JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול לחקר אינטראקציות דנ"א-חלבון באמצעות מערכת אינטרפרומטריה ביו-שכבתית מבוססת סטרפטווידין (BLI). הוא מתאר את השלבים והשיקולים החיוניים לשימוש בקינטיקה מחייבת בסיסית או מתקדמת כדי לקבוע את זיקת קשירת שיווי המשקל (KD) של האינטראקציה.

Abstract

אינטראקציות חלבון-דנ"א עומדות בבסיס תהליכים תאיים חיוניים. הבנת אינטראקציות אלה היא קריטית להבהרת המנגנונים המולקולריים של מסלולים שונים. גורמי מפתח כגון מבנה, רצף ואורך של מולקולת דנ"א יכולים להשפיע באופן משמעותי על קשירת חלבונים. אינטרפרומטריה ביו-שכבתית (BLI) היא טכניקה נטולת תוויות המודדת קינטיקה של קשירה בין מולקולות, ומציעה גישה פשוטה ומדויקת למחקר כמותי של אינטראקציות חלבון-דנ"א. יתרון מרכזי של BLI על פני שיטות מסורתיות מבוססות ג'ל הוא יכולתו לספק נתונים בזמן אמת על קינטיקה קשירה, המאפשרת מדידה מדויקת של קבוע דיסוציאציה שיווי משקל (KD) עבור אינטראקציות חלבון-DNA דינמיות. מאמר זה מציג פרוטוקול בסיסי לקביעת ערך KD של האינטראקציה בין חלבון שכפול DNA, חלבון שכפול A (RPA) ומצע DNA חד-גדילי (ssDNA). RPA קושר ssDNA עם זיקה גבוהה, אך יש גם לעקור אותו בקלות כדי להקל על אינטראקציות חלבונים עוקבות בתוך מסלולים ביולוגיים. בבדיקת BLI המתוארת, ssDNA ביוטינילציה משותק על ביוסנסור מצופה סטרפטווידין. לאחר מכן נמדדת הקינטיקה הקושרת (אסוציאציה ודיסוציאציה) של RPA לדנ"א הקשור לביוסנסורים. הנתונים המתקבלים מנותחים כדי לגזור ערכים מדויקים עבור קבוע קצב האסוציאציה (ka), קבוע קצב הדיסוציאציה (kd) וקבוע קשירת שיווי משקל (KD) באמצעות תוכנת מערכת.

Introduction

חלבונים תאיים ממלאים תפקיד מרכזי בתזמור התהליכים הביולוגיים המורכבים המתרחשים בתוך אורגניזמים חיים. התפקוד המיטבי של מסלולים אלה תלוי ביחסי הגומלין בין חלבונים לבין ביומולקולות אחרות בתוך התא, כולל אינטראקציות עם חלבונים שותפים וחומצות גרעין1. לפיכך, הבנת המורכבות של תהליכים תאיים מחייבת הבנה עמוקה של הדינמיקה של אינטראקציות חלבון-חומצות גרעין.

באופן מסורתי, אינטראקציות חלבון-חומצות גרעין נחקרו באמצעות מבחני שינוי ג'ל ניידות אלקטרופורטית (EMSAs)2. בבדיקה זו, חלבונים מודגרים עם אוליגונוקלאוטידים סינתטיים (DNA/RNA, המכילים אורכים או רצפים ספציפיים) לתקופה קצרה, ולאחר מכן התגובה עוברת אלקטרופורזה על ג'ל פוליאקרילאמיד מקורי (PAGE) 3,4,5. כדי לאפשר הדמיה של האינטראקציה חלבון-אוליגונוקלאוטידים, האוליגונוקלאוטידים בדרך כלל מסומנים רדיואקטיבית עם 32P או מתויגים במולקולות פלואורסצנטיות. אם החלבון מקיים אינטראקציה וקושר את האוליגונוקלאוטיד אז הקישור של החלבון מאט את הניידות של חומצת הגרעין בתוך הג'ל 6,7. לכן, שיטה זו נקראת גם שינוי ג'ל או בדיקת פיגור ג'ל. למרות ששיטה זו נמצאת בשימוש נרחב, ישנן מספר מגבלות שיש לקחת בחשבון בעת השימוש בשיטה זו כדי לקבל ערכי KD, כולל רזולוציה נמוכה מקשירה חלשה או דינמית, הדרישה לריכוז גבוה משמעותית של חלבונים ומאמץ רב יותר. בנוסף, EMSAs אינם בדיקות בזמן אמת, ולכן אינם יכולים למדוד במדויק קינטיקה מחייבת 7,8.

טכניקות חדשניות כגון תהודה פלסמונית פני השטח (SPR) ואינטרפרומטריה biolayer (BLI) התפתחו כדי להתגבר על מגבלות אלה 9,10,11,12. שתי השיטות מודדות קבועי קצב אסוציאציה/דיסוציאציה וקבועי זיקה בין מולקולות באופן נטול תוויות. מכיוון שהחלבון אינו נדרש להיות מתויג, טכניקות אלה מבטלות את הסיכון לשנות את תכונות החלבון או לחסום את אתר הקשירה. ב- SPR, אור מקוטב מתקשר עם חיישן (סרט מוליך מתכת, בדרך כלל זהב), ויוצר גל צפיפות מטען אלקטרונים הנקרא פלסמון. אינטראקציה זו מפחיתה את עוצמת הקרן המוחזרת וגלאי מודד את השינוי בזווית הספציפית, המכונה זווית תהודה13. כדי לחקור אינטראקציות ליגנד (חומצת גרעין) - אנליט (חלבון), הליגנד משותק בתא זרימה אחד על שבב החיישן, והאנליט מוזרק לתא הזרימה המכיל את הליגנד המשותק. בעת קשירת האנליט לליגנד, יש שינוי ניתן לזיהוי במקדם השבירה ליד פני החיישן, ובכך מאפשר מדידה של אינטראקציות מולקולריות 14,15,16.

אינטרפרומטריה ביו-שכבתית (BLI) מודדת את דפוס התאבכות האור כאשר האור עובר דרך סיב אופטי עם שכבה ביולוגית, המורכבת מליגנד (פיתיון) ושותפו הקושר (אנליט), במשטח התחתון של קצה הביו-סנסור. האור מועבר דרך הקצה ומוחזר בשני הקצוות של השכבה הביולוגית בשל תכונות השכבה הביולוגית. עובי השכבה הביולוגית פרופורציונלי למספר המולקולות הכבולות המשפיעות על תבנית האור המוחזר. על ידי השוואת השינוי של העקומה של עוצמה יחסית לעומת . אורך גל הנגרם על ידי התאבכות בין האור המוחזר מממשק הייחוס לבין ממשק השכבה הביולוגית/חיץ, ניתן לקבוע את שינוי העובי של השכבה הביולוגית. כאשר יותר מולקולות נקשרות, מתרחש שינוי גדול יותר, מה שהופך את BLI לכלי רב עוצמה לחקר אינטראקציות ביומולקולריות בזמן אמת. השינוי בתבנית ההתאבכות נמדד ומיוצג על גבי חיישן כשינוי ספקטרלי17,18 (איור 1A). ניתן לקבוע במדויק את אופי האינטראקציה הקושרת באמצעות בקרות מתאימות, כגון מערך חסר את ריכוזי הליגנד המשתנים של השותף הקושר 19,20,21. בהשוואה ל- SPR, BLI הוא חסכוני וידידותי למשתמש, מה שהופך אותו לנגיש למגוון רחב של חוקרים. בנוסף, דגימות המשמשות ב- BLI נשארות שלמות אם אין השפלה או צבירה. זה מאפשר לשחזר אותם ולעשות בהם שימוש חוזר, ובכך למזער את הפסולת. מכשיר BLI פועל ללא שימוש במיקרופלואידיקה, ובכך מבטל את החסרונות של מערכת הפלואידיקה, כגון הצורך בתחזוקה/טיפול, סתימה או שימוש במאגרים נטולי גזים. זה גם ממזער את הסיכון לזיהום המכשיר עקב דגימות חלבון לא מסוננות או גולמיות.

בניסוי BLI, השכבה הביולוגית נוצרת על ידי השתקת מולקולת הפיתיון על הביו-סנסור. השכבה הביולוגית של חיישנים ביולוגיים יכולה לתקשר עם תגים שונים, מה שמאפשר לחקור את האינטראקציות בין מולקולות (כולל חומצות גרעין, חלבונים, נוגדנים, וירוסים, מולקולות קטנות וכו ')22. ניתן להשתמש באסטרטגיות לכידה שונות, כולל ביוטין/סטרפטווידין, 6X-His-tag/Ni-NTA, FLAG/anti-FLAG, GST/anti-GST, ונוגדנים/אנטי-Fc, כדי לבסס אימוביליזציה זו. שמירה על המבנה והפעילות של הליגנד המשותק היא חיונית בעת בחירת הביוסנסורה. השינויים בתבנית ההתאבכות מושפעים מכמות המולקולה הקשורה וכן מהמטריצה23. אינטראקציות חלבון-חומצת גרעין נחקרות באמצעות בדיקות אוליגונוקלאוטיד ביוטינילציה שניתן לשתק על ביו-חיישנים מצופים סטרפטווידין. דגימות חלבון הצפויות לקיים אינטראקציה עם הפיתיון המשותק (אוליגונוקלאוטיד ) נמצאות במגע עם האוליגונוקלאוטיד לתקופה מסוימת במאגר קשירה למדידת אסוציאציה, ולאחר מכן עברו למאגר קשירה ריק כדי למדוד דיסוציאציה. ייצוג סכמטי של קשירה אנליטית ושינויים מתאימים בעקומת הקשירה מוצג באיור 1B. בנוסף, אינטראקציות חלבון-גרעין יכולות להיחקר גם על ידי מסלול אימוביליזציה הפוך, שבו החלבון (פיתיון) נלכד על הביוסנסור ומקיים אינטראקציה עם חומצת הגרעין (אנליטית).

נכון לעכשיו, מכשירים מרובים זמינים באופן מסחרי הפועלים על העיקרון של אינטרפרומטריה biolayer. מכשיר פשוט וחסכוני ידוע בשם מערכת Octet N1, הכוללת ערוץ יחיד להעברת נתונים. הוא דורש פעולה ידנית, צורך נפח דגימה מינימלי (4 μL), ומבצע ניתוח דגימות בטמפרטורות סביבה 9,23. מכשיר חד-ערוצי זה יכול לזהות יעילות קשירה של חלבונים הגדולים מ-10 kDa ומודד זיקות בתחום המיקרומולרי (μM) לננו-מולארי (nM)11,12. מכשירים מסוימים עם 2, 8, 16 ו- 96 ערוצים לקריאת נתונים אוטומטית זמינים גם הם ותואמים לפורמטים של 96 או 384 באר19,20. חלק ממכשירים אלה יכולים גם לפעול בין 4 ° C ל 40 ° C, לזהות ביומולקולות עם משקל מולקולרי נמוך כמו 150 Da, ולמדוד זיקות בטווח מילימולרי עד פיקומולרי19,21. בעוד המערכת המתוארת היא חסכונית, המכשירים היקרים יותר עם ערוצים מרובים מציעים עיבוד אוטומטי בתפוקה גבוהה. מערכות מתקדמות אלה משמשות בדרך כלל באפיון ופיתוח מולקולות תרופה ביולוגיות 9,23.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השלבים הכרוכים במדידת פרמטרי הקישור של חלבון שכפול A (RPA) לדנ"א חד-גדילי (ss-DNA) באמצעות מערכת אינטרפרומטריה חד-ערוצית ידנית של שכבה ביולוגית. RPA הוא קומפלקס חלבונים הטרוטרימרי, קושר ssDNA הממלא תפקיד קריטי כמעט בכל ההיבטים של חילוף החומרים של DNA, כולל שכפול, תיקון ורקומבינציה של DNA24. בשל זיקתו הגבוהה ל-ssDNA (הנמדד בטווח התת-ננו-מולרי), הוא יכול להיקשר במהירות ל-ssDNA שנוצר במהלך עסקאות דנ"א שונות, להגן עליו מפני פירוק נוקלאוליטי ולמנוע קשירה מאולתרת של חלבונים אחרים במורד הזרם. RPA גם משחק תפקיד קריטי במניעת היווצרות של מבנים משניים ושלישוניים שאינם קנוניים, כגון G-quadruplexes25. RPA אנושי מורכב משלוש יחידות משנה: RPA70 (70 kDa), RPA32 (32 kDa) ו-RPA14 (14 kDa), הנקראות גם RPA 1, RPA 2 ו-RPA 3, בהתאמה 24,26,27. תת-יחידות אלה מכילות שישה קיפולי קישור אוליגונוקלאוטידים/אוליגוסכרידים (OB-folds) המסומנים A עד F. בין אלה, תחומי קשירת הדנ"א (DBD) נמצאים בתת-יחידות RPA1 (DBD-A, DBD-B, DBD-C) ו-RPA2 (DBD-D)28. תחילה חשבו כי בהתאם לאורך הדנ"א, RPA מציג מצבי קישור שונים שבהם DBD שונים היו מעורבים באורכי דנ"א ספציפיים29. נתונים ממחקרים מבניים ומחקרי מולקולות בודדות שנערכו לאחרונה סייעו לחדד מודלים אלה כדי להציע כי הקישור של DBD שונים של RPA הוא דינמי יותר ממה שהוצע בתחילה 30,31,32,33,34,35,36. תכונה זו של תכונת הקשירה הדינמית חיונית לתפקוד של RPA מכיוון ש- RPA אמור להיות מסוגל להיקשר בחוזקה למצע ה- DNA במהלך עסקאות דנ"א מסוימות; עם זאת, הוא צריך גם להיות מסוגל לעקור מהמצע כדי למסור את המצע לחלבון הבא במהלך התהליך הביולוגי. תוך שימוש בטכניקות ביוכימיות שונות, נקבע כי KD עבור RPA הוא כ-0.4 ננומטר עבור מצע ss-(polydT)30, ו-80 ננומטר ו-200 ננומטר עבור מצעי ss-(polydA)257 ו-dG-(polydG)602 בהתאמה, כפי שנמדד על ידי אנאיזוטרופיה של קיטוב פלואורסצנטי (FPA)37,38. RPA מראה גם העדפה גבוהה פי 50 לקשירה לרצפים עשירים בפירימידין בהשוואה לפורינים. אף על פי שטכניקות ביוכימיות שונות קבעו מדידות KD שונות עבור RPA, כל המדידות היו בתחום הננו-מולרי, מה שמרמז על זיקת הקישור הגבוהה של RPA ל-ssDNA. באמצעות שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRFM), התגלה כי בהתבסס על אורך הדנ"א, RPA קשור לשני מצבי קישור לפחות: אחד שהוגדר בניתוק מהיר (Kd, 680 pM) וקומפלקס ניתוק איטי (Kd, 60 pM)33,39. בהתחשב במעורבותו המרכזית כמעט בכל המסלולים המטבוליים של הדנ"א, היה עניין רב ביצירת מעכבים שיכולים לעכב את האינטראקציה בין RPA לדנ"א חד-גדילי (ssDNA). מעכבים כימיים אלה חיוניים בשיבוש תגובת הנזק לדנ"א, מה שהופך תאים סרטניים לרגישים יותר לחומרים מזיקים לדנ"א המשמשים בטיפולים קליניים. שימוש בבדיקת BLI מאפשר הערכה כמותית מדויקת של יעילות המעכבים בוויסות פונקציית הקישור של RPA40,41.

הגדרת BLI מאפשרת הגדרות ברורות: קינטיקה בסיסית ומתקדמת. במצב קינטיקה בסיסי, הבדיקה כוללת שלושה שלבים עיקריים: ביסוס בסיסי, אסוציאציה ודיסוציאציה. עם זאת, לפני ביצוע בדיקה זו, biosensors צריך להיות מצופה בנפרד, באמצעות המכשיר או באופן ידני על ספסל המעבדה. לעומת זאת, מצב הקינטיקה המתקדם משתרע מעבר לשלושת השלבים הבסיסיים, ומאפשר שילוב של שלבים נוספים. צעדים משלימים אלה יכולים לשרת מטרות שונות, כגון התניה של הביוסנסור לשינויים במאגר או להקל על זיהוי אינטראקציות חלבונים עוקבות. קינטיקה מתקדמת מאפשרת גם להפשיט את הביוסנסור של האנליט על ידי שיטת התחדשות טובה לשימוש חוזר פוטנציאלי, בתנאי שהפיתיון והביוסנסור נשארים שלמים. בדרך כלל, קינטיקה מתקדמת משמשת על פני קינטיקה בסיסית כאשר שלבים מרובים מעורבים בבדיקה, או שהבדיקה צריכה להתבצע בפורמט מורכב יותר.

פרוטוקול זה מתאר את שתי השיטות באמצעות אותו פיתיון [3'Bio-ss-poly (dT)32] ואנליטי (RPA). ביוסנסור מצופה סטרפטווידין ישמש כדי לשתק את הפיתיון, ויתקבלו מדידות KD עבור האנליט. פרוטוקול זה מתאר גישה מלאה לביצוע בדיקת BLI באמצעות אינטרפרומטריה ביו-שכבתית של מכשיר חד-ערוצי, המכסה הכנת פיתיון ביו-סנסור, שיקולי חיץ ומתווה שלב אחר שלב של ההליך.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

פירוט הריאגנטים והציוד ששימש במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת פיתיון, אנליט, חוצצים וניקוי מחזיק טיפות

  1. הגדרת המכשיר: הפעל את המכשיר לפחות שעה אחת לפני תחילת הניסוי. זה יאפשר למנורה להתחמם.
  2. הכנת חוצצי הפשטה וניקוי
    1. חיץ הפשטה: הכינו 50 מ"ל של 0.15 מ' חומצה זרחתית [pH 2.0]).
    2. מאגר ניקוי: הכינו 10 מ"ל של 0.5 N HCl.
  3. הכנת חיץ BLI
    1. הכן 50 מ"ל של 1x BLI buffer (50 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.1 mg/mL BSA, 1 mM DTT, 0.05% Tween 20). אחסנו מאגר זה בטמפרטורה של 4°C. לפני הגדרת בדיקה זו, הביאו את המאגר לטמפרטורת החדר.
      הערה: מומלץ מאוד להכין מאגרים טריים לבדיקה, מכיוון שמאגרים מיושנים עלולים לעבור שינויי pH או היווצרות אגרגטים ועלולים להיות להם זיהומים מיקרוביאליים, מה שעלול לסכן את יכולת השחזור והדיוק של התוצאות. לא מומלץ להשתמש במאגרים שאוחסנו במשך יותר משבועיים.
  4. הכנת פיתיון/מצע
    1. הכן 12.5 ננומטר של מצע 3'Bio-ss-poly (dT)32 (5' TTT TTT TTT TTT TTT TT 3'Bio) באמצעות מאגר BLI.
  5. הכנת מלאי ריכוז חלבונים
    1. הכינו ארבעה ריכוזים של RPA (5 ננומטר, 10 ננומטר, 20 ננומטר, 40 ננומטר) באמצעות מאגר BLI. הריכוז הגבוה ביותר של החלבון (40 ננומטר) מתקבל על ידי דילול חלבון המלאי במאגר BLI. דילולים הבאים מוכנים על ידי דילול סדרתי של פתרון העבודה 40 ננומטר. ודא שכל מאגרי החלבון נשמרים על קרח לאורך כל הניסוי כדי לשמור על יציבות.
  6. ניקוי מחזיק הטיפות
    1. יש להוסיף 4 μL מים מזוקקים ולנקות את מחזיק הטיפות עם מגבון ללא סיבים (חזור על הפעולה 3x). לאחר מכן, חזור על שלב זה עם 4μL של אתנול 70% ונקה עם מגבון ללא מוך. שלב זה מבטיח הסרת מזהמים על פני השטח וחלקיקי אבק.
    2. הוסיפו 4μL של 0.5N HCl והשאירו אותו במחזיק הטיפות למשך דקה אחת. נקו אותו עם מגבון ללא סיבים וחזרו על שלב זה פעם נוספת. זה מבטיח ניקוי עמוק של מחזיק הטיפות. ניקוי עמוק שימושי במיוחד לניקוי מחזיק הטיפות מטיפות מיובשות משימוש קודם.
    3. 1חזור על שלב 1 כדי לשטוף את מחזיק הטיפות במים מזוקקים ואתנול 70% ולנגב אותו יבש עם מגבון ללא מוך. מחזיק הטיפה מוכן כעת לשימוש.

2. קינטיקה בסיסית

  1. הגדרת המכשיר והתוכנה
    1. פתחו את התוכנה ובחרו Basic Kinetics בחלונית השמאלית (איור משלים 1).
    2. הסר את מדף החיישנים הביולוגיים מהמגש (המתקבל ממקורות מסחריים) והנח צלחת בת 96 בארות במגש. הוסף 200 μL של חיץ BLI לבאר הראשונה. לאחר מכן, מקם את מגש החיישנים הביולוגיים בחזרה על גבי צלחת 96 הקידוחים, וודא שכל חיישן ביולוגי מוכנס לבאר המתאימה לו. הביוסנסור הראשון אמור כעת להיות שקוע במאגר BLI בבאר הראשונה.
    3. בתוכנה, לחץ על Hydrate והפעל את הטיימר למשך 10 דקות, מה שמאפשר לביו-חיישן היחיד להתייבש למשך 10 דקות לפחות. השלב מעניק לחות לביו-חיישן כדי להכין אותו לבדיקת BLI.
    4. בזמן שהביוסנסור עובר הידרציה, פיפטה 250 מיקרוליטר של BLI חוצצת לשני צינורות 0.5 מ"ל. תייג אחד כ- "A" (אסוציאציה) ואת השני כ- "D" (דיסוציאציה).
    5. מלא את פרטי התוכנה (שם: ציפוי המצע ותיאור הבדיקה: RPA- 3'Bio-ss-poly (dT)32: קינטיקה בסיסית).
    6. התאם את הגדרת ההפעלה עבור כל שלב: תוכנית בסיסית (30 שניות), שיוך (120 שניות), דיסוציאציה (120 שניות) (טבלה 1). יש להשאיר את השייקר על הצינור ומחזיק הטיפות. מהירות השייקר מוגדרת ל-2200 סל"ד (טווח, 1000-2600 סל"ד), מה שמונע את השפעות הסעת ההמונים הנגרמות על ידי הדיפוזיה המוגבלת ליד משטח הביו-סנסור.
      הערה: מומלץ למטב את משך הזמן עבור כל שלב (תוכנית בסיסית, טעינה, שיוך, ניתוק) בעת הגדרת בדיקת קינטיקה מחייבת כדי לשפר את רכישת הנתונים.
  2. קביעת עקומת קו בסיס
    1. הניחו את צינור A במחזיק הצינור וחברו את הביו-חיישן הלח למערכת BLI. החליקו את מחזיק הצינור מתחת לחיישן הביולוגי (מיקום A, איור 2).
      הערה: אין לייבש לחלוטין חיישנים ביולוגיים בכל עת במהלך הניסוי. אם משאירים לייבוש, הקריאות של הניסוי יכולות להיות מוטות באופן משמעותי.
    2. לחץ על הפעל ופעל לפי ההוראות בהודעת הפקודה.
    3. לאחר השלמת קו הבסיס הראשוני, פתח את המכסה והוסף 4 μL של מאגר BLI למחזיק הטיפה. החליקו אותו ימינה מתחת לאותו חיישן ביולוגי (מיקום B, איור 2). סגור את המכסה ונטר את עקומת ה-BLI בתוכנה (איור 3, עקומה כחולה).
    4. לאחר השלמתו, פתחו את המכסה כדי להחליף את הצינור 'A' ב-'D' והחליקו אותו מתחת לביו-חיישן (מיקום A, איור 2). סגור את המכסה והמשך לשלב הדיסוציאציה. לאחר השלמתו, פתח את המכסה, נתק את הביו-סנסור, החזיר אותו למגש וודא שהביו-חיישן טבול במאגר BLI.
    5. הסר את הדגימה/חיץ, נקה את מחזיק הטיפות עם חיץ לפני ייבוש עם מגבונים ללא מוך, והסר את הצינור 'D' ממחזיק הצינור.
  3. ציפוי המצע
    1. הניחו את צינור A במחזיק הצינור וחברו את הביו-חיישן הלח למערכת BLI. החלק את מחזיק הצינור מתחת לחיישן הביולוגי ולחץ על הפעלה.
    2. לאחר שלב הבסיס הראשוני, הוסף 4 μL של מצע 12.5 ננומטר [3'Bio-ss-poly (dT)32] למחזיק הטיפה והחלק אותו מתחת לביו-חיישן. סגור את המכסה ועקוב אחר עקומת BLI בתוכנה. ודא שתגובה זו גבוהה מקו הבסיס (איור 3).
      הערה: ניתן למטב את ריכוז המצע על ידי ציפוי ביו-חיישנים בריכוזים שונים (ריכוז אחד בלבד לכל ביו-סנסור) והתבוננות בעקומות הקשירה. עקומת קשירה עם אות גבוה יותר באופן ניכר בהשוואה לקו הבסיס מספיקה כדי לאשר את ציפוי המצע. עומס יתר על החיישן הביולוגי עלול להוביל להפרעה סטרית או צפיפות על פני השטח. איור 3מראה את העקומות של חמישה ריכוזים של מצע 3'Bio-ss-poly (dT)32 ביוטינילציה. בנוסף, לאחר השלמת שלב העמסת הפיתיון, ניתן לטבול את החיישנים הביולוגיים במאגר חוסם סטרפטווידין (ביוציטין) למשך 30 שניות, ולאחר מכן לשטוף במאגר BLI. פעולה זו תחסום את משטח הסטרפטאווידין הלא קשור ותמנע קשירה לא ספציפית.
    3. לאחר השלמת שלב השיוך, פתח את המכסה והחלף את צינור 'A' בצינור 'D'. החלק אותו מתחת לחיישן הביולוגי וסגור את המכסה.
    4. לאחר השלמת שלב הדיסוציאציה, פתח את המכסה, נתק את החיישן הביולוגי והנח אותו במגש הביו-חיישן המכיל את מאגר ה-BLI. ודא כי biosensor הוא טבול לחלוטין במאגר הוא hydrated כראוי עבור השלבים הבאים. נקו את מחזיק הטיפות עם חיץ בדיקה, יבשו אותו במגבונים ללא סיבים והוציאו את הצינור 'D' ממחזיק הצינור. הביוסנסור מצופה כעת במצע 3'Bio-ss-poly (dT)32 .
  4. קשירת חלבונים
    1. פיפטה 250 μL של חיץ BLI לתוך עשרה צינורות microfuge שחור 0.5 מ"ל. תייג אותם A1 עד A5 ו- D1 עד D5.
    2. בצלחת נוספת של 96 בארות, הוסיפו 200 מיקרוליטר של חיץ הפשטה לתוך הבאר, בהתאם למיקום הביו-חיישן המיובש.
    3. לפני תחילת הבדיקה, נקה את מחזיק הטיפה 3x עם מאגר BLI.
    4. פתח קובץ חדש בתוכנה ובחר קינטיקה בסיסית בחלונית השמאלית. תן שם לבדיקה והוסף תיאור לפי הצורך (איור משלים 2). התאם את הגדרות ההפעלה כנדרש (טבלה 1).
    5. הניחו את הצינור המסומן A1 במחזיק הצינור וחברו את הביוסנסור המצופה 3'Bio-ss-poly (dT)32 למערכת BLI. החלק את הצינור מתחת לחיישן הביולוגי ולחץ על הפעלה.
    6. לאחר השלמת שלב הבסיס הראשוני, פתח את המכסה, הוסף 4 μL של מאגר BLI למחזיק הטיפה והחלק אותו מתחת לחיישן הביולוגי. זה יהיה ריכוז החלבון 0 ננומטר וישמש כעקומת הייחוס.
    7. לאחר השלמת שלב השיוך, החלף את צינור A1 ב- D1 והחלק אותו מתחת לחיישן הביולוגי.
    8. לאחר השלמת שלב הדיסוציאציה, הסר את החיישן הביולוגי והחזיר אותו למגש שלו. ודא כי biosensor הוא טבול לחלוטין במאגר מספיק hydrated עבור השלבים הבאים. הסר את צינור D1, נקה את מחזיק הטיפות באמצעות מאגר בדיקה וייבש אותו באמצעות מגבון ללא מוך.
    9. לאחר מכן, עקומת מחייב עבור מלאי RPA 5 ננומטר יתקבל. מלא את פרטי הדגימה (ריכוז: 5 ננומטר, משקל מולקולרי: 116 KDa) והקש Calc. פעולה זו תחשב את ריכוז החלבון במק"ג/מיקרוליטר.
    10. חבר את הביוסנסור המצופה 3'Bio-ss-poly (dT) 32 והכניס את הצינור A2 למחזיק הצינור. החלק אותו מתחת לחיישן הביולוגי ולחץ על הפעלה.
    11. לאחר נקודת ההתחלה, הוסף 4 μL של RPA של 5 ננומטר על מחזיק הטיפה והחלק אותו מתחת לחיישן הביולוגי. סגור את המכסה ועקוב אחר עקומת השיוך. ניתן להמחיש את קשירת החלבון לפיתיון על ידי עקומה גבוהה יותר מעקומת קו הבסיס. לאחר שלב השיוך, החלף את A2 ב- D2, החלק אותו מתחת לחיישן הביולוגי והשלם את שלב הדיסוציאציה.
    12. הסר את החיישן הביולוגי, טבול אותו במאגר ההפשטה למשך 30 שניות ולאחר מכן טבול אותו במאגר BLI למשך 3 דקות.
      הערה: יעילות ההתחדשות תלויה בפיתיון המשותק ובאנליט המשובש. חיישנים ביולוגיים משותקים מסוימים יכולים לעמוד בעשרה מחזורי התחדשות או יותר. אנו יכולים לפשוט את המצע 3'Bio-ss-poly (dT)32 של ביוטינילציה יותר משלוש פעמים (איור משלים 3) מבלי להבחין בשינוי ניכר בתגובה.
    13. חזור על שלבים 2.4.9-2.4.12 עבור שלושת הריכוזים האחרים של RPA 10 ננומטר, 20 ננומטר ו-40 ננומטר. הקפד להפשיט את החיישן הביולוגי עבור כל ריכוז.
      הערה: עבור בדיקות BLI, מומחים ממליצים להשתמש בארבעה ריכוזים (למעט עקומת הייחוס), המשתרעים בערך בין 0.1x ל -10x KD הצפוי למדידות קינטיות מדויקות. כאן, ארבעת הריכוזים הושגו על ידי דילול סדרתי.
  5. ניתוח נתונים וחישוב ערכי KD
    1. לפני חישוב ערך KD , יש צורך לבדוק חזותית את חיישן עבור כל ריכוז של RPA מחייב על מצע 3'Bio-ss-poly (dT)32 . ודאו שאות ה-BLI עולה עם הגדלת ריכוז ה-RPA עד שהדנ"א המשותק רווי (איור 4).
      הערה: לקבלת תוצאות אמינות, ודא שלפחות ארבעה ריכוזי חלבון קשורים בהצלחה למצע, למעט ריכוז אנליטי של 0 ננומטר. עיין בסעיף הדיון כדי לפתור שגיאות אפשריות.
    2. בטבלה 'Run List', בדוק את Ref עבור ריכוז אנליטי של 0 ננומטר כדי לשמש כעקומת ייחוס. בדוק לנתח עבור כל הריכוזים של האנליט.
    3. לאחר מכן, בחר הן תחילת שיוך והן תחילת דיסוציאציה לתיקון שלבים. פעולה זו תיישר את תחילת האסוציאציה עם סוף קו הבסיס ואת תחילת הדיסוציאציה עם סוף האסוציאציה, אשר נגרמת בדרך כלל על ידי דפוסי השתקפות שונים בין מחזיק הטיפה לצינור אם המאגר מתאים היטב.
    4. בחר התאמה גלובלית (1:1) עבור בדיקה זו. אנליזה גלובלית מחשבת את ערכי KD עבור קבוצה שלמה של ריכוזי חלבון, בעוד ניתוח מקומי הוא עבור ריכוז חלבון יחיד.
      הערה: התוכנה הנלווית למכשיר מאפשרת התאמה ביחס של 1:1 בלבד. זה יכול להיות אזהרה פוטנציאלית כאשר הפיתיון והאנליט צפויים להתאים למודלים מתאימים אחרים. נתונים מתוכנה זו עשויים להיות מיוצאים לתוכנות התוויית שיער אחרות ולהתאים למודלים המתאימים הנדרשים.
    5. לאחר מכן, בחר נתח. פעולה זו תחשב את ערכי KD, ka/kd (טבלה 2). השגיאה ka ו - kd בתוך 10% מהערך נחשבת בדרך כלל מקובלת.
      הערה: ודא שערכים אלה נמצאים בגבולות סבירים. אם השגיאה קטנה מ-10%, הדבר מצביע על כך שהתאמת הנתונים אמינה לחקר אינטראקציות בין מולקולות ביולוגיות. בנוסף, KD המחושב (קבוע דיסוציאציה של שיווי משקל) באמצעות ערכי ka ו- kd אלה צריך להיות מדויק מספיק עבור רוב היישומים המעשיים18.
    6. כדי לייצא את הנתונים המותאמים, לחץ לחיצה ימנית על הגרף שנוצר באמצעות הנתונים שניתחו. בחר יצא נתונים ולאחר מכן בחר מלל/נתונים. לחץ על קובץ ועיון כדי לשמור נתונים בפורמט '.dat'. ניתן לפתוח קובץ זה ב- Microsoft Excel ולהשתמש בו בתוכנות אחרות להתוויית גרפים.
      הערה: התאמה גלובלית לוקחת בחשבון את כל נתוני עקומת האיגוד בתוך הקבוצה, בעוד התאמה מקומית מתמקדת אך ורק בפרמטרים הקינטיים עבור כל ריכוז אנליטי בודד.

3. הגדרת המכשיר להפעלת קינטיקה מתקדמת

  1. פתחו את התוכנה ובחרו Advanced Kinetics בלוח השמאלי (איור משלים 1).
  2. הניחו צלחת של 96 בארות במגש המכילה את החיישנים הביולוגיים. הוסף 200 μL של חיץ BLI בחמש בארות. הניחו את מגש החיישנים הביולוגיים על צלחת 96 הקידוחים, כך שחמישה חיישנים ביולוגיים יטבלו לתוך הבאר המכילה את החיץ.
  3. בתוכנה, לחץ על Hydrate והפעל את הטיימר למשך 10 דקות, מה שמאפשר לביו-חיישן היחיד להתייבש למשך 10 דקות לפחות.
  4. בזמן שהחיישנים הביולוגיים מעניקים לחות, פיפטה 250 מיקרוליטר של BLI חוצצת לעשרה צינורות צנטריפוגה שחורים של 0.5 מ"ל. תייג אותם כ- A1 עד A5 ו- D1 עד D5.
  5. מלא את פרטי התוכנה (שם: ציפוי המצע ותיאור הבדיקה: RPA-3'Bio-ss-poly (dT)32: קינטיקה מתקדמת).
  6. הזן את משך הזמן עבור כל שלב (איור משלים 4). בסיס ראשוני (30 שניות), טעינה (120 שניות), בסיס (30 שניות), שיוך (120 שניות), דיסוציאציה (120 שניות). התאם את הגדרות ההפעלה כנדרש (טבלה 1).
    1. מלא את הפרטים בתוכנה (ריכוז: 0 ננומטר, משקל מולקולרי: 116 kDa) ולחץ על Calc.
  7. הניחו את צינור A1 במחזיק הצינור וחברו את הביו-סנסור. החלק את מחזיק הצינור מתחת לחיישן הביולוגי ולחץ על הפעל כדי לקבל את קו הבסיס הראשוני.
  8. הוסף 4 μL של מצע 12.5 ננומטר למחזיק הטיפה והחלק אותו מתחת לחיישן הביולוגי. סגור את המכסה. פעולה זו תעמיס את המצע על הביו-סנסור. החלף את A1 ב- D1 במחזיק הצינור והחלק אותו מתחת לחיישן הביולוגי. זה ייתן את עקומת הבסיס.
  9. נקו את מחזיק הטיפות עם מגבון ללא סיבים והעמיסו 4 μL של מאגר ה-BLI. החלק אותו מתחת לחיישן הביולוגי וסגור את המכסה. זה יהיה ריכוז החלבון 0 ננומטר וישמש כעקומת הייחוס.
  10. לאחר השלמת שלב השיוך, החלק את צינור D2 מתחת לביו-סנסור. המשך בשלב הדיסוציאציה. אפשר לדיסוציאציה להסתיים.
  11. נתק את החיישן הביולוגי, הסר את D2 ממחזיק הצינור ונקה את מחזיק הטיפות באמצעות מגבון ללא מוך.
  12. הזן את הפרטים (ריכוז: 5 ננומטר, משקל מולקולרי: 116 kDa) עבור הריצה הבאה ולחץ על Calc.
  13. חבר את הביו-חיישן השני למערכת BLItz, הכנס את הצינור A2 למחזיק הצינור והחלק אותו מתחת לביו-סנסור.
  14. לאחר קביעת קו הבסיס הראשוני, הוסף 4 μL של מצע 12.5 ננומטר למחזיק הטיפה. החלק אותו מתחת לחיישן הביולוגי וסגור את המכסה. החלף את צינור A2 ב- D3 והחלק אותו מתחת לחיישן הביולוגי. לאחר מכן, הוסף 4 μL של מלאי 10 ננומטר של RPA לתוך מחזיק הצינור והחלק אותו מתחת biosensor.
  15. לאחר השיוך, החלק D4 תחת biosensor עבור דיסוציאציה.
  16. חזור על שלבים 3.1.12–3.1.15 עבור שלושת הריכוזים הבאים של RPA (10 ננומטר, 20 ננומטר, 40 ננומטר). עקומות קשירה של ריכוזים אלה מוצגות באיור 5.
  17. ניתוח נתונים וערך KD יכולים להיות מותאמים באותו הליך כמו קינטיקה בסיסית BLI (שלב 2.5, טבלה 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

