).
  46. Weeramange, C. J., Fairlamb, M. S., Singh, D., Fenton, A. W., Swint-Kruse, L. The strengths and limitations of using biolayer interferometry to monitor equilibrium titrations of biomolecules. Protein Sci. 29 (4), 1018-1034 (2020).
  47. Artem Stetsenko, A. G. An Overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization. Crystals. 7 (7), 197(2017).
  48. Hubbe, M. A., Szlek, D. B., Vera, R. E. Detergency mechanisms and cellulosic surfaces: A review. BioResources. 17 (4), 7167-7249 (2022).
  49. Renee Tobias, S. K., Apiyo, A. Research the Industry Standard for Label-Free of Biomolecular Interactions Analysis (BIA). , https://www.sartorius.com/en/products/biolayer-interferometry/bli-resources (2021).
  50. Octet NTA Biosensor Kinetic Assays. , Sartorius. https://www.sartorius.com/resource/blob/552398/b27ccc2fdfde7a9320909572ced3f6a1/ni-nta-biosensor-kinetic-assays-technical-note-en-sartorius-data.pdf (2024).
  51. Application Guides: Kinetics and affinity measurements with Biacore systems. , Cytiva. Available from: https://cdn.cytivalifesciences.com/api/public/content/digi-33042-pdf (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

215 BLI

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved