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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo articolo descrive un protocollo per lo studio delle interazioni DNA-proteina utilizzando un sistema di interferometria a biostrato (BLI) basato su streptavidina. Delinea i passaggi e le considerazioni essenziali per l'utilizzo della cinetica di legame di base o avanzata per determinare l'affinità di legame all'equilibrio (KD) dell'interazione.

Abstract

Le interazioni proteina-DNA sono alla base dei processi cellulari essenziali. La comprensione di queste interazioni è fondamentale per chiarire i meccanismi molecolari di vari percorsi. Fattori chiave come la struttura, la sequenza e la lunghezza di una molecola di DNA possono influenzare in modo significativo il legame proteico. L'interferometria a biostrato (BLI) è una tecnica label-free che misura la cinetica di legame tra le molecole, offrendo un approccio diretto e preciso per studiare quantitativamente le interazioni proteina-DNA. Uno dei principali vantaggi del BLI rispetto ai tradizionali metodi basati su gel è la sua capacità di fornire dati in tempo reale sulla cinetica di legame, consentendo una misurazione accurata della costante di dissociazione di equilibrio (KD) per le interazioni dinamiche proteina-DNA. Questo articolo presenta un protocollo di base per determinare il valore KD dell'interazione tra una proteina di replicazione del DNA, la proteina di replicazione A (RPA) e un substrato di DNA a filamento singolo (ssDNA). L'RPA lega l'ssDNA con un'elevata affinità, ma deve anche essere facilmente spostato per facilitare le successive interazioni proteiche all'interno dei percorsi biologici. Nel test BLI descritto, l'ssDNA biotinilato viene immobilizzato su un biosensore rivestito di streptavidina. Vengono quindi misurate le cinetiche di legame (associazione e dissociazione) dell'RPA al DNA legato al biosensore. I dati risultanti vengono analizzati per ricavare valori precisi per la costante di velocità di associazione (ka), la costante di velocità di dissociazione (kd) e la costante di legame di equilibrio (KD) utilizzando il software di sistema.

Introduzione

Le proteine cellulari svolgono un ruolo fondamentale nell'orchestrare i complessi processi biologici che avvengono all'interno degli organismi viventi. Il funzionamento ottimale di queste vie dipende dall'interazione tra le proteine e altre biomolecole all'interno della cellula, comprese le interazioni con le proteine partner e gli acidi nucleici1. Pertanto, la comprensione delle complessità dei processi cellulari richiede una profonda comprensione delle dinamiche delle interazioni proteina-acido nucleico.

Tradizionalmente, le interazioni proteina-acido nucleico sono state studiate utilizzando saggi elettroforetici di spostamento su gel di mobilità (EMSA)2. In questo saggio, le proteine vengono incubate con oligonucleotidi sintetici (DNA/RNA, contenenti lunghezze o sequenze specifiche) per un breve periodo, e la reazione viene quindi elettroforesata su un gel di poliacrilammide nativo (PAGE) 3,4,5. Per consentire la visualizzazione dell'interazione proteina-oligonucleotide, gli oligonucleotidi sono tipicamente marcati radioattivamente con 32P o marcati con molecole fluorescenti. Se la proteina interagisce e si lega all'oligonucleotide, il legame della proteina rallenta la mobilità dell'acido nucleico all'interno del gel 6,7. Pertanto, questo metodo è anche chiamato test di gel shift o gel retardation. Sebbene questo metodo sia stato ampiamente utilizzato, ci sono alcune limitazioni da considerare durante l'utilizzo di questo metodo per ottenere valori KD, tra cui la bassa risoluzione da legame debole o dinamico, la necessità di una concentrazione significativamente elevata di proteine e un maggiore sforzo. Inoltre, gli EMSA non sono saggi in tempo reale e, pertanto, non possono misurare con precisione la cinetica di legame 7,8.

Tecniche innovative come la risonanza plasmonica di superficie (SPR) e l'interferometria a biostrato (BLI) sono emerse per superare queste limitazioni 9,10,11,12. Entrambi i metodi misurano le costanti di tasso di associazione/dissociazione e le costanti di affinità tra le molecole in modo privo di marcature. Poiché non è necessario marcare la proteina, queste tecniche eliminano il rischio di alterare le proprietà della proteina o di bloccare il sito di legame. Nella SPR, la luce polarizzata interagisce con un sensore (una pellicola metallica conduttrice, tipicamente oro), generando un'onda di densità di carica elettronica chiamata plasmone. Questa interazione diminuisce l'intensità del raggio riflesso e un rilevatore misura la variazione dell'angolo specifico, noto come angolo di risonanza13. Per studiare le interazioni ligando (acido nucleico) - analita (proteina), il ligando viene immobilizzato in una cella di flusso sul chip del sensore e l'analita viene iniettato nella cella di flusso contenente il ligando immobilizzato. Legando l'analita al ligando, si verifica una variazione rilevabile dell'indice di rifrazione vicino alla superficie del sensore, consentendo così la misurazione delle interazioni molecolari 14,15,16.

L'interferometria a biostrati (BLI) misura il modello di interferenza della luce quando la luce passa attraverso una fibra ottica con un biostrato, composto da un ligando (esca) e dal suo partner legante (analita), sulla superficie inferiore della punta del biosensore. La luce viene trasmessa attraverso la punta e riflessa ad entrambe le estremità del biostrato grazie alle proprietà del biostrato. Lo spessore del biostrato è proporzionale al numero di molecole legate che influenzano il modello della luce riflessa. Confrontando la variazione della curva di intensità relativa rispetto a lunghezza d'onda causata dall'interferenza tra la luce riflessa dall'interfaccia di riferimento e dall'interfaccia biostrato/tampone, è possibile determinare la variazione di spessore del biostrato. Quando più molecole si legano, si verifica uno spostamento maggiore, rendendo BLI un potente strumento per studiare le interazioni biomolecolari in tempo reale. La variazione del modello di interferenza viene misurata e rappresentata su un sensorgram come uno spostamento spettrale17,18 (Figura 1A). La natura dell'interazione di legame può essere determinata con precisione utilizzando controlli appropriati, come una configurazione priva delle concentrazioni variabili del ligando del partner di legame 19,20,21. Rispetto all'SPR, il BLI è conveniente e facile da usare, il che lo rende accessibile a un'ampia gamma di ricercatori. Inoltre, i campioni utilizzati nel BLI rimangono intatti se non vi è degradazione o aggregazione. Ciò consente di recuperarli e riutilizzarli, riducendo così al minimo gli sprechi. Lo strumento BLI funziona senza l'uso di microfluidica, eliminando così gli svantaggi del sistema fluidico, come la necessità di manutenzione/cura, l'intasamento o l'uso di tamponi degassati. Inoltre, riduce al minimo il rischio di contaminazione dello strumento a causa di campioni di proteine grezze o non filtrate.

In un esperimento BLI, il biostrato viene stabilito immobilizzando la molecola dell'esca sul biosensore. Il biostrato dei biosensori può interagire con vari tag, rendendo possibile lo studio delle interazioni tra le molecole (inclusi acidi nucleici, proteine, anticorpi, virus, piccole molecole, ecc.)22. Per stabilire questa immobilizzazione possono essere impiegate varie strategie di cattura, tra cui biotina/streptavidina, 6X-His-tag/Ni-NTA, FLAG/anti-FLAG, GST/anti-GST e anticorpo/anti-Fc. Il mantenimento della struttura e dell'attività del ligando immobilizzato è fondamentale nella scelta del biosensore. I cambiamenti nel modello di interferenza sono influenzati dalla quantità di molecola legata e dalla matrice23. Le interazioni proteina-acido nucleico sono studiate utilizzando sonde oligonucleotidiche biotinilate che possono essere immobilizzate su biosensori rivestiti di streptavidina. I campioni proteici che si prevede interagiscano con l'esca immobilizzata (oligonucleotide) sono in contatto con l'oligonucleotide per un periodo specifico in un tampone di legame per misurare l'associazione e successivamente sono passati a un tampone di legame bianco per misurare la dissociazione. Una rappresentazione schematica del legame dell'analita e delle corrispondenti variazioni nella curva di legame è mostrata nella Figura 1B. Inoltre, le interazioni proteina-nucleica possono anche essere studiate attraverso una via di immobilizzazione inversa, in cui la proteina (esca) viene catturata dal biosensore e interagisce con l'acido nucleico (analita).

Attualmente, sono disponibili in commercio diversi strumenti che funzionano secondo il principio dell'interferometria a biostrato. Uno strumento semplice ed economico è noto come sistema Octet N1, che presenta un unico canale per il throughput dei dati. Richiede un'operazione manuale, consuma un volume minimo del campione (4 μL) ed esegue l'analisi del campione a temperatura ambiente 9,23. Questo strumento a canale singolo è in grado di rilevare l'efficienza di legame di proteine più grandi di 10 kDa e misura le affinità nell'intervallo da micromolare (μM) a nanomolare (nM)11,12. Sono disponibili anche alcuni strumenti con 2, 8, 16 e 96 canali per la lettura automatizzata dei dati e compatibili con entrambi i formati19,20 a 96 o 384 pozzetti. Alcuni di questi strumenti possono anche operare tra 4 °C e 40 °C, rilevare biomolecole con peso molecolare fino a 150 Da, e misurare affinità all'interno dell'intervallo millimolare a picomolare19,21. Mentre il sistema descritto è conveniente, gli strumenti più costosi con più canali offrono un'elaborazione automatica ad alta produttività. Questi sistemi avanzati sono comunemente impiegati nella caratterizzazione e nello sviluppo di molecole di farmaci biologici 9,23.

L'attuale protocollo descrive le fasi coinvolte nella misurazione dei parametri di legame della proteina di replicazione A (RPA) al DNA a filamento singolo (ss-DNA) utilizzando il sistema di interferometria manuale a biostrato a canale singolo. L'RPA è un complesso proteico eterotrimerico che lega l'ssDNA e che svolge un ruolo critico in quasi tutti gli aspetti del metabolismo del DNA, tra cui la replicazione, la riparazione e la ricombinazione del DNA24. A causa della sua elevata affinità con l'ssDNA (misurata nell'intervallo sub-nanomolare), può legarsi rapidamente all'ssDNA generato durante varie transazioni di DNA, proteggerlo dalla degradazione nucleolitica e prevenire il legame estemporaneo di altre proteine a valle. L'RPA svolge anche un ruolo fondamentale nel prevenire la formazione di strutture secondarie e terziarie non canoniche, come i G-quadruplex25. L'RPA umana è composta da tre sottounità: RPA70 (70 kDa), RPA32 (32 kDa) e RPA14 (14 kDa), chiamate anche RPA 1, RPA 2 e RPA 3, rispettivamente 24,26,27. Queste subunità ospitano sei pieghe di legame oligonucleotidiche/oligosaccaridiche (OB-folds) marcate da A a F. Tra questi, i domini di legame del DNA (DBD) si trovano sulle subunità28 di RPA1 (DBD-A, DBD-B, DBD-C) e RPA2 (DBD-D). Inizialmente si pensava che, a seconda della lunghezza del DNA, l'RPA esibisse diverse modalità di legame in cui diversi DBD erano impegnati a specifiche lunghezze di DNA29. I dati provenienti da recenti studi strutturali e su singole molecole hanno contribuito a perfezionare questi modelli per suggerire che il legame di diversi DBD di RPA è più dinamico di quanto inizialmente suggerito 30,31,32,33,34,35,36. Questa caratteristica della proprietà di legame dinamico è essenziale per la funzione dell'RPA perché l'RPA dovrebbe essere in grado di legarsi strettamente al substrato del DNA durante determinate transazioni del DNA; Tuttavia, dovrebbe anche essere in grado di spostarsi dal substrato per passare il substrato alla proteina successiva durante il processo biologico. Utilizzando diverse tecniche biochimiche, il KD per RPA è stato determinato essere di circa 0,4 nM per un substrato ss-(polydT)30 e 80 nM e 200 nM per substrati ss-(polydA)257 e dG-(polydG)602 rispettivamente, come misurato dall'anisotropia di polarizzazione della fluorescenza (FPA)37,38. L'RPA mostra anche una preferenza circa 50 volte superiore per il legame con sequenze ricche di pirimidina rispetto alle purine. Sebbene diverse tecniche biochimiche abbiano determinato diverse misurazioni di KD per RPA, tutte le misurazioni sono state nell'intervallo nanomolare, suggerendo un'elevata affinità di legame dell'RPA per l'ssDNA. Utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRFM), si è scoperto che, in base alla lunghezza del DNA, l'RPA si associa ad almeno due modalità di legame: una definita a dissociazione veloce (Kd, 680 pM) e una a dissociazione lenta (Kd, 60 pM)33,39. Dato il suo coinvolgimento fondamentale in quasi tutte le vie metaboliche del DNA, c'è stato un forte interesse nella creazione di inibitori che possono ostacolare l'interazione tra RPA e DNA a filamento singolo (ssDNA). Questi inibitori chimici sono vitali nell'interrompere la risposta al danno al DNA, rendendo le cellule tumorali più suscettibili agli agenti dannosi per il DNA impiegati nelle terapie cliniche. L'utilizzo del test BLI consente una valutazione quantitativa precisa dell'efficacia dell'inibitore nella modulazione della funzione di legame dell'RPA40,41.

La configurazione BLI consente impostazioni distinte: cinetica di base e avanzata. Nella modalità cinetica di base, il test comprende tre fasi principali: stabilimento, associazione e dissociazione della linea di base. Tuttavia, prima di eseguire questo test, i biosensori devono essere rivestiti separatamente, utilizzando lo strumento o manualmente sul banco di laboratorio. Al contrario, la modalità cinetica avanzata si estende oltre i tre passaggi fondamentali, consentendo l'incorporazione di passaggi aggiuntivi. Questi passaggi supplementari possono servire a vari scopi, come condizionare il biosensore alle alterazioni del tampone o facilitare il rilevamento di successive interazioni proteiche. La cinetica avanzata consente inoltre di spogliare il biosensore dell'analita con un buon metodo di rigenerazione per un potenziale riutilizzo, a condizione che l'esca e il biosensore rimangano intatti. In genere, la cinetica avanzata viene utilizzata rispetto alla cinetica di base quando il test è coinvolto in più fasi o il test deve essere eseguito in un formato più complesso.

Questo protocollo delinea entrambi i metodi utilizzando la stessa esca [3'Bio-ss-poly (dT)32] e analita (RPA). Per immobilizzare l'esca verrà utilizzato un biosensore rivestito di streptavidina e si otterranno misurazioni KD per l'analita. Questo protocollo descrive un approccio completo per eseguire un test BLI utilizzando un'interferometria a biostrato con strumento a canale singolo, coprendo la preparazione dell'esca del biosensore, le considerazioni sui tamponi e una descrizione dettagliata della procedura.

Protocollo

I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Preparazione dell'esca, dell'analita, dei tamponi e pulizia del drop-holder

  1. Impostazione dello strumento: Accendere lo strumento almeno 1 ora prima di iniziare l'esperimento. Ciò consentirà alla lampada di riscaldarsi.
  2. Preparazione dei tamponi di strippaggio e pulizia
    1. Tampone di stripping: Preparare 50 mL di acido fosforico 0,15 M [pH 2,0]).
    2. Tampone di pulizia: Preparare 10 mL di HCl 0,5 N.
  3. Preparazione del tampone BLI
    1. Preparare 50 mL di 1x tampone BLI (50 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0,1 mg/mL BSA, 1 mM DTT, 0,05% Tween 20). Conservare questo tampone a 4 °C. Prima di impostare questo test, portare il tampone a temperatura ambiente.
      NOTA: Si consiglia vivamente di preparare tamponi freschi per il test, poiché i tamponi invecchiati possono subire alterazioni del pH o la formazione di aggregati e possono presentare contaminazioni microbiche, compromettendo potenzialmente la riproducibilità e l'accuratezza dei risultati. Si sconsiglia l'uso di tamponi che sono stati conservati per più di due settimane.
  4. Preparazione dell'esca/substrato
    1. Preparare 12,5 nM di substrato 3'Bio-ss-poly (dT)32 (5' TTT TTT TTT TTT TTT TT 3'Bio) utilizzando il tampone BLI.
  5. Preparazione di stock di concentrazione proteica
    1. Preparare quattro concentrazioni di RPA (5 nM, 10 nM, 20 nM, 40 nM) utilizzando il tampone BLI. La massima concentrazione della proteina (40 nM) si ottiene diluendo la proteina madre nel tampone BLI. Le diluizioni successive vengono preparate mediante diluizione seriale della soluzione di lavoro da 40 nM. Assicurati che tutte le scorte proteiche siano mantenute in ghiaccio durante l'esperimento per mantenere la stabilità.
  6. Pulizia del portagocce
    1. Aggiungere 4 μl di acqua distillata e pulire il portagocce con un panno privo di lanugine (ripetere 3 volte). Quindi, ripetere questo passaggio con 4 μl di etanolo al 70% e pulire con un panno privo di lanugine. Questa fase garantisce la rimozione dei contaminanti superficiali e delle particelle di polvere.
    2. Aggiungere 4 μl di HCl 0,5 N e lasciarlo nel portagocce per 1 minuto. Puliscilo con un panno privo di lanugine e ripeti questo passaggio ancora una volta. Ciò garantisce una pulizia profonda del portagocce. La pulizia profonda è particolarmente utile per pulire il portagocce da gocce secche dall'uso precedente.
    3. 1Ripetere il passaggio 1 per lavare il portagocce con acqua distillata ed etanolo al 70% e asciugarlo con un panno privo di lanugine. Il portagocce è ora pronto per essere utilizzato.

2. Cinetica di base

  1. Configurazione dello strumento e del software
    1. Aprire il software e selezionare Cinetica di base nel pannello di sinistra (Figura 1 supplementare).
    2. Rimuovere il rack di biosensori dal vassoio (ottenuto da fonti commerciali) e posizionare una piastra a 96 pozzetti nel vassoio. Aggiungere 200 μl di tampone BLI al primo pozzetto. Quindi, riposizionare il vassoio dei biosensori sopra la piastra a 96 pozzetti, assicurandosi che ogni biosensore sia inserito nel pozzetto corrispondente. Il primo biosensore dovrebbe ora essere immerso nel tampone BLI nel primo pozzetto.
    3. Sul software, fare clic su Idrata e accendere il timer per 10 minuti, consentendo al singolo biosensore di idratarsi per almeno 10 minuti. La fase idrata il biosensore per renderlo pronto per il test BLI.
    4. Durante l'idratazione del biosensore, pipettare 250 μl di tampone BLI in due provette da 0,5 mL. Etichettare uno come "A" (associazione) e l'altro come "D" (dissociazione).
    5. Inserire i dettagli sul software (Nome: Rivestimento del substrato e descrizione del saggio: RPA- 3'Bio-ss-poly (dT)32: Basic Kinetics).
    6. Regolare l'impostazione della corsa per ogni fase: Linea di base (30 s), Associazione (120 s), Dissociazione (120 s) (Tabella 1). Tenere acceso lo shaker per il tubo e il supporto per le gocce. La velocità dell'agitatore è impostata a 2200 giri/min (intervallo, 1000–2600 giri/min), il che impedisce gli effetti del trasporto di massa causati dalla diffusione limitata vicino alla superficie del biosensore.
      NOTA: Si consiglia di ottimizzare la durata di ogni fase (basale, caricamento, associazione, dissociazione) durante l'impostazione di un saggio di cinetica di legame per migliorare l'acquisizione dei dati.
  2. Definizione di una curva di base
    1. Posizionare la provetta A nel supporto della provetta e collegare il biosensore idrato al sistema BLI. Far scorrere il supporto della provetta sotto il biosensore (posizione A, Figura 2).
      NOTA: I biosensori non devono essere completamente asciugati in nessun momento durante l'esperimento. Se lasciato asciugare, le letture dell'esperimento possono essere significativamente distorte.
    2. Premi Esegui e segui le istruzioni nel messaggio di richiesta.
    3. Dopo aver completato la linea di base iniziale, aprire il coperchio e aggiungere 4 μL di tampone BLI al supporto per gocce. Farlo scorrere verso destra sotto lo stesso biosensore (posizione B, Figura 2). Chiudere il coperchio e monitorare la curva BLI sul software (Figura 3, curva blu).
    4. Al termine, aprire il coperchio per sostituire la provetta 'A' con 'D' e farla scorrere sotto il biosensore (posizione A, Figura 2). Chiudere il coperchio e procedere con la fase di dissociazione. Al termine, aprire il coperchio, staccare il biosensore, riposizionarlo nel vassoio e assicurarsi che il biosensore sia immerso nel tampone BLI.
    5. Rimuovere il campione/tampone, pulire il supporto per gocce con un tampone prima di asciugarlo con salviette prive di lanugine e rimuovere la provetta "D" dal supporto della provetta.
  3. Rivestimento del substrato
    1. Posizionare la provetta A nel supporto della provetta e collegare il biosensore idrato al sistema BLI. Far scorrere il supporto del tubo sotto il biosensore e premere Esegui.
    2. Dopo la fase iniziale della linea di base, aggiungere 4 μL di substrato da 12,5 nM [3'Bio-ss-poly (dT)32] al supporto per gocce e farlo scorrere sotto il biosensore. Chiudere il coperchio e monitorare la curva BLI sul software. Assicurarsi che questa risposta sia superiore alla linea di base (Figura 3).
      NOTA: La concentrazione del substrato può essere ottimizzata rivestendo i biosensori con diverse concentrazioni (una sola concentrazione per biosensore) e osservando le curve di legame. Una curva di legame con un segnale visibilmente più alto rispetto alla linea di base è sufficiente per confermare il rivestimento del substrato. Il sovraccarico del biosensore può causare ostacoli sterici o affollamento sulla superficie. La Figura 3mostra le curve per cinque concentrazioni di substrato biotinilato 3'Bio-ss-poly (dT)32 . Inoltre, una volta completata la fase di caricamento dell'esca, i biosensori possono essere immersi in un tampone bloccante la streptavidina (biocitina) per 30 secondi, seguito da un lavaggio in tampone BLI. Ciò bloccherà la superficie della streptavidina non legata e impedirà il legame non specifico.
    3. Dopo aver completato la fase di associazione, aprire il coperchio e sostituire la provetta "A" con la provetta "D". Farlo scorrere sotto il biosensore e chiudere il coperchio.
    4. Al termine della fase di dissociazione, aprire il coperchio, staccare il biosensore e posizionarlo nel vassoio del biosensore contenente il tampone BLI. Assicurarsi che il biosensore sia completamente immerso nel tampone e sia adeguatamente idratato per i passaggi successivi. Pulire il supporto per gocce con il tampone per il test, asciugarlo con salviette prive di lanugine e rimuovere la provetta "D" dal supporto della provetta. Il biosensore è ora rivestito con il substrato 3'Bio-ss-poly (dT)32 .
  4. Legame con le proteine
    1. Pipettare 250 μl di tampone BLI in dieci provette per microfuge nere da 0,5 mL. Etichettali da A1 a A5 e da D1 a D5.
    2. In un'altra piastra da 96 pozzetti, aggiungere 200 μl di tampone di stripping nel pozzetto, corrispondente alla posizione del biosensore idratato.
    3. Prima di iniziare il test, pulire il portagocce 3 volte con un tampone BLI.
    4. Apri un nuovo file sul software e seleziona Basic Kinetics nel pannello di sinistra. Assegnare un nome al test e aggiungere la descrizione secondo necessità (Figura 2 supplementare). Regolare le impostazioni di esecuzione in base alle esigenze (Tabella 1).
    5. Posizionare il tubo etichettato A1 nel supporto del tubo e collegare il biosensore rivestito in 3'Bio-ss-poly (dT)32 al sistema BLI. Fai scorrere il tubo sotto il biosensore e premi Esegui.
    6. Dopo aver completato la fase iniziale della linea di base, aprire il coperchio, aggiungere 4 μl di tampone BLI al supporto per gocce e farlo scorrere sotto il biosensore. Questa sarà la concentrazione di proteina 0 nM e servirà come curva di riferimento.
    7. Dopo aver completato la fase di associazione, sostituire il tubo A1 con D1 e farlo scorrere sotto il biosensore.
    8. Una volta completata la fase di dissociazione, rimuovere il biosensore e riporlo nel suo vassoio. Assicurarsi che il biosensore sia completamente immerso nel tampone e adeguatamente idratato per i passaggi successivi. Rimuovere la provetta D1, pulire il supporto per gocce con il tampone di analisi e asciugarlo con un panno privo di lanugine.
    9. Successivamente, si otterrà la curva di legame per un materiale RPA da 5 nM. Compila i dettagli del campione (concentrazione: 5 nM, peso molecolare: 116 KDa] e premi Calc. Questo calcolerà la concentrazione proteica in μg/μL.
    10. Collegare il biosensore rivestito in 3'Bio-ss-poly (dT)32 e inserire la provetta A2 nel supporto della provetta. Fallo scorrere sotto il biosensore e premere Esegui.
    11. Dopo il basale, aggiungere 4 μl di RPA da 5 nM sul portagocce e farlo scorrere sotto il biosensore. Chiudere il coperchio e monitorare la curva di associazione. Il legame delle proteine all'esca può essere visualizzato da una curva che supera la curva di base. Dopo la fase di associazione, sostituire A2 con D2, farlo scorrere sotto il biosensore e completare la fase di dissociazione.
    12. Rimuovere il biosensore, immergerlo nel tampone di stripping per 30 s, quindi immergerlo nel tampone BLI per 3 minuti.
      NOTA: L'efficienza di rigenerazione dipende dall'esca immobilizzata e dall'analita disgregato. Alcuni biosensori immobilizzati possono resistere a dieci o più cicli di rigenerazione. Abbiamo potuto rimuovere il substrato biotinilato di 3'Bio-ss-poly (dT)32 più di tre volte (Figura supplementare 3) senza osservare un cambiamento evidente nella risposta.
    13. Ripetere i passaggi 2.4.9-2.4.12 per le altre tre concentrazioni di RPA 10 nM, 20 nM e 40 nM. Assicurarsi di rimuovere il biosensore per ogni concentrazione.
      NOTA: Per i saggi BLI, gli esperti raccomandano di utilizzare quattro concentrazioni (esclusa la curva di riferimento), comprese all'incirca da 0,1x a 10x il KD previsto per misurazioni cinetiche accurate. Qui, le quattro concentrazioni sono state ottenute mediante diluizioni seriali.
  5. Analisi dei dati e calcolo dei valori KD
    1. Prima di calcolare il valore KD , è necessario ispezionare visivamente il sensorgram per ogni concentrazione di legame RPA sul substrato 3'Bio-ss-poly (dT)32 . Assicurarsi che il segnale BLI aumenti con l'aumentare della concentrazione di RPA fino a saturare il DNA immobilizzato (Figura 4).
      NOTA: Per ottenere risultati affidabili, assicurarsi che almeno quattro concentrazioni proteiche siano legate correttamente al substrato, escludendo la concentrazione di analita di 0 nM. Fare riferimento alla sezione di discussione per risolvere potenziali errori.
    2. Nella tabella "Elenco di esecuzione", controllare Ref per la concentrazione dell'analita di 0 nM come curva di riferimento. Controllare Analizza per tutte le concentrazioni dell'analita.
    3. Quindi, selezionare Inizio di associazione e Inizio di dissociazione per la correzione del passo. Questo allineerà l'inizio dell'associazione con la fine della linea di base e l'inizio della dissociazione con la fine dell'associazione, che di solito è causata da diversi modelli di riflessione tra il supporto della goccia e il tubo se il tampone corrisponde bene.
    4. Selezionare Global Fitting (1:1) per questo test. L'analisi globale calcola i valori KD per un intero insieme di concentrazioni proteiche, mentre l'analisi locale è per una singola concentrazione proteica.
      NOTA: Il software fornito con lo strumento consente solo il montaggio 1:1. Questo potrebbe essere un potenziale avvertimento quando ci si aspetta che l'esca e l'analita si adattino ad altri modelli di adattamento. I dati di questo software possono essere esportati in altri software di plottaggio e inseriti nei modelli di adattamento richiesti.
    5. Quindi, seleziona Analizza. In questo modo verranno calcolati i valori KD, ka/kd (Tabella 2). L'errore ka e kd entro il 10% del valore è generalmente considerato accettabile.
      NOTA: Assicurarsi che questi valori rientrino in limiti ragionevoli. Se l'errore è inferiore al 10%, suggerisce che l'adattamento dei dati è affidabile per lo studio delle interazioni tra molecole biologiche. Inoltre, il KD (costante di dissociazione di equilibrio) calcolato utilizzando questi valori ka e kd dovrebbe essere sufficientemente accurato per la maggior parte delle applicazioni pratiche18.
    6. Per esportare i dati adattati, fare clic con il pulsante destro del mouse sul grafico generato utilizzando i dati analizzati. Scegli Esporta dati, quindi seleziona Testo/Dati. Fare clic su File e sfoglia per salvare i dati in formato '.dat'. Questo file può essere aperto in Microsoft Excel e utilizzato in altri software per la stampa di grafici.
      NOTA: L'adattamento globale considera tutti i dati della curva di legame all'interno del gruppo, mentre l'adattamento locale si concentra esclusivamente sui parametri cinetici per ogni singola concentrazione di analita.

3. Impostazione dello strumento per l'esecuzione di cinetiche avanzate

  1. Aprire il software e selezionare Cinetica avanzata nel pannello di sinistra (Figura supplementare 1).
  2. Posizionare una piastra a 96 pozzetti nel vassoio che contiene i biosensori. Aggiungere 200 μl di tampone BLI in cinque pozzetti. Posizionare il vassoio dei biosensori sulla piastra a 96 pozzetti in modo che cinque biosensori si immergano nel pozzetto contenente il tampone.
  3. Sul software, fare clic su Idrata e accendere il timer per 10 minuti, consentendo al singolo biosensore di idratarsi per almeno 10 minuti.
  4. Mentre i biosensori sono in fase di idratazione, pipettare 250 μL di tampone BLI in dieci provette da centrifuga nere da 0,5 mL. Etichettali da A1 a A5 e da D1 a D5.
  5. Compila i dettagli sul software (Nome: Rivestimento del substrato e descrizione del saggio: RPA-3'Bio-ss-poly (dT)32: Advanced Kinetics).
  6. Immettere la durata di ogni passaggio (Figura 4 supplementare). Basale iniziale (30 s), Carico (120 s), Basale (30 s), Associazione (120 s), Dissociazione (120 s). Regolare le impostazioni di esecuzione in base alle esigenze (Tabella 1).
    1. Compila i dettagli sul software (Concentrazione: 0 nM, Peso molecolare: 116 kDa) e premi Calc.
  7. Posizionare la provetta A1 nel supporto della provetta e collegare il biosensore. Far scorrere il supporto della provetta sotto il biosensore e premere Esegui per ottenere la linea di base iniziale.
  8. Aggiungere 4 μl di substrato da 12,5 nM nel portagocce e farlo scorrere sotto il biosensore. Chiudere il coperchio. Questo caricherà il substrato sul biosensore. Sostituire A1 con D1 nel supporto del tubo e farlo scorrere sotto il biosensore. Questo darà la curva di base.
  9. Pulire il portagocce con un panno privo di lanugine e caricare 4 μl di tampone BLI. Farlo scorrere sotto il biosensore e chiudere il coperchio. Questa sarà la concentrazione proteica di 0 nM e servirà come curva di riferimento.
  10. Dopo aver completato la fase di associazione, far scorrere il tubo D2 sotto il biosensore. Procedere con la fase di dissociazione. Lasciare che la dissociazione si completi.
  11. Staccare il biosensore, rimuovere D2 dal supporto della provetta e pulire il supporto della goccia con un panno privo di lanugine.
  12. Inserisci i dettagli (concentrazione: 5 nM, peso molecolare: 116 kDa) per la prossima seduta e premi Calc.
  13. Collegare il secondo biosensore al sistema BLItz, posizionare la provetta A2 nel supporto della provetta e farla scorrere sotto il biosensore.
  14. Dopo aver stabilito la linea di base iniziale, aggiungere 4 μl di substrato da 12,5 nM nel supporto per gocce. Farlo scorrere sotto il biosensore e chiudere il coperchio. Sostituire il tubo A2 con D3 e farlo scorrere sotto il biosensore. Quindi, aggiungere 4 μl di 10 nM di RPA nel supporto della provetta e farlo scorrere sotto il biosensore.
  15. Dopo l'associazione, far scorrere D4 sotto il biosensore per la dissociazione.
  16. Ripetere i passaggi 3.1.12-3.1.15 per le successive tre concentrazioni di RPA (10 nM, 20 nM, 40 nM). Le curve di legame per queste concentrazioni sono mostrate nella Figura 5.
  17. L'analisi dei dati e il valore KD possono essere adattati con la stessa procedura della cinetica di base del BLI (passaggio 2.5, Tabella 2).

Risultati

Nel BLI, la luce bianca viene riflessa dall'interfaccia del biostrato/tampone e dall'interfaccia di riferimento interna allo spettrometro. Il modello di interferenza risultante viene registrato e lo spostamento spettrale viene misurato per un periodo di tempo e rappresentato come risposta delle curve di legame in nm. Nella Figura 1 è mostrata una figura rappresentativa che mostra la punta del biosensore con e senza legame con l'analita e il corrispondente s...

Discussione

La capacità di analizzare la cinetica di legame di qualsiasi proteina al suo substrato utilizzando BLI fornisce i mezzi per isolare e caratterizzare i fattori specifici (come la sequenza, la struttura o la lunghezza di un DNA) che governano le interazioni proteina-DNA all'interno della cellula19. Il sistema Octet N1, che si basa sui principi dell'interferometria a biostrati, consente la misurazione quantitativa delle interazioni proteina-proteina e proteina-acidi...

Divulgazioni

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da dichiarare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni della National Science Foundation (1929346) e dell'American Cancer Society (RSG-21-028-01). Vorremmo anche ringraziare i membri del laboratorio Balakrishnan per le utili discussioni.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 mL Micro Centrifuge TubesGlobe Scientific111554A
96 Well Standard Black MicroplateDot Scientific4ti-0223
Biotinylated poly dT OligonucleotideIDT
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153-10G
Dithiothreitol (DTT)Dot ScientificDSD11000-10
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Dot ScientificDSE57020-500
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-500
Kimtec Science Kimwipes Kimtech34120
Octet N1 SoftwareSartorius 1.4.0.13
Octet SA Biosensor Sartorius 18-5019
PBS pH 7.2 (10x)Gibco1666711
Personal Assay Octet N1 SystemSartorius 
Phosphoric Acid Ward's Science470302-024
Sodium Chloride (NaCl)Dot ScientificDSS23020-5000
Tris BaseDot ScientificDST60040-5000
Tween20 Bio-Rad170-6531

Riferimenti

  1. Kalodimos, C. G., et al. Structure and flexibility adaptation in non-specific and specific protein-DNA complexes. Science. 305 (5682), 386-389 (2004).
  2. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9 (23), 6505-6525 (1981).
  3. Lane, D., Prentki, P., Chandler, M. Use of gel retardation to analyze protein-nucleic acid interactions. Microbiol Rev. 56 (4), 509-528 (1992).
  4. Dyer, R. B., Herzog, N. K. Immunodepletion EMSA: A novel method to identify proteins in a protein-DNA complex. Nucleic Acids Res. 23 (16), 3345-3346 (1995).
  5. Dudley, R. K. A laboratory guide to in vitro studies of protein-DNA interactions. FEBS Lett. 306, 2-3 (1991).
  6. Tsai, C., Smider, V., Hwang, B. J., Chu, G. Electrophoretic mobility shift assays for protein-DNA complexes involved in DNA repair. Methods Mol Biol. 920, 53-78 (2012).
  7. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).
  8. Heffler, M. A., Walters, R. D., Kugel, J. F. Using electrophoretic mobility shift assays to measure equilibrium dissociation constants: GAL4-p53 binding DNA as a model system. Biochem Mol Biol Educ. 40 (6), 383-387 (2012).
  9. Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. J Vis Exp. (84), e51383 (2014).
  10. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J Pharm Biomed Anal. 72, 150-154 (2013).
  11. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
  12. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).
  13. Schasfoort, R. B. M., Tudos, A. J. . Handbook of surface plasmon resonance. , (2008).
  14. Douzi, B. Surface plasmon resonance: A sensitive tool to study protein-protein interactions. Methods Mol Biol. 2715, 363-382 (2024).
  15. Douzi, B. Protein-protein interactions: Surface plasmon resonance. Methods Mol Biol. 1615, 257-275 (2017).
  16. Drescher, D. G., Selvakumar, D., Drescher, M. J. Analysis of protein interactions by surface plasmon resonance. Adv Protein Chem Struct Biol. 110, 1-30 (2018).
  17. Martin, S. R., Ramos, A., Masino, L. Biolayer interferometry: Protein-RNA interactions. Methods Mol Biol. 2263, 351-368 (2021).
  18. Apiyo, D. . Biomolecular binding kinetics assays on the Octet BLI platform. , (2022).
  19. Barrows, J. K., Van Dyke, M. W. Biolayer interferometry for DNA-protein interactions. PLoS One. 17 (2), e0263322 (2022).
  20. Desai, M., Di, R., Fan, H. Application of biolayer interferometry (BLI) for studying protein-protein interactions in transcription. J Vis Exp. (149), e59687 (2019).
  21. Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic acid interactions by biolayer interferometry. Curr Protoc Protein Sci. 79, 19.25.1-19.25.26 (2015).
  22. Petersen, R. L. Strategies using bio-layer interferometry biosensor technology for vaccine research and development. Biosensors (Basel). 7 (4), 49 (2017).
  23. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization. Comb Chem High Throughput Screen. 12 (8), 791-800 (2009).
  24. Wold, M. S. Replication protein A: A heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism. Annu Rev Biochem. 66, 61-92 (1997).
  25. Qureshi, M. H., Ray, S., Sewell, A. L., Basu, S., Balci, H. Replication protein A unfolds G-quadruplex structures with varying degrees of efficiency. J Phys Chem B. 116 (19), 5588-5594 (2012).
  26. Wold, M. S., Kelly, T. Purification and characterization of replication protein A, a cellular protein required for in vitro replication of simian virus 40 DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (8), 2523-2527 (1988).
  27. Bochkareva, E., Korolev, S., Lees-Miller, S. P., Bochkarev, A. Structure of the RPA trimerization core and its role in the multistep DNA-binding mechanism of RPA. EMBO J. 21 (7), 1855-1863 (2002).
  28. Brosey, C. A., et al. NMR analysis of the architecture and functional remodeling of a modular multidomain protein, RPA. J Am Chem Soc. 131 (18), 6346-6347 (2009).
  29. Fanning, E., Klimovich, V., Nager, A. R. A dynamic model for replication protein A (RPA) function in DNA processing pathways. Nucleic Acids Res. 34 (15), 4126-4137 (2006).
  30. Gibb, B., et al. Protein dynamics during presynaptic-complex assembly on individual single-stranded DNA molecules. Nat Struct Mol Biol. 21 (10), 893-900 (2014).
  31. Nguyen, B., et al. Diffusion of human replication protein A along single-stranded DNA. J Mol Biol. 426 (19), 3246-3261 (2014).
  32. Brosey, C. A., et al. Functional dynamics in replication protein A DNA binding and protein recruitment domains. Structure. 23 (6), 1028-1038 (2015).
  33. Chen, R., Subramanyam, S., Elcock, A. H., Spies, M., Wold, M. S. Dynamic binding of replication protein a is required for DNA repair. Nucleic Acids Res. 44 (12), 5758-5772 (2016).
  34. Kemmerich, F. E., et al. Force regulated dynamics of RPA on a DNA fork. Nucleic Acids Res. 44 (12), 5837-5848 (2016).
  35. Pokhrel, N., et al. Dynamics and selective remodeling of the DNA-binding domains of RPA. Nat Struct Mol Biol. 26 (2), 129-136 (2019).
  36. Wang, Q. M., et al. Human replication protein A induces dynamic changes in single-stranded DNA and RNA structures. J Biol Chem. 294 (38), 13915-13927 (2019).
  37. Wyka, I. M., Dhar, K., Binz, S. K., Wold, M. S. Replication protein A interactions with DNA: Differential binding of the core domains and analysis of the DNA interaction surface. Biochemistry. 42 (44), 12909-12918 (2003).
  38. Kim, C., Snyder, R. O., Wold, M. S. Binding properties of replication protein A from human and yeast cells. Mol Cell Biol. 12 (7), 3050-3059 (1992).
  39. Caldwell, C. C., Spies, M. Dynamic elements of replication protein A at the crossroads of DNA replication, recombination, and repair. Crit Rev Biochem Mol Biol. 55 (5), 482-507 (2020).
  40. Mishra, A. K., Dormi, S. S., Turchi, A. M., Woods, D. S., Turchi, J. J. Chemical inhibitor targeting the replication protein A-DNA interaction increases the efficacy of Pt-based chemotherapy in lung and ovarian cancer. Biochem Pharmacol. 93 (1), 25-33 (2015).
  41. Gavande, N. S., et al. Structure-guided optimization of replication Protein A (RPA)-DNA interaction inhibitors. ACS Med Chem Lett. 11 (6), 1118-1124 (2020).
  42. Ana Jug, T. B., Janez Ilaš, . Biolayer interferometry and its applications in drug discovery and development. TrAC Trends Anal Chem. 176, 117741 (2024).
  43. . Using BLI for viral and lipid-based vector analytics Available from: https://www.news-medical.net/whitepaper/20230322/Using-BLI-for-viral-and-lipid-based-vector-analytics.aspx (2023)
  44. Noy-Porat, T., et al. Characterization of antibody-antigen interactions using biolayer interferometry. STAR Protoc. 2 (4), 100836 (2021).
  45. Onyekachi Ononye, S. S., et al. Biochemical impact of p300-mediated acetylation of replication protein A: Implications for DNA metabolic pathway choice. bioRxiv. , (2024).
  46. Weeramange, C. J., Fairlamb, M. S., Singh, D., Fenton, A. W., Swint-Kruse, L. The strengths and limitations of using biolayer interferometry to monitor equilibrium titrations of biomolecules. Protein Sci. 29 (4), 1018-1034 (2020).
  47. Artem Stetsenko, A. G. An Overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization. Crystals. 7 (7), 197 (2017).
  48. Hubbe, M. A., Szlek, D. B., Vera, R. E. Detergency mechanisms and cellulosic surfaces: A review. BioResources. 17 (4), 7167-7249 (2022).
  49. . Research the Industry Standard for Label-Free of Biomolecular Interactions Analysis (BIA) Available from: https://www.sartorius.com/en/products/biolayer-interferometry/bli-resources (2021)
  50. . Octet NTA Biosensor Kinetic Assays Available from: https://www.sartorius.com/resource/blob/552398/b27ccc2fdfde7a9320909572ced3f6a1/ni-nta-biosensor-kinetic-assays-technical-note-en-sartorius-data.pdf (2024)
  51. . Application Guides: Kinetics and affinity measurements with Biacore systems Available from: https://cdn.cytivalifesciences.com/api/public/content/digi-33042-pdf (2021)

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