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Resumo

Este artigo descreve um protocolo para estudar as interações DNA-proteína usando um sistema de interferometria de biocamada (BLI) baseado em estreptavidina. Ele descreve as etapas e considerações essenciais para a utilização da cinética de ligação básica ou avançada para determinar a afinidade de ligação de equilíbrio (KD) da interação.

Resumo

As interações proteína-DNA sustentam processos celulares essenciais. Compreender essas interações é fundamental para elucidar os mecanismos moleculares de várias vias. Fatores-chave, como estrutura, sequência e comprimento de uma molécula de DNA, podem influenciar significativamente a ligação às proteínas. A interferometria de biocamadas (BLI) é uma técnica sem rótulos que mede a cinética de ligação entre moléculas, oferecendo uma abordagem direta e precisa para estudar quantitativamente as interações proteína-DNA. Uma grande vantagem do BLI sobre os métodos tradicionais baseados em gel é sua capacidade de fornecer dados em tempo real sobre a cinética de ligação, permitindo a medição precisa da constante de dissociação de equilíbrio (KD) para interações dinâmicas proteína-DNA. Este artigo apresenta um protocolo básico para determinar o valor KD da interação entre uma proteína de replicação de DNA, proteína de replicação A (RPA) e um substrato de DNA de fita simples (ssDNA). O RPA se liga ao ssDNA com alta afinidade, mas também deve ser facilmente deslocado para facilitar as interações proteicas subsequentes nas vias biológicas. No ensaio BLI descrito, o ssDNA biotinilado é imobilizado em um biossensor revestido com estreptavidina. A cinética de ligação (associação e dissociação) do RPA ao DNA ligado ao biossensor é então medida. Os dados resultantes são analisados para derivar valores precisos para a constante de taxa de associação (ka), constante de taxa de dissociação (kd) e constante de ligação de equilíbrio (KD) usando software de sistema.

Introdução

As proteínas celulares desempenham um papel fundamental na orquestração dos complexos processos biológicos que ocorrem dentro dos organismos vivos. O funcionamento ideal dessas vias depende da interação entre proteínas e outras biomoléculas dentro da célula, incluindo interações com proteínas parceiras e ácidos nucléicos1. Assim, compreender os meandros dos processos celulares requer uma compreensão profunda da dinâmica das interações proteína-ácido nucléico.

Tradicionalmente, as interações proteína-ácido nucleico têm sido estudadas usando ensaios de mudança de gel de mobilidade eletroforética (EMSAs)2. Neste ensaio, as proteínas são incubadas com oligonucleotídeos sintéticos (DNA / RNA, contendo comprimentos ou sequências específicas) por um curto período, e a reação é então eletroforesada em um gel de poliacrilamida nativo (PAGE) 3,4,5. Para permitir a visualização da interação proteína-oligonucleotídeo, os oligonucleotídeos são tipicamente marcados radioativamente com 32P ou marcados com moléculas fluorescentes. Se a proteína interage e se liga ao oligonucleotídeo, a ligação da proteína retarda a mobilidade do ácido nucléico dentro do gel 6,7. Assim, esse método também é chamado de ensaio de deslocamento de gel ou retardo de gel. Embora esse método tenha sido amplamente utilizado, existem algumas limitações a serem consideradas ao usá-lo para obter valores de KD, incluindo baixa resolução de ligação fraca ou dinâmica, a necessidade de uma concentração significativamente alta de proteínas e mais esforço. Além disso, os EMSAs não são ensaios em tempo real e, portanto, não podem medir com precisãoa cinética de ligação 7,8.

Técnicas inovadoras como ressonância plasmônica de superfície (SPR) e interferometria de biocamada (BLI) surgiram para superar essas limitações 9,10,11,12. Ambos os métodos medem constantes de taxa de associação/dissociação e constantes de afinidade entre moléculas de maneira livre de marcadores. Como a proteína não precisa ser marcada, essas técnicas eliminam o risco de alterar as propriedades da proteína ou bloquear o local de ligação. No SPR, a luz polarizada interage com um sensor (um filme condutor de metal, normalmente ouro), gerando uma onda de densidade de carga de elétrons chamada plasmon. Essa interação diminui a intensidade do feixe refletido e um detector mede a mudança no ângulo específico, conhecido como ângulo de ressonância13. Para estudar as interações ligante (ácido nucleico) - analito (proteína), o ligante é imobilizado em uma célula de fluxo no chip do sensor e o analito é injetado na célula de fluxo que contém o ligante imobilizado. Ao ligar o analito ao ligante, há uma mudança detectável no índice de refração próximo à superfície do sensor, permitindo assim a medição das interações moleculares 14,15,16.

A interferometria de biocamada (BLI) mede o padrão de interferência de luz à medida que a luz passa por uma fibra óptica com uma biocamada, composta por um ligante (isca) e seu parceiro de ligação (analito), na superfície inferior da ponta do biossensor. A luz é transmitida através da ponta e refletida em ambas as extremidades da biocamada devido às propriedades da biocamada. A espessura da biocamada é proporcional ao número de moléculas ligadas que influenciam o padrão da luz refletida. Ao comparar a mudança da curva de intensidade relativa vs. comprimento de onda causado pela interferência entre a luz refletida da interface de referência e da interface biocamada/tampão, a mudança de espessura da biocamada pode ser determinada. Quando mais moléculas se ligam, ocorre uma mudança maior, tornando o BLI uma ferramenta poderosa para estudar interações biomoleculares em tempo real. A mudança no padrão de interferência é medida e representada em um sensorgrama como um deslocamento espectral 17,18 (Figura 1A). A natureza da interação de ligação pode ser determinada com precisão usando controles apropriados, como uma configuração sem as concentrações variáveis de ligante do parceiro de ligação 19,20,21. Comparado ao SPR, o BLI é econômico e fácil de usar, tornando-o acessível a uma ampla gama de pesquisadores. Além disso, as amostras usadas no BLI permanecem intactas se não houver degradação ou agregação. Isso permite que eles sejam possivelmente recuperados e reutilizados, minimizando assim o desperdício. O instrumento BLI opera sem o uso de microfluídica, eliminando assim as desvantagens do sistema fluídico, como a necessidade de manutenção/cuidado, entupimento ou uso de tampões desgaseificados. Também minimiza o risco de contaminação do instrumento devido a amostras de proteína bruta ou não filtradas.

Em um experimento BLI, a biocamada é estabelecida imobilizando a molécula de isca no biossensor. A biocamada de biossensores pode interagir com várias tags, tornando possível estudar as interações entre moléculas (incluindo ácidos nucléicos, proteínas, anticorpos, vírus, pequenas moléculas, etc.)22. Várias estratégias de captura, incluindo biotina/estreptavidina, 6X-His-tag/Ni-NTA, FLAG/anti-FLAG, GST/anti-GST e anticorpo/anti-Fc, podem ser empregadas para estabelecer essa imobilização. Manter a estrutura e a atividade do ligante imobilizado é crucial na escolha do biossensor. As mudanças no padrão de interferência são influenciadas pela quantidade de molécula ligada, bem como pela matriz23. As interações proteína-ácido nucleico são estudadas usando sondas de oligonucleotídeos biotinilados que podem ser imobilizadas em biossensores revestidos com estreptavidina. As amostras de proteína que devem interagir com a isca imobilizada (oligonucleotídeo) estão em contato com o oligonucleotídeo por um período específico em um tampão de ligação para medir a associação e, posteriormente, mudadas para um tampão de ligação em branco para medir a dissociação. Uma representação esquemática da ligação do analito e das alterações correspondentes na curva de ligação é mostrada na Figura 1B. Além disso, as interações proteína-núcleo também podem ser estudadas por uma rota de imobilização reversa, na qual a proteína (isca) é capturada no biossensor e interage com o ácido nucléico (analito).

Atualmente, vários instrumentos estão disponíveis comercialmente que operam com base no princípio da interferometria de biocamadas. Um instrumento simples e econômico é conhecido como sistema Octet N1, que apresenta um único canal para taxa de transferência de dados. Requer operação manual, consome um volume mínimo de amostra (4 μL) e realiza a análise da amostra em temperatura ambiente 9,23. Este instrumento de canal único pode detectar eficiências de ligação de proteínas maiores que 10 kDa e mede afinidades na faixa micromolar (μM) a nanomolar (nM)11,12. Alguns instrumentos com 2, 8, 16 e 96 canais para leitura automatizada de dados também estão disponíveis e são compatíveis com formatos de 96 ou 384 poços 19,20. Alguns desses instrumentos também podem operar entre 4 °C e 40 °C, detectar biomoléculas com peso molecular tão baixo quanto 150 Da e medir afinidades dentro da faixa milimolar a picomolar19,21. Embora o sistema descrito seja econômico, os instrumentos mais caros com vários canais oferecem processamento automático de alto rendimento. Esses sistemas avançados são comumente empregados na caracterização e desenvolvimento de moléculas biológicas de fármacos 9,23.

O protocolo atual descreve as etapas envolvidas na medição dos parâmetros de ligação da proteína de replicação A (RPA) ao DNA de fita simples (ss-DNA) usando o sistema de interferometria de biocamada manual de canal único. RPA é um complexo proteico heterotrimérico de ligação ao ssDNA que desempenha um papel crítico em quase todos os aspectos do metabolismo do DNA, incluindo replicação, reparo e recombinação do DNA24. Devido à sua alta afinidade com o ssDNA (medido na faixa subnanomolar), ele pode se ligar rapidamente ao ssDNA gerado durante várias transações de DNA, protegê-lo da degradação nucleolítica e impedir a ligação improvisada de outras proteínas a jusante. A RPA também desempenha um papel crítico na prevenção da formação de estruturas secundárias e terciárias não canônicas, como G-quadruplexes25. O RPA humano é composto por três subunidades: RPA70 (70 kDa), RPA32 (32 kDa) e RPA14 (14 kDa), também chamadas de RPA 1, RPA 2 e RPA 3, respectivamente 24,26,27. Essas subunidades abrigam seis dobras de ligação de oligonucleotídeos / oligossacarídeos (dobras OB) marcadas de A a F. Entre estes, os domínios de ligação ao DNA (DBDs) estão nas subunidades RPA1 (DBD-A, DBD-B, DBD-C) e RPA2 (DBD-D)28. Inicialmente, pensou-se que, dependendo do comprimento do DNA, o RPA exibe diferentes modos de ligação onde diferentes DBDs foram engajados em comprimentos específicos de DNA29. Dados de estudos estruturais e de molécula única recentes ajudaram a refinar esses modelos para sugerir que a ligação de diferentes DBDs de RPA é mais dinâmica do que o inicialmente sugerido 30,31,32,33,34,35,36. Essa característica da propriedade de ligação dinâmica é essencial para a função do RPA porque o RPA deve ser capaz de se ligar firmemente ao substrato de DNA durante certas transações de DNA; no entanto, também deve ser capaz de se deslocar do substrato para entregar o substrato à próxima proteína durante o processo biológico. Usando diferentes técnicas bioquímicas, o KD para RPA foi determinado em cerca de 0,4 nM para um substrato ss-(polydT)30 e 80 nM e 200 nM para substratos ss-(polydA)257 e dG-(polydG)602, respectivamente, conforme medido por anisotropia de polarização de fluorescência (FPA)37,38. A RPA também mostra uma preferência cerca de 50 vezes maior pela ligação a sequências ricas em pirimidina em comparação com as purinas. Embora diferentes técnicas bioquímicas tenham determinado diferentes medições de KD para RPA, todas as medições foram na faixa nanomolar, sugerindo a alta afinidade de ligação do RPA para o ssDNA. Empregando microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM), descobriu-se que, com base no comprimento do DNA, o RPA se associava a pelo menos dois modos de ligação: um que foi definido em dissociação rápida (Kd, 680 pM) e um complexo de dissociação lenta (Kd, 60 pM)33,39. Dado seu envolvimento fundamental em quase todas as vias metabólicas do DNA, tem havido um grande interesse na criação de inibidores que podem dificultar a interação entre RPA e DNA de fita simples (ssDNA). Esses inibidores químicos são vitais para interromper a resposta a danos no DNA, tornando as células cancerígenas mais suscetíveis a agentes prejudiciais ao DNA empregados em terapias clínicas. A utilização do ensaio BLI permite uma avaliação quantitativa precisa da eficácia do inibidor na modulação da função de ligação do RPA 40,41.

A configuração BLI permite configurações distintas: cinética básica e avançada. No modo cinético básico, o ensaio compreende três estágios primários: estabelecimento da linha de base, associação e dissociação. No entanto, antes de realizar este ensaio, os biossensores precisam ser revestidos separadamente, usando o instrumento ou manualmente na bancada do laboratório. Por outro lado, o modo cinético avançado se estende além das três etapas fundamentais, permitindo a incorporação de etapas adicionais. Essas etapas suplementares podem servir a vários propósitos, como condicionar o biossensor às alterações do tampão ou facilitar a detecção de interações proteicas subsequentes. A cinética avançada também permite retirar o biossensor do analito por um bom método de regeneração para reutilização potencial, desde que a isca e o biossensor permaneçam intactos. Geralmente, a cinética avançada é usada sobre a cinética básica quando várias etapas estão envolvidas no ensaio, ou o ensaio precisa ser realizado em um formato mais complexo.

Este protocolo descreve os dois métodos usando a mesma isca [3'Bio-ss-poly (dT)32] e analito (RPA). Um biossensor revestido com estreptavidina será usado para imobilizar a isca, e medidas de KD para o analito serão obtidas. Este protocolo descreve uma abordagem completa para realizar um ensaio BLI usando uma interferometria de biocamada de instrumento de canal único, abrangendo a preparação da isca do biossensor, considerações de buffer e um esboço passo a passo do procedimento.

Protocolo

Os detalhes dos reagentes e do equipamento usado no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de iscas, analitos, tampões e limpeza do porta-gotas

  1. Configurando o instrumento: Ligue o instrumento pelo menos 1 h antes de iniciar o experimento. Isso permitirá que a lâmpada aqueça.
  2. Preparação de tampões de decapagem e limpeza
    1. Tampão de decapagem: Prepare 50 mL de ácido fosfórico 0,15 M [pH 2,0]).
    2. Tampão de limpeza: Prepare 10 mL de HCl 0,5 N.
  3. Preparação do tampão BLI
    1. Prepare 50 mL de 1x tampão BLI (50 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0,1 mg/mL BSA, 1 mM DTT, 0,05% Tween 20). Conservar este tampão a 4 °C. Antes de configurar este ensaio, leve o tampão à temperatura ambiente.
      NOTA: É altamente recomendável que tampões frescos sejam preparados para o ensaio, pois os tampões envelhecidos podem sofrer alterações de pH ou formação de agregados e podem ter contaminações microbianas, potencialmente comprometendo a reprodutibilidade e a precisão dos resultados. Não é recomendado o uso de buffers armazenados por mais de duas semanas.
  4. Preparação de isco/substrato
    1. Prepare 12,5 nM de substrato 3'Bio-ss-poli (dT)32 (5' TTT TTT TTT TTT TTT TTT TT 3'Bio) usando tampão BLI.
  5. Preparação de estoques de concentração de proteínas
    1. Prepare quatro concentrações de RPA (5 nM, 10 nM, 20 nM, 40 nM) usando tampão BLI. A maior concentração da proteína (40 nM) é obtida diluindo a proteína estoque em tampão BLI. As diluições subsequentes são preparadas por diluição em série da solução de trabalho de 40 nM. Certifique-se de que todos os estoques de proteína sejam mantidos no gelo durante todo o experimento para manter a estabilidade.
  6. Limpando o suporte de queda
    1. Adicione 4 μL de água destilada e limpe o porta-gotas com um pano sem fiapos (repita 3x). Em seguida, repita esta etapa com 4μL de etanol a 70% e limpe com um pano sem fiapos. Esta etapa garante a remoção de contaminantes superficiais e partículas de poeira.
    2. Adicione 4μL de HCl 0,5N e deixe no porta-gotas por 1 min. Limpe-o com um pano sem fiapos e repita esta etapa mais uma vez. Isso garante uma limpeza profunda do porta-gotas. A limpeza profunda é especialmente útil para limpar o porta-gotas de gotas secas de uso anterior.
    3. 1Repita a etapa 1 para lavar o porta-gotas com água destilada e etanol a 70% e seque-o com um pano sem fiapos. O suporte de queda agora está pronto para ser usado.

2. Cinética básica

  1. Configurando o instrumento e o software
    1. Abra o software e selecione Cinética Básica no painel esquerdo (Figura Suplementar 1).
    2. Remova o rack de biossensores da bandeja (obtido de fontes comerciais) e coloque uma placa de 96 poços na bandeja. Adicione 200 μL de tampão BLI ao primeiro poço. Em seguida, posicione a bandeja de biossensores de volta no topo da placa de 96 poços, garantindo que cada biossensor seja inserido em seu poço correspondente. O primeiro biossensor deve agora estar submerso no tampão BLI no primeiro poço.
    3. No software, clique em Hidratar e ligue o cronômetro por 10 min, permitindo que o biossensor único se hidrate por pelo menos 10 min. A etapa hidrata o biossensor para prepará-lo para o ensaio BLI.
    4. Enquanto o biossensor está sendo hidratado, pipete 250 μL de tampão BLI em dois tubos de 0,5 mL. Rotule um como "A" (associação) e o outro como "D" (dissociação).
    5. Preencha os detalhes no software (Nome: Revestimento de substrato e descrição do ensaio: RPA- 3'Bio-ss-poli (dT)32: Cinética básica).
    6. Ajuste a configuração de execução para cada etapa: Linha de base (30 s), Associação (120 s), Dissociação (120 s) (Tabela 1). Mantenha o agitador ligado para o tubo e o suporte de gota. A velocidade do agitador é definida em 2200 rpm (Faixa, 1000–2600 rpm), o que evita os efeitos de transporte de massa causados pela difusão limitada perto da superfície do biossensor.
      NOTA: Recomenda-se otimizar a duração de cada etapa (linha de base, carregamento, associação, dissociação) ao configurar um ensaio de cinética de ligação para melhorar a aquisição de dados.
  2. Estabelecendo uma curva de linha de base
    1. Coloque o tubo A no suporte do tubo e conecte o biossensor hidratado ao sistema BLI. Deslize o suporte do tubo sob o biossensor (posição A, Figura 2).
      NOTA: Os biossensores não devem ser completamente secos em nenhum momento durante o experimento. Se deixadas para secar, as leituras do experimento podem ser significativamente distorcidas.
    2. Clique em Executar e siga as instruções na mensagem de prompt.
    3. Depois de completar a linha de base inicial, abra a tampa e adicione 4 μL de tampão BLI ao suporte de gota. Deslize-o para a direita sob o mesmo biossensor (posição B, Figura 2). Feche a tampa e monitore a curva BLI no software (Figura 3, curva azul).
    4. Após a conclusão, abra a tampa para substituir o tubo 'A' por 'D' e deslize-o sob o biossensor (posição A, Figura 2). Feche a tampa e prossiga com a etapa de dissociação. Após a conclusão, abra a tampa, retire o biossensor, coloque-o de volta na bandeja e certifique-se de que o biossensor esteja mergulhado no tampão BLI.
    5. Remova o sample/tampão, limpe o porta-gotas com um tampão antes de secá-lo com lenços sem fiapos e remova o tubo 'D' do porta-tubo.
  3. Revestimento de substrato
    1. Coloque o tubo A no suporte do tubo e conecte o biossensor hidratado ao sistema BLI. Deslize o suporte do tubo sob o biossensor e pressione Executar.
    2. Após a etapa inicial da linha de base, adicione 4 μL de substrato de 12.5 nM [3'Bio-ss-poly (dT)32] ao suporte de gota e deslize-o sob o biossensor. Feche a tampa e monitore a curva BLI no software. Certifique-se de que essa resposta seja maior do que a linha de base (Figura 3).
      NOTA: A concentração do substrato pode ser otimizada revestindo biossensores com diferentes concentrações (apenas uma concentração por biossensor) e observando as curvas de ligação. Uma curva de ligação com um sinal visivelmente mais alto em comparação com a linha de base é suficiente para confirmar o revestimento do substrato. A sobrecarga do biossensor pode levar a impedimentos estéricos ou aglomeração na superfície. A Figura 3mostra as curvas para cinco concentrações de substrato biotinilado 3'Bio-ss-poli (dT)32 . Além disso, após a conclusão da etapa de carregamento da isca, os biossensores podem ser mergulhados em tampão bloqueador de estreptavidina (biocitina) por 30 s, seguido de lavagem em tampão BLI. Isso bloqueará a superfície da estreptavidina não ligada e impedirá a ligação não específica.
    3. Depois de concluir a etapa de associação, abra a tampa e substitua o tubo 'A' pelo tubo 'D'. Deslize-o sob o biossensor e feche a tampa.
    4. Após a conclusão da etapa de dissociação, abra a tampa, retire o biossensor e coloque-o na bandeja do biossensor que contém o tampão BLI. Certifique-se de que o biossensor esteja completamente mergulhado no tampão e adequadamente hidratado para as próximas etapas. Limpe o porta-gotas com tampão de ensaio, seque-o com lenços sem fiapos e remova o tubo 'D' do porta-tubo. O biossensor agora é revestido com o substrato 3'Bio-ss-poly (dT)32 .
  4. Ligação a proteínas
    1. Pipete 250 μL de tampão BLI em dez tubos de microcentrífugas pretas de 0,5 mL. Rotule-os como A1 a A5 e D1 a D5.
    2. Em outra placa de 96 poços, adicione 200 μL de tampão de remoção no poço, correspondendo à posição do biossensor hidratado.
    3. Antes de iniciar o ensaio, limpe o porta-gotas 3x com tampão BLI.
    4. Abra um novo arquivo no software e selecione Cinética básica no painel esquerdo. Nomeie o ensaio e adicione a descrição conforme necessário (Figura Suplementar 2). Ajuste as configurações de execução conforme necessário (Tabela 1).
    5. Coloque o tubo rotulado como A1 no suporte do tubo e conecte o biossensor revestido com 3'Bio-ss-poly (dT)32 ao sistema BLI. Deslize o tubo sob o biossensor e clique em Executar.
    6. Depois de concluir a etapa inicial da linha de base, abra a tampa, adicione 4 μL do tampão BLI ao suporte de gota e deslize-o sob o biossensor. Esta será a concentração de proteína de 0 nM e servirá como curva de referência.
    7. Depois de concluir a etapa de associação, substitua o tubo A1 por D1 e deslize-o sob o biossensor.
    8. Quando a etapa de dissociação estiver concluída, remova o biossensor e coloque-o de volta em sua bandeja. Certifique-se de que o biossensor esteja completamente mergulhado no tampão e adequadamente hidratado para as próximas etapas. Remova o tubo D1, limpe o porta-gotas com tampão de ensaio e seque-o com um pano sem fiapos.
    9. Em seguida, será obtida a curva de ligação para o estoque RPA de 5 nM. Preencha os detalhes da amostra (Concentração: 5 nM, Peso molecular: 116 KDa] e pressione Calc. Isso calculará a concentração de proteína em μg/μL.
    10. Conecte o biossensor revestido com 3'Bio-ss-poly (dT)32 e coloque o tubo A2 no suporte do tubo. Deslize-o sob o biossensor e clique em Executar.
    11. Após a linha de base, adicione 4 μL de RPA de 5 nM no suporte de gota e deslize-o sob o biossensor. Feche a tampa e monitore a curva de associação. A ligação da proteína à isca pode ser visualizada por uma curva mais alta do que a curva da linha de base. Após a etapa de associação, substitua A2 por D2, deslize-o sob o biossensor e conclua a etapa de dissociação.
    12. Remova o biossensor, mergulhe-o no tampão de decapagem por 30 s e, em seguida, mergulhe-o no tampão BLI por 3 min.
      NOTA: A eficiência da regeneração depende da isca imobilizada e do analito interrompido. Alguns biossensores imobilizados podem suportar dez ou mais ciclos de regeneração. Poderíamos retirar o substrato biotinilado 3'Bio-ss-poli (dT)32 mais de três vezes (Figura Suplementar 3) sem observar uma mudança perceptível na resposta.
    13. Repita as etapas 2.4.9–2.4.12 para as outras três concentrações de RPA 10 nM, 20 nM e 40 nM. Certifique-se de retirar o biossensor para cada concentração.
      NOTA: Para ensaios BLI, os especialistas recomendam o uso de quatro concentrações (excluindo a curva de referência), abrangendo aproximadamente de 0,1x a 10x o KD esperado para medições cinéticas precisas. Aqui, as quatro concentrações foram obtidas por diluições seriadas.
  5. Análise de dados e cálculo de valores KD
    1. Antes de calcular o valor KD , é necessário inspecionar visualmente o sensorgrama para cada concentração de ligação de RPA no substrato 3'Bio-ss-poly (dT)32 . Certifique-se de que o sinal BLI aumenta com o aumento da concentração de RPA até que o DNA imobilizado esteja saturado (Figura 4).
      NOTA: Para obter resultados confiáveis, certifique-se de que pelo menos quatro concentrações de proteína estejam ligadas com sucesso ao substrato, excluindo a concentração do analito de 0 nM. Consulte a seção de discussão para solucionar possíveis erros.
    2. Na tabela 'Lista de execução', marque Ref para concentração de analito de 0 nM para servir como uma curva de referência. Verifique Analisar para todas as concentrações do analito.
    3. Em seguida, selecione Início da associação e Início da dissociação para correção de etapas. Isso alinhará o início da associação com o final da linha de base e o início da dissociação com o fim da associação, que geralmente é causado por diferentes padrões de reflexão entre o suporte de gota e o tubo, se o buffer corresponder bem.
    4. Selecione Ajuste Global (1:1) para este ensaio. A análise global calcula os valores de KD para um conjunto inteiro de concentrações de proteína, enquanto a análise local é para uma única concentração de proteína.
      NOTA: O software que acompanha o instrumento permite apenas o ajuste 1:1. Isso pode ser uma ressalva potencial quando se espera que a isca e o analito se encaixem em outros modelos de encaixe. Os dados deste software podem ser exportados para outro software de plotagem e encaixados nos modelos de encaixe necessários.
    5. Em seguida, selecione Analisar. Isso calculará os valores de KD, ka/kd (Tabela 2). O erro ka e kd dentro de 10% do valor é geralmente considerado aceitável.
      NOTA: Certifique-se de que esses valores estejam dentro de limites razoáveis. Se o erro for inferior a 10%, isso sugere que o ajuste dos dados é confiável para estudar as interações entre moléculas biológicas. Além disso, o KD calculado (constante de dissociação de equilíbrio) usando esses valoresde k a e kd deve ser suficientemente preciso para a maioria das aplicações práticas18.
    6. Para exportar os dados ajustados, clique com o botão direito do mouse no gráfico gerado usando os dados analisados. Escolha Exportar Dados e selecione Texto/Dados. Clique em Arquivo e Procurar para salvar os dados no formato '.dat'. Este arquivo pode ser aberto no Microsoft Excel e usado em outro software para plotagem de gráficos.
      NOTA: O ajuste global considera todos os dados da curva de ligação dentro do grupo, enquanto o ajuste local se concentra apenas nos parâmetros cinéticos para cada concentração individual do analito.

3. Configurando o instrumento para executar cinética avançada

  1. Abra o software e selecione Cinética avançada no painel esquerdo (Figura 1 suplementar).
  2. Coloque uma placa de 96 poços na bandeja que contém os biossensores. Adicione 200 μL de tampão BLI em cinco poços. Coloque a bandeja de biossensores na placa de 96 poços de forma que cinco biossensores mergulhem no poço que contém o tampão.
  3. No software, clique em Hidratar e ligue o cronômetro por 10 min, permitindo que o biossensor único se hidrate por pelo menos 10 min.
  4. Enquanto os biossensores estão hidratando, pipete 250 μL de tampão BLI em dez tubos de centrífuga pretos de 0,5 mL. Rotule-os como A1 a A5 e D1 a D5.
  5. Preencha os detalhes no software (Nome: Revestimento de substrato e descrição do ensaio: RPA-3'Bio-ss-poly (dT)32: Cinética avançada).
  6. Insira a duração de cada etapa (Figura Suplementar 4). Linha de base inicial (30 s), Carga (120 s), Linha de base (30 s), Associação (120 s), Dissociação (120 s). Ajuste as configurações de execução conforme necessário (Tabela 1).
    1. Preencha os dados no software (Concentração: 0 nM, Peso molecular: 116 kDa) e pressione Calc.
  7. Coloque o tubo A1 no suporte do tubo e conecte o biossensor. Deslize o suporte do tubo sob o biossensor e pressione Executar para obter a linha de base inicial.
  8. Adicione 4 μL de substrato de 12,5 nM no suporte de gota e deslize-o sob o biossensor. Feche a tampa. Isso carregará o substrato no biossensor. Substitua A1 por D1 no suporte do tubo e deslize-o sob o biossensor. Isso fornecerá a curva da linha de base.
  9. Limpe o porta-gotas com um pano sem fiapos e carregue 4 μL do buffer BLI. Deslize-o sob o biossensor e feche a tampa. Esta será a concentração de proteína de 0 nM e servirá como curva de referência.
  10. Depois de concluir a etapa de associação, deslize o tubo D2 sob o biossensor. Prossiga com a etapa de dissociação. Permita que a dissociação seja concluída.
  11. Retire o biossensor, remova D2 do suporte do tubo e limpe o suporte de queda com um pano sem fiapos.
  12. Insira os detalhes (Concentração: 5 nM, Peso molecular: 116 kDa) para a próxima execução e pressione Calc.
  13. Conecte o segundo biossensor ao sistema BLItz, coloque o tubo A2 no suporte do tubo e deslize-o sob o biossensor.
  14. Depois de estabelecer a linha de base inicial, adicione 4 μL de substrato de 12,5 nM no suporte de gota. Deslize-o sob o biossensor e feche a tampa. Substitua o tubo A2 por D3 e deslize-o sob o biossensor. Em seguida, adicione 4 μL de estoque de 10 nM de RPA no suporte do tubo e deslize-o sob o biossensor.
  15. Após a associação, deslize D4 sob o biossensor para dissociação.
  16. Repita as etapas 3.1.12–3.1.15 para as três concentrações subsequentes de RPA (10 nM, 20 nM, 40 nM). As curvas de ligação para essas concentrações são mostradas na Figura 5.
  17. A análise dos dados e o valor KD podem ser ajustados no mesmo procedimento que a cinética básica do BLI (etapa 2.5, Tabela 2).

Resultados

No BLI, a luz branca é refletida da interface da biocamada/tampão e da interface de referência interna para o espectrômetro. O padrão de interferência resultante é registrado e o deslocamento espectral é medido ao longo de um período de tempo e representado como resposta de curvas de ligação em nm. Uma figura representativa mostrando a ponta do biossensor com e sem ligação do analito e o deslocamento do comprimento de onda espectral correspondente (nm) é mostrada na

Discussão

A capacidade de analisar a cinética de ligação de qualquer proteína ao seu substrato usando BLI fornece os meios para isolar e caracterizar os fatores específicos (como sequência, estrutura ou comprimento de um DNA) que regem as interações proteína-DNA dentro da célula19. O sistema Octeto N1, que se baseia nos princípios da interferometria de biocamadas, permite a medição quantitativa das interações proteína-proteína e proteína-ácidos nucléicos...

Divulgações

Os autores não têm conflito de interesse a declarar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado por doações da National Science Foundation (1929346) e da American Cancer Society (RSG-21-028-01). Também gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório Balakrishnan pelas discussões úteis.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 mL Micro Centrifuge TubesGlobe Scientific111554A
96 Well Standard Black MicroplateDot Scientific4ti-0223
Biotinylated poly dT OligonucleotideIDT
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153-10G
Dithiothreitol (DTT)Dot ScientificDSD11000-10
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Dot ScientificDSE57020-500
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-500
Kimtec Science Kimwipes Kimtech34120
Octet N1 SoftwareSartorius 1.4.0.13
Octet SA Biosensor Sartorius 18-5019
PBS pH 7.2 (10x)Gibco1666711
Personal Assay Octet N1 SystemSartorius 
Phosphoric Acid Ward's Science470302-024
Sodium Chloride (NaCl)Dot ScientificDSS23020-5000
Tris BaseDot ScientificDST60040-5000
Tween20 Bio-Rad170-6531

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