ב- BLI, אור לבן מוחזר מהממשק של biolayer/buffer ומממשק הייחוס הפנימי לספקטרומטר. תבנית ההתאבכות המתקבלת נרשמת, וההסטה הספקטרלית נמדדת על פני פרק זמן ומתוארת כתגובת עקומות קשירה בננומטר. איור מייצג המראה את קצה הביו-חיישן עם ובלי קישור אנליטי ואת שינוי אורך הגל הספקטרלי המתאים (ננ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

היכולת לנתח את קינטיקה הקישור של כל חלבון למצע שלו באמצעות BLI מספקת את האמצעים לבודד ולאפיין את הגורמים הספציפיים (כגון רצף, מבנה או אורך של DNA) השולטים באינטראקציות חלבון-דנ"א בתוך התא19. מערכת Octet N1, המסתמכת על עקרונות האינטרפרומטריה של השכבה הביולוגית, מאפשר?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין ניגוד עניינים להצהיר.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדע (1929346) והאגודה האמריקאית לסרטן (RSG-21-028-01). ברצוננו גם להודות לחברי מעבדת Balakrishnan על דיונים מועילים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 mL Micro Centrifuge TubesGlobe Scientific111554A
96 Well Standard Black MicroplateDot Scientific4ti-0223
Biotinylated poly dT OligonucleotideIDT
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153-10G
Dithiothreitol (DTT)Dot ScientificDSD11000-10
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Dot ScientificDSE57020-500
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-500
Kimtec Science Kimwipes Kimtech34120
Octet N1 SoftwareSartorius 1.4.0.13
Octet SA Biosensor Sartorius 18-5019
PBS pH 7.2 (10x)Gibco1666711
Personal Assay Octet N1 SystemSartorius 
Phosphoric Acid Ward's Science470302-024
Sodium Chloride (NaCl)Dot ScientificDSS23020-5000
Tris BaseDot ScientificDST60040-5000
Tween20 Bio-Rad170-6531

References

  1. Kalodimos, C. G., et al. Structure and flexibility adaptation in non-specific and specific protein-DNA complexes. Science. 305 (5682), 386-389 (2004).
  2. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9 (23), 6505-6525 (1981).
  3. Lane, D., Prentki, P., Chandler, M. Use of gel retardation to analyze protein-nucleic acid interactions. Microbiol Rev. 56 (4), 509-528 (1992).
  4. Dyer, R. B., Herzog, N. K. Immunodepletion EMSA: A novel method to identify proteins in a protein-DNA complex. Nucleic Acids Res. 23 (16), 3345-3346 (1995).
  5. Dudley, R. K. A laboratory guide to in vitro studies of protein-DNA interactions. FEBS Lett. 306, 2-3 (1991).
  6. Tsai, C., Smider, V., Hwang, B. J., Chu, G. Electrophoretic mobility shift assays for protein-DNA complexes involved in DNA repair. Methods Mol Biol. 920, 53-78 (2012).
  7. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).
  8. Heffler, M. A., Walters, R. D., Kugel, J. F. Using electrophoretic mobility shift assays to measure equilibrium dissociation constants: GAL4-p53 binding DNA as a model system. Biochem Mol Biol Educ. 40 (6), 383-387 (2012).
  9. Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. J Vis Exp. (84), e51383(2014).
  10. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J Pharm Biomed Anal. 72, 150-154 (2013).
  11. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
  12. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).
  13. Schasfoort, R. B. M., Tudos, A. J. Handbook of surface plasmon resonance. , RSC Pub. (2008).
  14. Douzi, B. Surface plasmon resonance: A sensitive tool to study protein-protein interactions. Methods Mol Biol. 2715, 363-382 (2024).
  15. Douzi, B. Protein-protein interactions: Surface plasmon resonance. Methods Mol Biol. 1615, 257-275 (2017).
  16. Drescher, D. G., Selvakumar, D., Drescher, M. J. Analysis of protein interactions by surface plasmon resonance. Adv Protein Chem Struct Biol. 110, 1-30 (2018).
  17. Martin, S. R., Ramos, A., Masino, L. Biolayer interferometry: Protein-RNA interactions. Methods Mol Biol. 2263, 351-368 (2021).
  18. Apiyo, D. Biomolecular binding kinetics assays on the Octet BLI platform. , https://www.sartorius.com/resource/blob/742330/05671fe2de45d16bd72b8078ac28980d/octet-biomolecular-binding-kinetics-application-note-4014-en-1--data.pdf (2022).
  19. Barrows, J. K., Van Dyke, M. W. Biolayer interferometry for DNA-protein interactions. PLoS One. 17 (2), e0263322(2022).
  20. Desai, M., Di, R., Fan, H. Application of biolayer interferometry (BLI) for studying protein-protein interactions in transcription. J Vis Exp. (149), e59687(2019).
  21. Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic acid interactions by biolayer interferometry. Curr Protoc Protein Sci. 79, 19.25.1-19.25.26 (2015).
  22. Petersen, R. L. Strategies using bio-layer interferometry biosensor technology for vaccine research and development. Biosensors (Basel). 7 (4), 49(2017).
  23. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization. Comb Chem High Throughput Screen. 12 (8), 791-800 (2009).
  24. Wold, M. S. Replication protein A: A heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism. Annu Rev Biochem. 66, 61-92 (1997).
  25. Qureshi, M. H., Ray, S., Sewell, A. L., Basu, S., Balci, H. Replication protein A unfolds G-quadruplex structures with varying degrees of efficiency. J Phys Chem B. 116 (19), 5588-5594 (2012).
  26. Wold, M. S., Kelly, T. Purification and characterization of replication protein A, a cellular protein required for in vitro replication of simian virus 40 DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (8), 2523-2527 (1988).
  27. Bochkareva, E., Korolev, S., Lees-Miller, S. P., Bochkarev, A. Structure of the RPA trimerization core and its role in the multistep DNA-binding mechanism of RPA. EMBO J. 21 (7), 1855-1863 (2002).
  28. Brosey, C. A., et al. NMR analysis of the architecture and functional remodeling of a modular multidomain protein, RPA. J Am Chem Soc. 131 (18), 6346-6347 (2009).
  29. Fanning, E., Klimovich, V., Nager, A. R. A dynamic model for replication protein A (RPA) function in DNA processing pathways. Nucleic Acids Res. 34 (15), 4126-4137 (2006).
  30. Gibb, B., et al. Protein dynamics during presynaptic-complex assembly on individual single-stranded DNA molecules. Nat Struct Mol Biol. 21 (10), 893-900 (2014).
  31. Nguyen, B., et al. Diffusion of human replication protein A along single-stranded DNA. J Mol Biol. 426 (19), 3246-3261 (2014).
  32. Brosey, C. A., et al. Functional dynamics in replication protein A DNA binding and protein recruitment domains. Structure. 23 (6), 1028-1038 (2015).
  33. Chen, R., Subramanyam, S., Elcock, A. H., Spies, M., Wold, M. S. Dynamic binding of replication protein a is required for DNA repair. Nucleic Acids Res. 44 (12), 5758-5772 (2016).
  34. Kemmerich, F. E., et al. Force regulated dynamics of RPA on a DNA fork. Nucleic Acids Res. 44 (12), 5837-5848 (2016).
  35. Pokhrel, N., et al. Dynamics and selective remodeling of the DNA-binding domains of RPA. Nat Struct Mol Biol. 26 (2), 129-136 (2019).
  36. Wang, Q. M., et al. Human replication protein A induces dynamic changes in single-stranded DNA and RNA structures. J Biol Chem. 294 (38), 13915-13927 (2019).
  37. Wyka, I. M., Dhar, K., Binz, S. K., Wold, M. S. Replication protein A interactions with DNA: Differential binding of the core domains and analysis of the DNA interaction surface. Biochemistry. 42 (44), 12909-12918 (2003).
  38. Kim, C., Snyder, R. O., Wold, M. S. Binding properties of replication protein A from human and yeast cells. Mol Cell Biol. 12 (7), 3050-3059 (1992).
  39. Caldwell, C. C., Spies, M. Dynamic elements of replication protein A at the crossroads of DNA replication, recombination, and repair. Crit Rev Biochem Mol Biol. 55 (5), 482-507 (2020).
  40. Mishra, A. K., Dormi, S. S., Turchi, A. M., Woods, D. S., Turchi, J. J. Chemical inhibitor targeting the replication protein A-DNA interaction increases the efficacy of Pt-based chemotherapy in lung and ovarian cancer. Biochem Pharmacol. 93 (1), 25-33 (2015).
  41. Gavande, N. S., et al. Structure-guided optimization of replication Protein A (RPA)-DNA interaction inhibitors. ACS Med Chem Lett. 11 (6), 1118-1124 (2020).
  42. Ana Jug, T. B., Janez Ilaš, Biolayer interferometry and its applications in drug discovery and development. TrAC Trends Anal Chem. 176, 117741(2024).
  43. Gator Bio, I. Using BLI for viral and lipid-based vector analytics. , News Medical. https://www.news-medical.net/whitepaper/20230322/Using-BLI-for-viral-and-lipid-based-vector-analytics.aspx (2023).
  44. Noy-Porat, T., et al. Characterization of antibody-antigen interactions using biolayer interferometry. STAR Protoc. 2 (4), 100836(2021).
  45. Onyekachi Ononye, S. S., et al. Biochemical impact of p300-mediated acetylation of replication protein A: Implications for DNA metabolic pathway choice. bioRxiv. , (2024).
  46. Weeramange, C. J., Fairlamb, M. S., Singh, D., Fenton, A. W., Swint-Kruse, L. The strengths and limitations of using biolayer interferometry to monitor equilibrium titrations of biomolecules. Protein Sci. 29 (4), 1018-1034 (2020).
  47. Artem Stetsenko, A. G. An Overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization. Crystals. 7 (7), 197(2017).
  48. Hubbe, M. A., Szlek, D. B., Vera, R. E. Detergency mechanisms and cellulosic surfaces: A review. BioResources. 17 (4), 7167-7249 (2022).
  49. Renee Tobias, S. K., Apiyo, A. Research the Industry Standard for Label-Free of Biomolecular Interactions Analysis (BIA). , https://www.sartorius.com/en/products/biolayer-interferometry/bli-resources (2021).
  50. Octet NTA Biosensor Kinetic Assays. , Sartorius. https://www.sartorius.com/resource/blob/552398/b27ccc2fdfde7a9320909572ced3f6a1/ni-nta-biosensor-kinetic-assays-technical-note-en-sartorius-data.pdf (2024).
  51. Application Guides: Kinetics and affinity measurements with Biacore systems. , Cytiva. Available from: https://cdn.cytivalifesciences.com/api/public/content/digi-33042-pdf (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

215BLI

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved