JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu makale, streptavidin bazlı bir biyokatman interferometrisi (BLI) sistemi kullanarak DNA-protein etkileşimlerini incelemek için bir protokolü açıklamaktadır. Etkileşimin denge bağlanma afinitesini(KD) belirlemek için temel veya ileri bağlanma kinetiğini kullanmak için temel adımları ve hususları ana hatlarıyla belirtir.

Özet

Protein-DNA etkileşimleri, temel hücresel süreçlerin temelini oluşturur. Bu etkileşimleri anlamak, çeşitli yolların moleküler mekanizmalarını aydınlatmak için kritik öneme sahiptir. Bir DNA molekülünün yapısı, sırası ve uzunluğu gibi temel faktörler, protein bağlanmasını önemli ölçüde etkileyebilir. Biyo-katman interferometrisi (BLI), moleküller arasındaki bağlanma kinetiğini ölçen ve protein-DNA etkileşimlerini kantitatif olarak incelemek için basit ve kesin bir yaklaşım sunan, etiketsiz bir tekniktir. BLI'nin geleneksel jel bazlı yöntemlere göre önemli bir avantajı, dinamik protein-DNA etkileşimleri için denge ayrışma sabitinin(KD) doğru ölçümünü sağlayan, bağlanma kinetiği hakkında gerçek zamanlı veri sağlama yeteneğidir. Bu makale, bir DNA replikasyon proteini, replikasyon proteini A (RPA) ve tek sarmallı bir DNA (ssDNA) substratı arasındaki etkileşiminKD değerini belirlemek için temel bir protokol sunmaktadır. RPA, ssDNA'yı yüksek afinite ile bağlar, ancak biyolojik yollar içinde sonraki protein etkileşimlerini kolaylaştırmak için kolayca yer değiştirmelidir. Açıklanan BLI testinde, biyotinile edilmiş ssDNA, streptavidin kaplı bir biyosensör üzerinde hareketsiz hale getirilir. RPA'nın biyosensöre bağlı DNA'ya bağlanma kinetiği (birleşme ve ayrışma) daha sonra ölçülür. Elde edilen veriler, sistem yazılımı kullanılarak ilişkilendirme hızı sabiti (ka), ayrışma hızı sabiti (kd) ve denge bağlama sabiti(KD) için kesin değerler elde etmek üzere analiz edilir.

Giriş

Hücresel proteinler, canlı organizmalarda meydana gelen karmaşık biyolojik süreçlerin düzenlenmesinde çok önemli bir rol oynar. Bu yolların optimal işleyişi, ortak proteinler ve nükleik asitler ile etkileşimler de dahil olmak üzere, hücre içindeki proteinler ve diğer biyomoleküller arasındaki etkileşime bağlıdır1. Bu nedenle, hücresel süreçlerin karmaşıklıklarını anlamak, protein-nükleik asit etkileşimlerinin dinamiklerinin derinlemesine anlaşılmasını gerektirir.

Geleneksel olarak, protein-nükleik asit etkileşimleri, elektroforetik hareketlilik jel kayma deneyleri (EMSA'lar) kullanılarak incelenmiştir2. Bu tahlilde, proteinler kısa bir süre için sentetik oligonükleotidler (belirli uzunluklar veya diziler içeren DNA / RNA) ile inkübe edilir ve reaksiyon daha sonra doğal bir poliakrilamid (PAGE) jeli 3,4,5 üzerinde elektroforeze edilir. Protein-oligonükleotid etkileşiminin görselleştirilmesini sağlamak için, oligonükleotidler tipik olarak radyoaktif olarak 32P ile etiketlenir veya floresan molekülleri ile etiketlenir. Protein oligonükleotid ile etkileşime girer ve bağlanırsa, proteinin bağlanması jel6,7 içindeki nükleik asidin hareketliliğini yavaşlatır. Bu nedenle, bu yöntem aynı zamanda jel kayması veya jel geciktirme testi olarak da adlandırılır. Bu yöntem yaygın olarak kullanılmış olsa da, zayıf veya dinamik bağlanmadan düşük çözünürlük, önemli ölçüde yüksek protein konsantrasyonu gereksinimi ve daha fazla çaba dahil olmaküzere KD değerlerini elde etmek için bu yöntemi kullanırken dikkate alınması gereken birkaç sınırlama vardır. Ek olarak, EMSA'lar gerçek zamanlı tahliller değildir ve bu nedenle bağlanma kinetiğinidoğru bir şekilde ölçemez 7,8.

Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için yüzey plazmon rezonansı (SPR) ve biyokatman interferometrisi (BLI) gibi yenilikçi teknikler ortaya çıkmıştır 9,10,11,12. Her iki yöntem de moleküller arasındaki ilişki/ayrışma hızı sabitlerini ve afinite sabitlerini etiketsiz bir şekilde ölçer. Proteinin etiketlenmesi gerekmediğinden, bu teknikler proteinin özelliklerini değiştirme veya bağlanma bölgesini bloke etme riskini ortadan kaldırır. SPR'de polarize ışık, bir sensörle (metal iletken bir film, tipik olarak altın) etkileşime girerek plazmon adı verilen bir elektron yük yoğunluğu dalgası üretir. Bu etkileşim, yansıyan ışının yoğunluğunu azaltır ve bir dedektör, rezonans açısı13 olarak bilinen belirli açıdaki değişikliği ölçer. Ligand (nükleik asit) - analit (protein) etkileşimlerini incelemek için, ligand, sensör çipi üzerindeki bir akış hücresinde hareketsiz hale getirilir ve analit, hareketsiz hale getirilmiş ligandı içeren akış hücresine enjekte edilir. Analitin ligand'a bağlanması üzerine, sensör yüzeyinin yakınındaki kırılma indisinde tespit edilebilir bir değişiklik olur, böylece moleküler etkileşimlerin 14,15,16 ölçülmesine izin verilir.

Biyo-Katman İnterferometrisi (BLI), ışık, biyosensör ucunun alt yüzeyinde bir ligand (yem) ve onun bağlanma ortağından (analit) oluşan bir biyo-tabaka ile bir optik fiberden geçerken ışık girişiminin modelini ölçer. Işık, uçtan iletilir ve biyo tabakanın özelliklerinden dolayı biyotabakanın her iki ucuna da yansıtılır. Biyo-tabaka kalınlığı, yansıyan ışığın modelini etkileyen bağlı moleküllerin sayısı ile orantılıdır. Bağıl yoğunluk eğrisinin değişimini karşılaştırarak. Referans arayüzden ve biyokatman/tampon arayüzünden yansıyan ışık arasındaki girişimin neden olduğu dalga boyu, biyokatmanın kalınlık değişimi belirlenebilir. Daha fazla molekül bağlandığında, daha büyük bir kayma meydana gelir ve BLI'yi biyomoleküler etkileşimleri gerçek zamanlı olarak incelemek için güçlü bir araç haline getirir. Girişim modelindeki değişiklik ölçülür ve bir sensorgram üzerinde spektral kayma17,18 olarak temsil edilir (Şekil 1A). Bağlanma etkileşiminin doğası, bağlanma ortağının (19,20,21) ligandla değişen konsantrasyonlarından yoksun bir kurulum gibi uygun kontroller kullanılarak doğru bir şekilde belirlenebilir. SPR ile karşılaştırıldığında, BLI uygun maliyetli ve kullanıcı dostudur, bu da onu geniş bir araştırmacı yelpazesi için erişilebilir kılar. Ek olarak, BLI'da kullanılan numuneler, herhangi bir bozulma veya topaklanma olmadığı takdirde bozulmadan kalır. Bu, muhtemelen geri kazanılmalarına ve yeniden kullanılmalarına izin verir, böylece atıkları en aza indirir. BLI cihazı, mikroakışkanlar kullanılmadan çalışır, böylece akışkan sisteminin bakım/bakım ihtiyacı, tıkanma veya gazı alınmış tamponların kullanımı gibi dezavantajlarını ortadan kaldırır. Ayrıca, filtrelenmemiş veya ham protein numuneleri nedeniyle cihazın kontamine olma riskini de en aza indirir.

Bir BLI deneyinde, yem molekülünün biyosensör üzerinde hareketsiz hale getirilmesiyle biyotabaka oluşturulur. Biyosensörlerin biyolojik tabakası çeşitli etiketlerle etkileşime girebilir ve bu da moleküller (nükleik asitler, proteinler, antikorlar, virüsler, küçük moleküller vb. dahil) arasındaki etkileşimleri incelemeyi mümkün kılar.22. Bu immobilizasyonu oluşturmak için biotin/streptavidin, 6X-His-tag/Ni-NTA, FLAG/anti-FLAG, GST/anti-GST ve antikor/anti-Fc dahil olmak üzere çeşitli yakalama stratejileri kullanılabilir. Biyosensör seçilirken hareketsizleştirilmiş ligandın yapısını ve aktivitesini korumak çok önemlidir. Girişim modelindeki değişiklikler, matris23'ün yanı sıra bağlı molekül miktarından da etkilenir. Protein-nükleik asit etkileşimleri, streptavidin kaplı biyosensörler üzerinde hareketsiz hale getirilebilen biyotinile oligonükleotid probları kullanılarak incelenir. İmmobilize yem (oligonükleotid) ile etkileşime girmesi beklenen protein numuneleri, ilişkiyi ölçmek için bir bağlayıcı tamponda belirli bir süre oligonükleotid ile temas halindedir ve daha sonra ayrışmayı ölçmek için boş bir bağlama tamponuna geçirilir. Analit bağlanmasının ve bağlanma eğrisindeki karşılık gelen değişikliklerin şematik bir gösterimi Şekil 1B'de gösterilmiştir. Ek olarak, protein-nükleik etkileşimler, proteinin (yem) biyosensör üzerinde yakalandığı ve nükleik asit (analit) ile etkileşime girdiği ters bir immobilizasyon yolu ile de incelenebilir.

Şu anda, biyo-tabaka interferometrisi prensibi ile çalışan çok sayıda cihaz ticari olarak mevcuttur. Basit ve uygun maliyetli bir araç, veri çıkışı için tek bir kanala sahip olan Octet N1 sistemi olarak bilinir. Manuel işlem gerektirir, minimum numune hacmi (4 μL) tüketir ve ortam sıcaklıklarında 9,23 numune analizi gerçekleştirir. Bu tek kanallı cihaz, 10 kDa'dan büyük proteinlerin bağlanma verimliliklerini tespit edebilir ve mikromolar (μM) ila nanomolar (nM) aralığı 11,12'deki afiniteleri ölçebilir. Otomatik veri okuma için 2, 8, 16 ve 96 kanallı bazı cihazlar da mevcuttur ve hem 96 hem de 384 kuyu formatlarıylauyumludur 19,20. Bu cihazlardan bazıları ayrıca 4 °C ila 40 °C arasında çalışabilir, 150 Da kadar düşük moleküler ağırlığa sahip biyomolekülleri tespit edebilir ve milimolar ila pikomolar aralık19,21 içindeki afiniteleri ölçebilir. Açıklanan sistem uygun maliyetli olsa da, çok kanallı daha pahalı cihazlar yüksek verimli otomatik işleme sunar. Bu gelişmiş sistemler, biyolojik ilaç moleküllerinin karakterize edilmesinde ve geliştirilmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır 9,23.

Mevcut protokol, tek kanallı, manuel biyokatman interferometri sistemi kullanılarak replikasyon proteini A'nın (RPA) tek sarmallı DNA'ya (ss-DNA) bağlanma parametrelerinin ölçülmesinde yer alan adımları açıklamaktadır. RPA, DNA replikasyonu, onarımı ve rekombinasyonu dahil olmak üzere DNA metabolizmasının hemen hemen tüm yönlerinde kritik bir rol oynayan heterotrimerik, ssDNA bağlayıcı bir protein kompleksidir24. ssDNA'ya yüksek afinitesi nedeniyle (nanomolar altı aralıkta olduğu ölçülmüştür), çeşitli DNA işlemleri sırasında üretilen ssDNA'ya hızla bağlanabilir, onu nükleolitik bozulmadan koruyabilir ve diğer aşağı akış proteinlerinin doğaçlama bağlanmasını önleyebilir. RPA ayrıca G-dörtlüleri25 gibi kanonik olmayan ikincil ve üçüncül yapıların oluşumunu önlemede kritik bir rol oynar. İnsan RPA'sı üç alt birimden oluşur: RPA70 (70 kDa), RPA32 (32 kDa) ve RPA14 (14 kDa), sırasıylaRPA 1, RPA 2 ve RPA 3 olarak da adlandırılır 24,26,27. Bu alt birimler, A'dan F'ye etiketlenmiş altı oligonükleotid/oligosakkarit bağlama kıvrımı (OB kıvrımları) barındırır. Bunlar arasında, DNA bağlanma alanları (DBD'ler) RPA1 (DBD-A, DBD-B, DBD-C) ve RPA2 (DBD-D) alt birimleri28 üzerindedir. İlk olarak, DNA'nın uzunluğuna bağlı olarak, RPA'nın, farklı DBD'lerin belirli DNA uzunluklarına29 dahil edildiği farklı bağlanma modları sergilediği düşünülüyordu. Son yapısal ve tek moleküllü çalışmalardan elde edilen veriler, RPA'nın farklı DBD'lerinin bağlanmasının başlangıçta önerilenden daha dinamik olduğunu öne sürmek için bu modellerin rafine edilmesine yardımcı olmuştur 30,31,32,33,34,35,36. Dinamik bağlanma özelliğinin bu özelliği, RPA'nın işlevi için esastır, çünkü RPA, belirli DNA işlemleri sırasında DNA substratına sıkı bir şekilde bağlanabilmelidir; Bununla birlikte, biyolojik süreç sırasında substratı bir sonraki proteine teslim etmek için substrattan yer değiştirebilmelidir. Farklı biyokimyasal teknikler kullanılarak, floresan polarizasyon anizotropisi (FPA)37,38 ile ölçüldüğü üzere, RPAiçin KD'nin bir ss-(polidT)30 substratı için yaklaşık 0.4 nM ve ss-(polidA)257 ve dG-(polidG)602 substratları için sırasıyla 80 nM ve 200 nM olduğu belirlenmiştir37,38. RPA ayrıca, pürinlere kıyasla pirimidin açısından zengin dizilere bağlanma için yaklaşık 50 kat daha yüksek bir tercih gösterir. Farklı biyokimyasal teknikler RPA için farklı KD ölçümleri belirlemiş olsa da, tüm ölçümler nanomolar aralıkta olmuştur, bu da RPA'nın ssDNA için yüksek bağlanma afinitesini düşündürmektedir. Toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) kullanılarak, DNA'nın uzunluğuna bağlı olarak, RPA'nın en az iki bağlanma modu ile ilişkili olduğu keşfedildi: biri hızlı ayrışmada tanımlanan (Kd, 680 pM) ve yavaş ayrışan (Kd, 60 pM) kompleks33,39. Neredeyse tüm DNA metabolik yolaklarındaki önemli rolü göz önüne alındığında, RPA ve tek sarmallı DNA (ssDNA) arasındaki etkileşimi engelleyebilecek inhibitörlerin oluşturulmasına büyük bir ilgi olmuştur. Bu kimyasal inhibitörler, DNA hasar tepkisini bozmada hayati öneme sahiptir ve kanser hücrelerini klinik tedavilerde kullanılan DNA'ya zarar veren ajanlara karşı daha duyarlı hale getirir. BLI testinin kullanılması, RPA'nın bağlanma fonksiyonunu modüle etmede inhibitör etkinliğinin kesin bir kantitatif değerlendirmesine izin verir40,41.

BLI kurulumu farklı ayarlara izin verir: temel ve gelişmiş kinetik. Temel kinetik modunda, tahlil üç ana aşamadan oluşur: temel oluşturma, ilişkilendirme ve ayrışma. Bununla birlikte, bu testi gerçekleştirmeden önce, biyosensörlerin cihaz kullanılarak veya laboratuvar tezgahında manuel olarak ayrı ayrı kaplanması gerekir. Tersine, gelişmiş kinetik mod, temel üç adımın ötesine uzanır ve ek adımların dahil edilmesine izin verir. Bu ek adımlar, biyosensörün tampon değişikliklerine koşullandırılması veya sonraki protein etkileşimlerinin tespitinin kolaylaştırılması gibi çeşitli amaçlara hizmet edebilir. Gelişmiş kinetik, yem ve biyosensörün sağlam kalması koşuluyla, potansiyel yeniden kullanım için iyi bir rejenerasyon yöntemiyle analitin biyosensörünün sıyrılmasına da izin verir. Genel olarak, tahlilde birden fazla adım söz konusu olduğunda veya tahlilin daha karmaşık bir formatta gerçekleştirilmesi gerektiğinde, temel kinetik yerine gelişmiş kinetik kullanılır.

Bu protokol, aynı yemi [3'Bio-ss-poly (dT)32] ve analit (RPA) kullanan her iki yöntemi de ana hatlarıyla belirtir. Yemi hareketsiz hale getirmek için streptavidin kaplı bir biyosensör kullanılacak ve analitiçin KD ölçümleri elde edilecektir. Bu protokol, biyosensör-yem hazırlama, tampon hususları ve prosedürün adım adım ana hatlarını kapsayan tek kanallı bir alet biyokatman interferometrisi kullanarak bir BLI testi gerçekleştirmek için eksiksiz bir yaklaşımı tanımlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Yem, analit, tamponların hazırlanması ve damla tutucu temizliği

  1. Cihazın kurulması: Deneye başlamadan en az 1 saat önce cihazı açın. Bu, lambanın ısınmasına izin verecektir.
  2. Sıyırma ve temizleme tamponlarının hazırlanması
    1. Sıyırma tamponu: 50 mL 0.15 M Fosforik asit [pH 2.0]) hazırlayın.
    2. Temizleme tamponu: 10 mL 0.5 N HCl hazırlayın.
  3. BLI tamponunun hazırlanması
    1. 50 mL 1x BLI tamponu hazırlayın (50 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.1 mg / mL BSA, 1 mM DTT, 0.05% Tween 20). Bu tamponu 4 °C'de saklayın. Bu tahlili kurmadan önce tamponu oda sıcaklığına getirin.
      NOT: Eskitilmiş tamponlar pH değişikliklerine veya agrega oluşumuna maruz kalabileceğinden ve sonuçların tekrarlanabilirliğini ve doğruluğunu potansiyel olarak tehlikeye atan mikrobiyal kontaminasyonlara sahip olabileceğinden, test için taze tamponların hazırlanması şiddetle tavsiye edilir. İki haftadan daha uzun süre saklanmış tamponların kullanılması önerilmez.
  4. Yem/substrat hazırlanması
    1. BLI tamponu kullanarak 12.5 nM 3'Bio-ss-poly (dT)32 substrat (5' TTT, TTT, TT, 3'Bio) hazırlayın.
  5. Protein konsantrasyon stoklarının hazırlanması
    1. BLI tamponu kullanarak dört konsantrasyonda RPA (5 nM, 10 nM, 20 nM, 40 nM) hazırlayın. Proteinin en yüksek konsantrasyonu (40 nM), stok proteinin BLI tamponunda seyreltilmesiyle elde edilir. Sonraki seyreltmeler, 40 nM çalışma çözeltisinin seri seyreltilmesiyle hazırlanır. Stabiliteyi korumak için tüm protein stoklarının deney boyunca buz üzerinde tutulduğundan emin olun.
  6. Damla tutucunun temizlenmesi
    1. 4 μL damıtılmış su ekleyin ve damla tutucuyu tüy bırakmayan bir mendille temizleyin (3 kez tekrarlayın). Ardından, bu adımı 4μL %70 etanol ile tekrarlayın ve tüy bırakmayan bir mendille temizleyin. Bu adım, yüzey kirleticilerinin ve toz parçacıklarının giderilmesini sağlar.
    2. 4μL 0.5N HCl ekleyin ve damla tutucuda 1 dakika bekletin. Tüy bırakmayan bir mendille temizleyin ve bu adımı bir kez daha tekrarlayın. Bu, damla tutucunun derinlemesine temizlenmesini sağlar. Derin temizlik, önceki kullanımdan kalan kurumuş damlaların damla tutucusunu temizlemek için özellikle yararlıdır.
    3. 1Damla tutucuyu damıtılmış su ve %70 etanol ile yıkamak için 1. adımı tekrarlayın ve tüy bırakmayan bir mendille kurulayın. Damla tutucu artık kullanıma hazırdır.

2. Temel kinetik

  1. Cihazın ve yazılımın kurulması
    1. Yazılımı açın ve sol panelde Temel Kinetik'i seçin (Ek Şekil 1).
    2. Biyosensör rafını tepsiden (ticari kaynaklardan elde edilen) çıkarın ve tepsiye 96 oyuklu bir plaka yerleştirin. İlk kuyucuğa 200 μL BLI tamponu ekleyin. Ardından, biyosensör tepsisini 96 oyuklu plakanın üzerine geri yerleştirin ve her bir biyosensörün karşılık gelen kuyuya yerleştirildiğinden emin olun. İlk biyosensör şimdi ilk kuyucuktaki BLI tamponuna daldırılmalıdır.
    3. Yazılımda, Hidrat'a tıklayın ve zamanlayıcıyı 10 dakika boyunca açın, böylece tek biyosensörün en az 10 dakika nemlendirmesine izin verin. Adım, BLI testine hazır hale getirmek için biyosensörü nemlendirir.
    4. Biyosensör hidratlanırken, 250 μL BLI tamponunu iki adet 0,5 mL'lik tüpe pipetleyin. Birini "A" (ilişkilendirme) ve diğerini "D" (ayrışma) olarak etiketleyin.
    5. Yazılımdaki ayrıntıları doldurun (Adı: Yüzey Kaplaması ve tahlilin açıklaması: RPA-3'Bio-ss-poly (dT)32: Temel Kinetik).
    6. Her adım için çalışma ayarını yapın: Taban Çizgisi (30 sn), İlişkilendirme (120 sn), Ayrışma (120 sn) (Tablo 1). Tüp ve damla tutucu için çalkalayıcıyı açık tutun. Çalkalayıcı hızı 2200 rpm'ye (Aralık, 1000–2600 rpm) ayarlanmıştır, bu da biyosensör yüzeyine yakın sınırlı difüzyonun neden olduğu kütle taşıma etkilerini önler.
      NOT: Veri toplamayı iyileştirmek için bir bağlama kinetik testi ayarlarken her adımın (taban çizgisi, yükleme, ilişkilendirme, ayrıştırma) süresinin optimize edilmesi önerilir.
  2. Bir temel eğri oluşturma
    1. Tüp A'yı tüp tutucuya yerleştirin ve hidratlı biyosensörü BLI sistemine takın. Tüp tutucuyu biyosensörün altına kaydırın (konum A, Şekil 2).
      NOT: Biyosensörler deney sırasında hiçbir zaman tamamen kurutulmamalıdır. Kurumaya bırakılırsa, deneyin okumaları önemli ölçüde çarpık olabilir.
    2. Çalıştır'a basın ve istem mesajındaki talimatları izleyin.
    3. İlk taban çizgisini tamamladıktan sonra, kapağı açın ve damla tutucuya 4 μL BLI tamponu ekleyin. Aynı biyosensörün altında sağa kaydırın (konum B, Şekil 2). Kapağı kapatın ve yazılımdaki BLI eğrisini izleyin (Şekil 3, mavi eğri).
    4. Tamamlandıktan sonra, 'A' tüpünü 'D' ile değiştirmek için kapağı açın ve biyosensörün altına kaydırın (konum A, Şekil 2). Kapağı kapatın ve ayrıştırma adımına devam edin. Tamamlandıktan sonra kapağı açın, biyosensörü çıkarın, tekrar tepsiye yerleştirin ve biyosensörün BLI tamponuna batırıldığından emin olun.
    5. Numuneyi/tamponu çıkarın, tüy bırakmayan mendillerle kurutmadan önce damla tutucuyu bir tamponla temizleyin ve tüp tutucudan 'D' tüpünü çıkarın.
  3. Yüzey kaplama
    1. Tüp A'yı tüp tutucuya yerleştirin ve hidratlı biyosensörü BLI sistemine takın. Tüp tutucuyu biyosensörün altına kaydırın ve Çalıştır'a basın.
    2. İlk temel adımdan sonra, damla tutucuya 4 μL 12,5 nM substrat [3'Bio-ss-poly (dT)32] ekleyin ve biyosensörün altına kaydırın. Kapağı kapatın ve yazılımdaki BLI eğrisini izleyin. Bu yanıtın taban çizgisinden daha yüksek olduğundan emin olun (Şekil 3).
      NOT: Substrat konsantrasyonu, biyosensörlerin farklı konsantrasyonlarla kaplanmasıyla (biyosensör başına yalnızca bir konsantrasyon) ve bağlanma eğrileri gözlemlenerek optimize edilebilir. Taban çizgisine kıyasla gözle görülür şekilde daha yüksek bir sinyale sahip bir bağlama eğrisi, alt tabaka kaplamasını doğrulamak için yeterlidir. Biyosensörün aşırı yüklenmesi, yüzeyde sterik tıkanıklığa veya kalabalıklaşmaya neden olabilir. Şekil 3, biyotinile edilmiş 3'Bio-ss-poly (dT)32 substratının beş konsantrasyonu için eğrileri göstermektedir. Ek olarak, yem yükleme adımı tamamlandıktan sonra, biyosensörler 30 saniye boyunca streptavidin bloke edici tampona (biyositin) daldırılabilir ve ardından BLI tamponunda yıkanabilir. Bu, bağlanmamış streptavidin yüzeyini bloke edecek ve spesifik olmayan bağlanmayı önleyecektir.
    3. İlişkilendirme adımını tamamladıktan sonra, kapağı açın ve 'A' tüpünü 'D' tüpü ile değiştirin. Biyosensörün altına kaydırın ve kapağı kapatın.
    4. Ayrıştırma adımı tamamlandıktan sonra kapağı açın, biyosensörü ayırın ve BLI tamponunu içeren biyosensör tepsisine yerleştirin. Biyosensörün tampona tamamen daldırıldığından ve sonraki adımlar için yeterince nemlendirildiğinden emin olun. Damla tutucuyu tahlil tamponu ile temizleyin, tüy bırakmayan mendillerle kurulayın ve tüp tutucudan 'D' tüpünü çıkarın. Biyosensör şimdi 3'Bio-ss-poly (dT)32 substratı ile kaplanmıştır.
  4. Protein bağlanması
    1. 250 μL BLI tamponunu on adet 0,5 mL siyah mikrofüj tüpüne pipetleyin. Bunları A1'den A5'e ve D1'den D5'e etiketleyin.
    2. Başka bir 96 oyuklu plakada, hidratlı biyosensörün konumuna karşılık gelen kuyuya 200 μL sıyırma tamponu ekleyin.
    3. Teste başlamadan önce, damla tutucuyu 3x BLI tamponu ile temizleyin.
    4. Yazılımda yeni bir dosya açın ve sol panelde Temel Kinetik'i seçin. Testi adlandırın ve gerektiği gibi açıklama ekleyin (Ek Şekil 2). Çalıştırma ayarlarını gerektiği gibi ayarlayın (Tablo 1).
    5. A1 etiketli tüpü tüp tutucuya yerleştirin ve 3'Bio-ss-poly (dT)32 kaplı biyosensörü BLI sistemine takın. Tüpü biyosensörün altına kaydırın ve Çalıştır'a basın.
    6. İlk temel adımı tamamladıktan sonra, kapağı açın, damla tutucuya 4 μL BLI tamponu ekleyin ve biyosensörün altına kaydırın. Bu, 0 nM protein konsantrasyonu olacak ve referans eğrisi olarak görev yapacaktır.
    7. İlişkilendirme adımını tamamladıktan sonra, A1 tüpünü D1 ile değiştirin ve biyosensörün altına kaydırın.
    8. Ayrıştırma adımı tamamlandıktan sonra biyosensörü çıkarın ve tekrar tepsisine yerleştirin. Biyosensörün tampona tamamen daldırıldığından ve sonraki adımlar için yeterince nemlendirildiğinden emin olun. D1 tüpünü çıkarın, damla tutucuyu tahlil tamponu ile temizleyin ve tüy bırakmayan bir mendille kurulayın.
    9. Daha sonra, 5 nM RPA stoğu için bağlanma eğrisi elde edilecektir. Örnek ayrıntılarını doldurun (Konsantrasyon: 5 nM, Molekül ağırlığı: 116 KDa] ve Calc. Bu, protein konsantrasyonunu μg/μL cinsinden hesaplayacaktır.
    10. 3'Bio-ss-poly (dT)32 kaplı biyosensörü takın ve tüp A2'yi tüp tutucuya yerleştirin. Biyosensörün altına kaydırın ve Çalıştır'a basın.
    11. Taban çizgisinden sonra, damla tutucuya 4 μL 5 nM RPA ekleyin ve biyosensörün altına kaydırın. Kapağı kapatın ve ilişkilendirme eğrisini izleyin. Proteinin yeme bağlanması, temel eğriden daha yüksek uzanan bir eğri ile görselleştirilebilir. İlişkilendirme adımından sonra A2'yi D2 ile değiştirin, biyosensörün altına kaydırın ve ayrışma adımını tamamlayın.
    12. Biyosensörü çıkarın, 30 saniye boyunca sıyırma tamponuna daldırın ve ardından 3 dakika boyunca BLI tamponuna batırın.
      NOT: Rejenerasyon verimliliği, hareketsiz hale getirilmiş yeme ve bozulmuş analite bağlıdır. Bazı hareketsiz biyosensörler, on veya daha fazla rejenerasyon döngüsüne dayanabilir. Yanıtta gözle görülür bir değişiklik gözlemlemeden biyotinile edilmiş 3'Bio-ss-poly (dT)32 substratını üç defadan fazla sıyırabiliriz (Ek Şekil 3).
    13. Diğer üç RPA 2.4.9 nM, 2.4.12 nM, 10 nM ve 20 nM konsantrasyonları için 40–40 adımlarını tekrarlayın. Her konsantrasyon için biyosensörü çıkardığınızdan emin olun.
      NOT: BLI tahlilleri için uzmanlar, doğru kinetik ölçümler için beklenenKD'nin kabaca 0,1 katı ila 10 katı arasında değişen dört (referans eğrisi hariç) konsantrasyon kullanılmasını önermektedir. Burada, dört konsantrasyon seri seyreltmelerle elde edildi.
  5. Verilerin analiz edilmesive KD değerlerinin hesaplanması
    1. KD değerini hesaplamadan önce, 3'Bio-ss-poly (dT)32 substratı üzerindeki her bir RPA bağlanma konsantrasyonu için sensorgramı görsel olarak incelemek gerekir. İmmobilize DNA doygunluğa ulaşana kadar BLI sinyalinin artan RPA konsantrasyonu ile arttığından emin olun (Şekil 4).
      NOT: Güvenilir sonuçlar için, 0 nM analit konsantrasyonu hariç en az dört protein konsantrasyonunun substrata başarıyla bağlandığından emin olun. Olası hataları gidermek için tartışma bölümüne bakın.
    2. 'Çalıştırma Listesi' tablosunda, bir referans eğrisi olarak hizmet etmek için 0 nM analit konsantrasyonu için Ref'i kontrol edin. Analitin tüm konsantrasyonları için Analiz'i kontrol edin.
    3. Ardından, adım düzeltme için hem İlişkilendirme başlangıcı'nı hem de Ayrışma başlangıcı'nı seçin. Bu, ilişkilendirmenin başlangıcını taban çizgisinin sonu ile ve ayrışmanın başlangıcını ilişkinin sonu ile hizalayacaktır, bu genellikle tampon iyi eşleşirse damla tutucu ve tüp arasındaki farklı yansıma desenlerinin neden olduğu şeydir.
    4. Bu test için Global Fitting (1:1) öğesini seçin. Global analiz, tüm bir protein konsantrasyonu setiiçin KD değerlerini hesaplarken, yerel analiz tek bir protein konsantrasyonu içindir.
      NOT: Cihaza eşlik eden yazılım yalnızca 1:1 montaja izin verir. Bu, yem ve analitin diğer montaj modellerine uyması beklendiğinde potansiyel bir uyarı olabilir. Bu yazılımdan elde edilen veriler diğer çizim yazılımlarına aktarılabilir ve gerekli montaj modellerine sığabilir.
    5. Ardından Analiz Et'i seçin. Bu, KD, ka/kd değerlerini hesaplayacaktır (Tablo 2). Değerin %10'u içindeki k,a ve k, d hatası genellikle kabul edilebilir olarak kabul edilir.
      NOT: Bu değerlerin makul sınırlar içinde olduğundan emin olun. Hata %10'dan azsa, biyolojik moleküller arasındaki etkileşimleri incelemek için verilerin uydurulmasının güvenilir olduğunu gösterir. Ek olarak, bu ka ve kd değerleri kullanılarak hesaplananKD (denge ayrışma sabiti) çoğu pratik uygulama için yeterince doğru olmalıdır18.
    6. Takılan verileri dışa aktarmak için, analiz edilen veriler kullanılarak oluşturulan grafiğe sağ tıklayın. Verileri Dışa Aktar'ı seçin, ardından Metin/Veri'yi seçin. Verileri '.dat' biçiminde kaydetmek için Dosya ve Gözat'a tıklayın. Bu dosya Microsoft Excel'de açılabilir ve grafik çizimi için diğer yazılımlarda kullanılabilir.
      NOT: Global uydurma, grup içindeki tüm bağlanma eğrisi verilerini dikkate alırken, yerel uydurma, her bir analit konsantrasyonu için yalnızca kinetik parametrelere odaklanır.

3. Enstrümanı gelişmiş kinetiği çalıştıracak şekilde ayarlama

  1. Yazılımı açın ve sol panelde Gelişmiş Kinetik'i seçin (Ek Şekil 1).
  2. Biyosensörleri tutan tepsiye 96 oyuklu bir plaka yerleştirin. Beş kuyucuğa 200 μL BLI tamponu ekleyin. Biyosensör tepsisini 96 oyuklu plakaya yerleştirin, böylece beş biyosensör tamponu içeren kuyuya daldırılır.
  3. Yazılımda, Hidrat'a tıklayın ve zamanlayıcıyı 10 dakika boyunca açın, böylece tek biyosensörün en az 10 dakika nemlendirmesine izin verin.
  4. Biyosensörler nemlendirme yaparken, 250 μL BLI tamponunu on adet 0,5 mL siyah santrifüj tüpüne pipetleyin. Bunları A1 ila A5 ve D1 ila D5 olarak etiketleyin.
  5. Yazılımdaki ayrıntıları doldurun (Adı: Substrat Kaplaması ve tahlilin açıklaması: RPA-3'Bio-ss-poly (dT)32: Gelişmiş Kinetik).
  6. Her adım için süreyi girin (Ek Şekil 4). Başlangıç Taban Çizgisi (30 sn), Yükleme (120 sn), Taban Çizgisi (30 sn), İlişkilendirme (120 sn), Ayrışma (120 sn). Çalıştırma ayarlarını gerektiği gibi ayarlayın (Tablo 1).
    1. Yazılımdaki ayrıntıları doldurun (Konsantrasyon: 0 nM, Moleküler Ağırlık: 116 kDa) ve Calc'a basın.
  7. A1 tüpünü tüp tutucuya yerleştirin ve biyosensörü takın. Tüp tutucuyu biyosensörün altına kaydırın ve ilk taban çizgisini elde etmek için Çalıştır'a basın.
  8. Damla tutucuya 4 μL 12,5 nM alt tabaka ekleyin ve biyosensörün altına kaydırın. Kapağı kapatın. Bu, alt tabakayı biyosensöre yükleyecektir. Tüp tutucudaki A1'i D1 ile değiştirin ve biyosensörün altına kaydırın. Bu, temel eğriyi verecektir.
  9. Damla tutucuyu tüy bırakmayan bir mendille temizleyin ve 4 μL BLI tamponu yükleyin. Biyosensörün altına kaydırın ve kapağı kapatın. Bu, 0 nM protein konsantrasyonu olacak ve referans eğrisi olarak görev yapacaktır.
  10. İlişkilendirme adımını tamamladıktan sonra, D2 tüpünü biyosensörün altına kaydırın. Ayrıştırma adımıyla devam edin. Ayrışmanın tamamlanmasına izin verin.
  11. Biyosensörü ayırın, D2'yi tüp tutucusundan çıkarın ve damla tutucuyu tüy bırakmayan bir mendille temizleyin.
  12. Bir sonraki çalıştırma için ayrıntıları (Konsantrasyon: 5 nM, Molekül ağırlığı: 116 kDa) girin ve Calc'a basın.
  13. İkinci biyosensörü BLItz sistemine takın, tüp A2'yi tüp tutucuya yerleştirin ve biyosensörün altına kaydırın.
  14. İlk taban çizgisini oluşturduktan sonra, damla tutucuya 4 μL 12,5 nM alt tabaka ekleyin. Biyosensörün altına kaydırın ve kapağı kapatın. A2 tüpünü D3 ile değiştirin ve biyosensörün altına kaydırın. Ardından, tüp tutucuya 4 μL 10 nM RPA stoğu ekleyin ve biyosensörün altına kaydırın.
  15. İlişkilendirmeden sonra, ayrışma için biyosensörün altına D4'ü kaydırın.
  16. Sonraki üç RPA konsantrasyonu (10 nM, 20 nM, 40 nM) için 3.1.12–3.1.15 adımlarını tekrarlayın. Bu konsantrasyonlar için bağlanma eğrileri Şekil 5'te gösterilmiştir.
  17. Veri analizive KD değeri , BLI temel kinetiği ile aynı prosedüre yerleştirilebilir (adım 2.5, Tablo 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

BLI'da beyaz ışık, biyokatman/tampon arayüzünden ve dahili referans arayüzünden spektrometreye yansıtılır. Elde edilen girişim modeli kaydedilir ve spektral kayma belirli bir süre boyunca ölçülür ve nm cinsinden bağlanma eğrileri yanıtı olarak gösterilir. Analit bağlaması olan ve olmayan biyosensör ucunu ve karşılık gelen spektral dalga boyu kaymasını (nm) gösteren temsili bir şekil Şekil 1'de gösterilmektedir. Bağlanma eğr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

BLI kullanarak herhangi bir proteinin substratına bağlanma kinetiğini analiz etme yeteneği, hücre19 içindeki protein-DNA etkileşimlerini yöneten spesifik faktörleri (bir DNA'nın dizisi, yapısı veya uzunluğu gibi) izole etmek ve karakterize etmek için araçlar sağlar. Biyokatman interferometrisi prensiplerine dayanan Octet N1 sistemi, protein-protein ve protein-nükleik asit etkileşimlerinin kantitatif ölçümüne izin verir. Ayrıca, lipitler, ant...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (1929346) ve Amerikan Kanser Derneği'nden (RSG-21-028-01) alınan hibelerle finanse edilmiştir. Yararlı tartışmalar için Balakrishnan laboratuvarı üyelerine de teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 mL Micro Centrifuge TubesGlobe Scientific111554A
96 Well Standard Black MicroplateDot Scientific4ti-0223
Biotinylated poly dT OligonucleotideIDT
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153-10G
Dithiothreitol (DTT)Dot ScientificDSD11000-10
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Dot ScientificDSE57020-500
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-500
Kimtec Science Kimwipes Kimtech34120
Octet N1 SoftwareSartorius 1.4.0.13
Octet SA Biosensor Sartorius 18-5019
PBS pH 7.2 (10x)Gibco1666711
Personal Assay Octet N1 SystemSartorius 
Phosphoric Acid Ward's Science470302-024
Sodium Chloride (NaCl)Dot ScientificDSS23020-5000
Tris BaseDot ScientificDST60040-5000
Tween20 Bio-Rad170-6531

Referanslar

  1. Kalodimos, C. G., et al. Structure and flexibility adaptation in non-specific and specific protein-DNA complexes. Science. 305 (5682), 386-389 (2004).
  2. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9 (23), 6505-6525 (1981).
  3. Lane, D., Prentki, P., Chandler, M. Use of gel retardation to analyze protein-nucleic acid interactions. Microbiol Rev. 56 (4), 509-528 (1992).
  4. Dyer, R. B., Herzog, N. K. Immunodepletion EMSA: A novel method to identify proteins in a protein-DNA complex. Nucleic Acids Res. 23 (16), 3345-3346 (1995).
  5. Dudley, R. K. A laboratory guide to in vitro studies of protein-DNA interactions. FEBS Lett. 306, 2-3 (1991).
  6. Tsai, C., Smider, V., Hwang, B. J., Chu, G. Electrophoretic mobility shift assays for protein-DNA complexes involved in DNA repair. Methods Mol Biol. 920, 53-78 (2012).
  7. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).
  8. Heffler, M. A., Walters, R. D., Kugel, J. F. Using electrophoretic mobility shift assays to measure equilibrium dissociation constants: GAL4-p53 binding DNA as a model system. Biochem Mol Biol Educ. 40 (6), 383-387 (2012).
  9. Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. J Vis Exp. (84), e51383(2014).
  10. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J Pharm Biomed Anal. 72, 150-154 (2013).
  11. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
  12. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).
  13. Schasfoort, R. B. M., Tudos, A. J. Handbook of surface plasmon resonance. , RSC Pub. (2008).
  14. Douzi, B. Surface plasmon resonance: A sensitive tool to study protein-protein interactions. Methods Mol Biol. 2715, 363-382 (2024).
  15. Douzi, B. Protein-protein interactions: Surface plasmon resonance. Methods Mol Biol. 1615, 257-275 (2017).
  16. Drescher, D. G., Selvakumar, D., Drescher, M. J. Analysis of protein interactions by surface plasmon resonance. Adv Protein Chem Struct Biol. 110, 1-30 (2018).
  17. Martin, S. R., Ramos, A., Masino, L. Biolayer interferometry: Protein-RNA interactions. Methods Mol Biol. 2263, 351-368 (2021).
  18. Apiyo, D. Biomolecular binding kinetics assays on the Octet BLI platform. , https://www.sartorius.com/resource/blob/742330/05671fe2de45d16bd72b8078ac28980d/octet-biomolecular-binding-kinetics-application-note-4014-en-1--data.pdf (2022).
  19. Barrows, J. K., Van Dyke, M. W. Biolayer interferometry for DNA-protein interactions. PLoS One. 17 (2), e0263322(2022).
  20. Desai, M., Di, R., Fan, H. Application of biolayer interferometry (BLI) for studying protein-protein interactions in transcription. J Vis Exp. (149), e59687(2019).
  21. Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic acid interactions by biolayer interferometry. Curr Protoc Protein Sci. 79, 19.25.1-19.25.26 (2015).
  22. Petersen, R. L. Strategies using bio-layer interferometry biosensor technology for vaccine research and development. Biosensors (Basel). 7 (4), 49(2017).
  23. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization. Comb Chem High Throughput Screen. 12 (8), 791-800 (2009).
  24. Wold, M. S. Replication protein A: A heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism. Annu Rev Biochem. 66, 61-92 (1997).
  25. Qureshi, M. H., Ray, S., Sewell, A. L., Basu, S., Balci, H. Replication protein A unfolds G-quadruplex structures with varying degrees of efficiency. J Phys Chem B. 116 (19), 5588-5594 (2012).
  26. Wold, M. S., Kelly, T. Purification and characterization of replication protein A, a cellular protein required for in vitro replication of simian virus 40 DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (8), 2523-2527 (1988).
  27. Bochkareva, E., Korolev, S., Lees-Miller, S. P., Bochkarev, A. Structure of the RPA trimerization core and its role in the multistep DNA-binding mechanism of RPA. EMBO J. 21 (7), 1855-1863 (2002).
  28. Brosey, C. A., et al. NMR analysis of the architecture and functional remodeling of a modular multidomain protein, RPA. J Am Chem Soc. 131 (18), 6346-6347 (2009).
  29. Fanning, E., Klimovich, V., Nager, A. R. A dynamic model for replication protein A (RPA) function in DNA processing pathways. Nucleic Acids Res. 34 (15), 4126-4137 (2006).
  30. Gibb, B., et al. Protein dynamics during presynaptic-complex assembly on individual single-stranded DNA molecules. Nat Struct Mol Biol. 21 (10), 893-900 (2014).
  31. Nguyen, B., et al. Diffusion of human replication protein A along single-stranded DNA. J Mol Biol. 426 (19), 3246-3261 (2014).
  32. Brosey, C. A., et al. Functional dynamics in replication protein A DNA binding and protein recruitment domains. Structure. 23 (6), 1028-1038 (2015).
  33. Chen, R., Subramanyam, S., Elcock, A. H., Spies, M., Wold, M. S. Dynamic binding of replication protein a is required for DNA repair. Nucleic Acids Res. 44 (12), 5758-5772 (2016).
  34. Kemmerich, F. E., et al. Force regulated dynamics of RPA on a DNA fork. Nucleic Acids Res. 44 (12), 5837-5848 (2016).
  35. Pokhrel, N., et al. Dynamics and selective remodeling of the DNA-binding domains of RPA. Nat Struct Mol Biol. 26 (2), 129-136 (2019).
  36. Wang, Q. M., et al. Human replication protein A induces dynamic changes in single-stranded DNA and RNA structures. J Biol Chem. 294 (38), 13915-13927 (2019).
  37. Wyka, I. M., Dhar, K., Binz, S. K., Wold, M. S. Replication protein A interactions with DNA: Differential binding of the core domains and analysis of the DNA interaction surface. Biochemistry. 42 (44), 12909-12918 (2003).
  38. Kim, C., Snyder, R. O., Wold, M. S. Binding properties of replication protein A from human and yeast cells. Mol Cell Biol. 12 (7), 3050-3059 (1992).
  39. Caldwell, C. C., Spies, M. Dynamic elements of replication protein A at the crossroads of DNA replication, recombination, and repair. Crit Rev Biochem Mol Biol. 55 (5), 482-507 (2020).
  40. Mishra, A. K., Dormi, S. S., Turchi, A. M., Woods, D. S., Turchi, J. J. Chemical inhibitor targeting the replication protein A-DNA interaction increases the efficacy of Pt-based chemotherapy in lung and ovarian cancer. Biochem Pharmacol. 93 (1), 25-33 (2015).
  41. Gavande, N. S., et al. Structure-guided optimization of replication Protein A (RPA)-DNA interaction inhibitors. ACS Med Chem Lett. 11 (6), 1118-1124 (2020).
  42. Ana Jug, T. B., Janez Ilaš, Biolayer interferometry and its applications in drug discovery and development. TrAC Trends Anal Chem. 176, 117741(2024).
  43. Gator Bio, I. Using BLI for viral and lipid-based vector analytics. , News Medical. https://www.news-medical.net/whitepaper/20230322/Using-BLI-for-viral-and-lipid-based-vector-analytics.aspx (2023).
  44. Noy-Porat, T., et al. Characterization of antibody-antigen interactions using biolayer interferometry. STAR Protoc. 2 (4), 100836(2021).
  45. Onyekachi Ononye, S. S., et al. Biochemical impact of p300-mediated acetylation of replication protein A: Implications for DNA metabolic pathway choice. bioRxiv. , (2024).
  46. Weeramange, C. J., Fairlamb, M. S., Singh, D., Fenton, A. W., Swint-Kruse, L. The strengths and limitations of using biolayer interferometry to monitor equilibrium titrations of biomolecules. Protein Sci. 29 (4), 1018-1034 (2020).
  47. Artem Stetsenko, A. G. An Overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization. Crystals. 7 (7), 197(2017).
  48. Hubbe, M. A., Szlek, D. B., Vera, R. E. Detergency mechanisms and cellulosic surfaces: A review. BioResources. 17 (4), 7167-7249 (2022).
  49. Renee Tobias, S. K., Apiyo, A. Research the Industry Standard for Label-Free of Biomolecular Interactions Analysis (BIA). , https://www.sartorius.com/en/products/biolayer-interferometry/bli-resources (2021).
  50. Octet NTA Biosensor Kinetic Assays. , Sartorius. https://www.sartorius.com/resource/blob/552398/b27ccc2fdfde7a9320909572ced3f6a1/ni-nta-biosensor-kinetic-assays-technical-note-en-sartorius-data.pdf (2024).
  51. Application Guides: Kinetics and affinity measurements with Biacore systems. , Cytiva. Available from: https://cdn.cytivalifesciences.com/api/public/content/digi-33042-pdf (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyokimyaSay 215BLI kineti ibiyotabaka interferometrisiprotein DNA etkile imleriayr ma sabitiili kitemel kinetikileri kinetik

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır