JoVE Logo
Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Untersuchung von DNA-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung eines Streptavidin-basierten Biolayer-Interferometrie-Systems (BLI). Es werden die wesentlichen Schritte und Überlegungen zur Verwendung grundlegender oder fortgeschrittener Bindungskinetik zur Bestimmung der Gleichgewichtsbindungsaffinität (KD) der Wechselwirkung beschrieben.

Zusammenfassung

Protein-DNA-Wechselwirkungen untermauern essentielle zelluläre Prozesse. Das Verständnis dieser Wechselwirkungen ist entscheidend für die Aufklärung der molekularen Mechanismen verschiedener Signalwege. Schlüsselfaktoren wie die Struktur, Sequenz und Länge eines DNA-Moleküls können die Proteinbindung maßgeblich beeinflussen. Die Bioschichtinterferometrie (BLI) ist eine markierungsfreie Technik, die die Bindungskinetik zwischen Molekülen misst und einen einfachen und präzisen Ansatz zur quantitativen Untersuchung von Protein-DNA-Wechselwirkungen bietet. Ein großer Vorteil von BLI gegenüber herkömmlichen gelbasierten Methoden ist die Fähigkeit, Echtzeitdaten über die Bindungskinetik zu liefern, was eine genaue Messung der Gleichgewichtsdissoziationskonstante (KD) für dynamische Protein-DNA-Wechselwirkungen ermöglicht. In diesem Artikel wird ein grundlegendes Protokoll zur Bestimmung desKD-Wertes der Wechselwirkung zwischen einem DNA-Replikationsprotein, dem Replikationsprotein A (RPA) und einem einzelsträngigen DNA-Substrat (ssDNA) vorgestellt. RPA bindet ssDNA mit hoher Affinität, muss aber auch leicht verdrängt werden, um nachfolgende Proteininteraktionen innerhalb biologischer Signalwege zu erleichtern. Im beschriebenen BLI-Assay wird biotinylierte ssDNA auf einem Streptavidin-beschichteten Biosensor immobilisiert. Anschließend wird die Bindungskinetik (Assoziation und Dissoziation) von RPA an die Biosensor-gebundene DNA gemessen. Die resultierenden Daten werden analysiert, um mit Hilfe von Systemsoftware genaue Werte für die Assoziationsratenkonstante (ka), die Dissoziationsratenkonstante (kd) und die Gleichgewichtsbindungskonstante (KD) abzuleiten.

Einleitung

Zelluläre Proteine spielen eine zentrale Rolle bei der Orchestrierung der komplexen biologischen Prozesse, die in lebenden Organismen ablaufen. Das optimale Funktionieren dieser Signalwege hängt vom Zusammenspiel zwischen Proteinen und anderen Biomolekülen innerhalb der Zelle ab, einschließlich der Wechselwirkungen mit Partnerproteinen und Nukleinsäuren1. Um die Feinheiten zellulärer Prozesse zu verstehen, ist daher ein tiefes Verständnis der Dynamik der Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen erforderlich.

Traditionell wurden Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen mit Hilfe von elektrophoretischen Mobilitäts-Gel-Shift-Assays (EMSAs)2 untersucht. In diesem Assay werden Proteine für einen kurzen Zeitraum mit synthetischen Oligonukleotiden (entweder DNA/RNA, die spezifische Längen oder Sequenzen enthalten) inkubiert, und die Reaktion wird dann auf einem nativen Polyacrylamid (PAGE)-Gel 3,4,5 elektrophoresiert. Um die Protein-Oligonukleotid-Wechselwirkung sichtbar zu machen, werden die Oligonukleotide typischerweise mit 32P radioaktiv markiert oder mit fluoreszierenden Molekülen markiert. Wenn das Protein interagiert und das Oligonukleotid bindet, verlangsamt die Bindung des Proteins die Beweglichkeit der Nukleinsäure innerhalb des Gels 6,7. Daher wird diese Methode auch als Gel-Shift- oder Gel-Retardations-Assay bezeichnet. Obwohl diese Methode ausgiebig verwendet wurde, gibt es einige Einschränkungen, die bei der Verwendung dieser Methode zur Erzielung von KD-Werten zu berücksichtigen sind, einschließlich einer geringen Auflösung durch schwache oder dynamische Bindung, der Anforderung einer signifikant hohen Konzentration von Proteinen und mehr Aufwand. Darüber hinaus sind EMSAs keine Echtzeit-Assays und können daher die Bindungskinetik nicht genau messen 7,8.

Innovative Techniken wie die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) und die Bioschichtinterferometrie (BLI) sind entstanden, um diese Einschränkungen zu überwinden 9,10,11,12. Beide Methoden messen Assoziations-/Dissoziationsratenkonstanten und Affinitätskonstanten zwischen Molekülen auf markierungsfreie Weise. Da das Protein nicht markiert werden muss, eliminieren diese Techniken das Risiko, die Eigenschaften des Proteins zu verändern oder die Bindungsstelle zu blockieren. Bei der SPR interagiert polarisiertes Licht mit einem Sensor (einer leitenden Metallfolie, typischerweise Gold) und erzeugt eine Elektronenladungsdichtewelle, die als Plasmon bezeichnet wird. Diese Wechselwirkung verringert die Intensität des reflektierten Strahls, und ein Detektor misst die Änderung des spezifischen Winkels, der als Resonanzwinkel13 bekannt ist. Um die Wechselwirkungen zwischen Ligand (Nukleinsäure) und Analyt (Protein) zu untersuchen, wird der Ligand in einer Flusszelle auf dem Sensorchip immobilisiert und der Analyt in die Flusszelle injiziert, die den immobilisierten Liganden enthält. Bei der Bindung des Analyten an den Liganden kommt es zu einer nachweisbaren Änderung des Brechungsindex in der Nähe der Sensoroberfläche, was die Messung molekularer Wechselwirkungen ermöglicht 14,15,16.

Die Bioschicht-Interferometrie (BLI) misst das Muster der Lichtinterferenz, wenn Licht durch eine optische Faser mit einer Bioschicht fällt, die aus einem Liganden (Köder) und seinem Bindungspartner (Analyt) an der Unterseite der Spitze des Biosensors besteht. Das Licht wird durch die Spitze geleitet und aufgrund der Eigenschaften der Bioschicht an beiden Enden der Bioschicht reflektiert. Die Dicke der Bioschicht ist proportional zur Anzahl der gebundenen Moleküle, die das Muster des reflektierten Lichts beeinflussen. Durch den Vergleich der Änderung der Kurve der relativen Intensität vs. Wellenlänge, die durch Interferenz zwischen dem reflektierten Licht von der Referenzgrenzfläche und der Bioschicht/Puffer-Grenzfläche verursacht wird, kann die Dickenänderung der Bioschicht bestimmt werden. Wenn mehr Moleküle binden, findet eine größere Verschiebung statt, was BLI zu einem leistungsstarken Werkzeug für die Untersuchung biomolekularer Wechselwirkungen in Echtzeit macht. Die Änderung des Interferenzmusters wird gemessen und auf einem Sensorgramm als spektrale Verschiebungdargestellt 17,18 (Abbildung 1A). Die Art der Bindungswechselwirkung kann unter Verwendung geeigneter Kontrollen, wie z. B. eines Aufbaus, dem die ligandenvariierenden Konzentrationen des Bindungspartners 19,20,21 fehlen, genau bestimmt werden. Im Vergleich zu SPR ist BLI kostengünstig und benutzerfreundlich, so dass es für ein breites Spektrum von Forschern zugänglich ist. Darüber hinaus bleiben Proben, die in BLI verwendet werden, intakt, wenn es zu keiner Degradation oder Aggregation kommt. Dadurch können sie möglicherweise zurückgewonnen und wiederverwendet werden, wodurch der Abfall minimiert wird. Das BLI-Gerät kommt ohne den Einsatz von Mikrofluidik aus, wodurch die Nachteile des Fluidiksystems, wie z. B. die Notwendigkeit von Wartung/Pflege, Verstopfung oder die Verwendung von entgasten Puffern, eliminiert werden. Es minimiert auch das Risiko einer Kontamination des Instruments durch ungefilterte oder rohe Proteinproben.

In einem BLI-Experiment wird die Bioschicht durch Immobilisierung des Ködermoleküls auf dem Biosensor hergestellt. Die Bioschicht von Biosensoren kann mit verschiedenen Tags interagieren, wodurch es möglich ist, die Wechselwirkungen zwischen Molekülen (einschließlich Nukleinsäuren, Proteinen, Antikörpern, Viren, kleinen Molekülen usw.) zu untersuchen.22. Verschiedene Abscheidungsstrategien, einschließlich Biotin/Streptavidin, 6X-His-Tag/Ni-NTA, FLAG/anti-FLAG, GST/anti-GST und Antikörper/anti-Fc, können angewendet werden, um diese Immobilisierung zu etablieren. Die Beibehaltung der Struktur und Aktivität des immobilisierten Liganden ist entscheidend für die Auswahl des Biosensors. Die Änderungen im Interferenzmuster werden sowohl durch die Menge des gebundenen Moleküls als auch durch die Matrix23 beeinflusst. Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen werden mit biotinylierten Oligonukleotidsonden untersucht, die auf Streptavidin-beschichteten Biosensoren immobilisiert werden können. Proteinproben, von denen erwartet wird, dass sie mit dem immobilisierten Köder (Oligonukleotid) interagieren, werden für einen bestimmten Zeitraum in einem Bindungspuffer mit dem Oligonukleotid in Kontakt gebracht, um die Assoziation zu messen, und anschließend auf einen leeren Bindungspuffer umgestellt, um die Dissoziation zu messen. Eine schematische Darstellung der Analytbindung und der entsprechenden Änderungen in der Bindungskurve ist in Abbildung 1B dargestellt. Darüber hinaus können Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen auch durch eine umgekehrte Immobilisierungsroute untersucht werden, bei der das Protein (Köder) auf dem Biosensor eingefangen wird und mit der Nukleinsäure (Analyt) interagiert.

Derzeit sind mehrere Instrumente kommerziell erhältlich, die nach dem Prinzip der Biolayer-Interferometrie arbeiten. Ein unkompliziertes und kostengünstiges Instrument ist das Octet N1-System, das über einen einzigen Kanal für den Datendurchsatz verfügt. Er erfordert eine manuelle Bedienung, verbraucht nur ein minimales Probenvolumen (4 μl) und führt die Probenanalyse bei Umgebungstemperaturen 9,23 durch. Dieses Einkanal-Instrument kann die Bindungseffizienz von Proteinen mit einer Größe von mehr als 10 kDa nachweisen und misst Affinitäten im mikromolaren (μM) bis nanomolaren (nM) Bereich11,12. Einige Geräte mit 2, 8, 16 und 96 Kanälen für die automatische Datenauslesung sind ebenfalls verfügbar und sowohl mit 96- als auch mit 384-Well-Formatenkompatibel 19,20. Einige dieser Geräte können auch zwischen 4 °C und 40 °C arbeiten, Biomoleküle mit einem Molekulargewicht von nur 150 Da nachweisen und Affinitäten im millimolaren bis picomolären Bereich messen19,21. Während das beschriebene System kostengünstig ist, bieten die teureren Geräte mit mehreren Kanälen eine automatische Verarbeitung mit hohem Durchsatz. Diese fortschrittlichen Systeme werden häufig bei der Charakterisierung und Entwicklung biologischer Wirkstoffmoleküle eingesetzt 9,23.

Das aktuelle Protokoll beschreibt die Schritte zur Messung der Bindungsparameter von Replikationsprotein A (RPA) zu einzelsträngiger DNA (ss-DNA) unter Verwendung des einkanaligen, manuellen Biolayer-Interferometrie-Systems. RPA ist ein heterotrimerer, ssDNA-bindender Proteinkomplex, der eine entscheidende Rolle in fast allen Aspekten des DNA-Stoffwechsels spielt, einschließlich DNA-Replikation, -Reparatur und -Rekombination24. Aufgrund seiner hohen Affinität zu ssDNA (gemessen im sub-nanomolaren Bereich) kann es schnell an ssDNA binden, die bei verschiedenen DNA-Transaktionen erzeugt wird, sie vor nukleolytischem Abbau schützen und eine spontane Bindung anderer nachgeschalteter Proteine verhindern. RPA spielt auch eine entscheidende Rolle bei der Verhinderung der Bildung nicht-kanonischer Sekundär- und Tertiärstrukturen, wie z. B. G-Quadruplexe25. Menschliche RPA besteht aus drei Untereinheiten: RPA70 (70 kDa), RPA32 (32 kDa) und RPA14 (14 kDa), auch RPA 1, RPA 2 und RPA 3 genannt,jeweils 24,26,27. Diese Untereinheiten beherbergen sechs Oligonukleotid/Oligosaccharid-Bindungsfalten (OB-Falten), die mit A bis F gekennzeichnet sind. Unter diesen befinden sich die DNA-Bindungsdomänen (DBDs) auf den Untereinheiten RPA1 (DBD-A, DBD-B, DBD-C) und RPA2 (DBD-D)28. Zunächst wurde angenommen, dass RPA in Abhängigkeit von der Länge der DNA unterschiedliche Bindungsmodi aufweist, bei denen verschiedene DBDs an bestimmte DNA-Längen gebunden sind29. Daten aus neueren Struktur- und Einzelmolekülstudien haben dazu beigetragen, diese Modelle zu verfeinern und darauf hinzudeuten, dass die Bindung verschiedener DBDs von RPA dynamischer ist als ursprünglich angenommen 30,31,32,33,34,35,36. Dieses Merkmal der dynamischen Bindungseigenschaft ist für die Funktion von RPA wesentlich, da RPA in der Lage sein sollte, während bestimmter DNA-Transaktionen fest an das DNA-Substrat zu binden; Es sollte aber auch in der Lage sein, sich vom Substrat zu lösen, um das Substrat während des biologischen Prozesses an das nächste Protein zu übergeben. Unter Verwendung verschiedener biochemischer Techniken wurde der KD für RPA auf etwa 0,4 nM für ein ss-(polydT)30-Substrat und auf 80 nM bzw. 200 nM für ss-(polydA)257 und dG-(polydG)602-Substrate bestimmt, gemessen durch Fluoreszenzpolarisationsanisotropie (FPA)37,38. RPA zeigt auch eine etwa 50-fach höhere Präferenz für die Bindung an pyrimidinreiche Sequenzen im Vergleich zu Purinen. Obwohl verschiedene biochemische Techniken unterschiedliche KD-Messungen für RPA bestimmt haben, lagen alle Messungen im nanomolaren Bereich, was auf eine hohe Bindungsaffinität von RPA für ssDNA hindeutet. Unter Verwendung der Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRFM) wurde entdeckt, dass RPA basierend auf der Länge der DNA mit mindestens zwei Bindungsmodi assoziiert ist: einer, der bei schnell dissoziierendem (Kd, 680 pM) und einem langsam dissoziierenden (Kd, 60 pM) Komplex definiert wurde33,39. Angesichts seiner zentralen Beteiligung an fast allen DNA-Stoffwechselwegen besteht ein großes Interesse an der Entwicklung von Inhibitoren, die die Interaktion zwischen RPA und einzelsträngiger DNA (ssDNA) behindern können. Diese chemischen Inhibitoren sind entscheidend für die Störung der DNA-Schadensreaktion und machen Krebszellen anfälliger für DNA-schädigende Wirkstoffe, die in klinischen Therapien eingesetzt werden. Die Verwendung des BLI-Assays ermöglicht eine präzise quantitative Bewertung der Wirksamkeit von Inhibitoren bei der Modulation der Bindungsfunktion von RPA 40,41.

Die BLI-Einrichtung ermöglicht unterschiedliche Einstellungen: grundlegende und erweiterte Kinetik. Im Modus der basischen Kinetik besteht der Assay aus drei Hauptphasen: Etablierung, Assoziation und Dissoziation zu Studienbeginn. Vor der Durchführung dieses Assays müssen die Biosensoren jedoch separat beschichtet werden, entweder mit dem Gerät oder manuell auf dem Labortisch. Umgekehrt geht der erweiterte Kinetikmodus über die grundlegenden drei Schritte hinaus und ermöglicht die Einbeziehung zusätzlicher Schritte. Diese ergänzenden Schritte können verschiedenen Zwecken dienen, z. B. zur Konditionierung des Biosensors auf die Pufferveränderungen oder zur Erleichterung der Detektion nachfolgender Proteininteraktionen. Die fortschrittliche Kinetik ermöglicht es auch, den Biosensor durch eine gute Regenerationsmethode vom Analyten zu befreien, um eine mögliche Wiederverwendung zu ermöglichen, vorausgesetzt, der Köder und der Biosensor bleiben intakt. Im Allgemeinen wird die erweiterte Kinetik gegenüber der grundlegenden Kinetik verwendet, wenn der Assay mehrere Schritte umfasst oder der Assay in einem komplexeren Format durchgeführt werden muss.

Dieses Protokoll beschreibt beide Methoden mit demselben Köder [3'Bio-ss-poly (dT)32] und Analyten (RPA). Ein Streptavidin-beschichteter Biosensor wird verwendet, um den Köder zu immobilisieren, und es werden KD-Messungen für den Analyten durchgeführt. Dieses Protokoll beschreibt einen vollständigen Ansatz zur Durchführung eines BLI-Assays unter Verwendung einer Einkanal-Biolayer-Interferometrie, der die Vorbereitung von Biosensorködern, Überlegungen zu Puffern und eine Schritt-für-Schritt-Skizze des Verfahrens umfasst.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

Einzelheiten zu den Reagenzien und der in der Studie verwendeten Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung von Ködern, Analyten, Puffern und Reinigung des Tropfenhalters

  1. Einrichten des Instruments: Schalten Sie das Gerät mindestens 1 Stunde vor Beginn des Experiments ein. Dadurch kann sich die Lampe erwärmen.
  2. Vorbereitung von Stripping- und Reinigungspuffern
    1. Stripping-Puffer: Bereiten Sie 50 mL 0,15 M Phosphorsäure [pH 2,0] vor.
    2. Reinigungspuffer: Bereiten Sie 10 mL mit 0,5 N HCl vor.
  3. Vorbereitung des BLI-Puffers
    1. Bereiten Sie 50 mL 1x BLI-Puffer vor (50 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0,1 mg/mL BSA, 1 mM DTT, 0,05% Tween 20). Diesen Puffer bei 4 °C lagern. Bevor Sie diesen Assay einrichten, bringen Sie den Puffer auf Raumtemperatur.
      HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, frische Puffer für den Assay vorzubereiten, da gealterte Puffer pH-Veränderungen oder die Bildung von Aggregaten aufweisen und mikrobielle Kontaminationen aufweisen können, die die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit der Ergebnisse beeinträchtigen können. Es wird nicht empfohlen, Puffer zu verwenden, die länger als zwei Wochen gelagert wurden.
  4. Vorbereitung des Köders/Substrats
    1. Bereiten Sie 12,5 nM 3'Bio-ss-poly (dT)32-Substrat (5' TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TT TT TT 3'Bio) mit BLI-Puffer vor.
  5. Herstellung von Proteinkonzentrationsmaterialien
    1. Bereiten Sie vier RPA-Konzentrationen (5 nM, 10 nM, 20 nM, 40 nM) unter Verwendung von BLI-Puffer vor. Die höchste Konzentration des Proteins (40 nM) wird durch Verdünnung des Stammproteins in BLI-Puffer erreicht. Nachfolgende Verdünnungen werden durch serielle Verdünnung der 40 nM Arbeitslösung hergestellt. Stellen Sie sicher, dass alle Proteinvorräte während des gesamten Experiments auf Eis gehalten werden, um die Stabilität zu erhalten.
  6. Reinigung des Tropfenhalters
    1. Fügen Sie 4 μL destilliertes Wasser hinzu und reinigen Sie den Tropfenhalter mit einem fusselfreien Tuch (3x wiederholen). Wiederholen Sie anschließend diesen Schritt mit 4 μl 70%igem Ethanol und reinigen Sie ihn mit einem fusselfreien Tuch. Dieser Schritt sorgt für die Entfernung von Oberflächenverunreinigungen und Staubpartikeln.
    2. Fügen Sie 4 μl 0,5 N HCl hinzu und lassen Sie es 1 Minute lang im Tropfenhalter. Reinigen Sie es mit einem fusselfreien Tuch und wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal. Dies gewährleistet eine gründliche Reinigung des Tropfenhalters. Eine gründliche Reinigung ist besonders nützlich, um den Tropfenhalter von eingetrockneten Tropfen aus dem vorherigen Gebrauch zu reinigen.
    3. 1Wiederholen Sie Schritt 1, um den Tropfenhalter mit destilliertem Wasser und 70% Ethanol zu waschen und mit einem fusselfreien Tuch trocken zu wischen. Der Tropfenhalter ist nun einsatzbereit.

2. Grundlegende Kinetik

  1. Einrichten des Geräts und der Software
    1. Öffnen Sie die Software und wählen Sie im linken Bereich Basic Kinetics (Ergänzende Abbildung 1).
    2. Nehmen Sie das Gestell mit den Biosensoren (aus kommerziellen Quellen) aus dem Fach und setzen Sie eine 96-Well-Platte in das Fach ein. Geben Sie 200 μl BLI-Puffer in die erste Vertiefung. Positionieren Sie dann das Fach mit den Biosensoren wieder auf der 96-Well-Platte und stellen Sie sicher, dass jeder Biosensor in die entsprechende Vertiefung eingesetzt wird. Der erste Biosensor sollte nun in den BLI-Puffer in der ersten Vertiefung eingetaucht werden.
    3. Klicken Sie in der Software auf Hydrate und schalten Sie den Timer für 10 Minuten ein, sodass der einzelne Biosensor mindestens 10 Minuten lang hydratisieren kann. Der Schritt hydratisiert den Biosensor, um ihn für den BLI-Assay vorzubereiten.
    4. Während der Biosensor hydratisiert wird, pipettieren Sie 250 μl BLI-Puffer in zwei 0,5-ml-Röhrchen. Beschriften Sie den einen als "Assoziation" und den anderen als "D" (Dissoziation).
    5. Geben Sie die Details in der Software ein (Name: Substrate Coating und Beschreibung des Assays: RPA- 3'Bio-ss-poly (dT)32: Basic Kinetics).
    6. Passen Sie die Laufeinstellung für jeden Schritt an: Grundlinie (30 s), Assoziation (120 s), Dissoziation (120 s) (Tabelle 1). Lassen Sie den Shaker für die Tube und den Tropfenhalter eingeschaltet. Die Drehzahl des Schüttlers ist auf 2200 U/min (Bereich, 1000–2600 U/min) eingestellt, wodurch die Stofftransporteffekte verhindert werden, die durch die begrenzte Diffusion in der Nähe der Biosensoroberfläche verursacht werden.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, die Dauer für jeden Schritt (Ausgangswert, Laden, Assoziieren, Dissoziieren) bei der Einrichtung eines Bindungskinetik-Assays zu optimieren, um die Datenerfassung zu verbessern.
  2. Festlegen einer Basislinienkurve
    1. Setzen Sie den Schlauch A in den Schlauchhalter ein und befestigen Sie den hydratisierten Biosensor am BLI-System. Schieben Sie den Röhrchenhalter unter den Biosensor (Position A, Abbildung 2).
      HINWEIS: Biosensoren dürfen zu keinem Zeitpunkt des Versuchs vollständig getrocknet werden. Wenn man es trocknen lässt, können die Messwerte des Experiments erheblich verzerrt werden.
    2. Klicken Sie auf Ausführen und folgen Sie den Anweisungen in der Eingabeaufforderung.
    3. Öffnen Sie nach Abschluss der anfänglichen Basislinie den Deckel und geben Sie 4 μl BLI-Puffer in den Tropfenhalter. Schieben Sie ihn nach rechts unter denselben Biosensor (Position B, Abbildung 2). Schließen Sie den Deckel und überwachen Sie die BLI-Kurve in der Software (Abbildung 3, blaue Kurve).
    4. Öffnen Sie nach Fertigstellung den Deckel, ersetzen Sie den Schlauch "A" durch "D" und schieben Sie ihn unter den Biosensor (Position A, Abbildung 2). Schließen Sie den Deckel und fahren Sie mit dem Dissoziationsschritt fort. Öffnen Sie nach Fertigstellung den Deckel, nehmen Sie den Biosensor ab, setzen Sie ihn wieder in das Fach ein und stellen Sie sicher, dass der Biosensor in BLI-Puffer getaucht ist.
    5. Entfernen Sie die Probe/den Puffer, reinigen Sie den Tropfenhalter mit einem Puffer, bevor Sie ihn mit fusselfreien Tüchern trocknen, und entfernen Sie das Röhrchen "D" aus dem Röhrchenhalter.
  3. Beschichtung von Substraten
    1. Setzen Sie den Schlauch A in den Schlauchhalter ein und befestigen Sie den hydratisierten Biosensor am BLI-System. Schieben Sie den Röhrchenhalter unter den Biosensor und drücken Sie auf Ausführen.
    2. Geben Sie nach dem ersten Basisschritt 4 μl 12,5 nM-Substrat [3'Bio-ss-poly (dT)32] in den Tropfenhalter und schieben Sie es unter den Biosensor. Schließen Sie den Deckel und überwachen Sie die BLI-Kurve in der Software. Stellen Sie sicher, dass diese Antwortvariablen höher als der Ausgangswert sind (Abbildung 3).
      HINWEIS: Die Substratkonzentration kann optimiert werden, indem Biosensoren mit unterschiedlichen Konzentrationen beschichtet werden (nur eine Konzentration pro Biosensor) und die Bindungskurven beachtet werden. Eine Bindungskurve mit einem sichtbar höheren Signal im Vergleich zur Basislinie reicht aus, um die Substratbeschichtung zu bestätigen. Eine Überlastung des Biosensors kann zu sterischen Behinderungen oder Überfüllungen auf der Oberfläche führen. Abbildung 3zeigt die Kurven für fünf Konzentrationen von biotinyliertem 3'Bio-ss-poly (dT)32-Substrat . Darüber hinaus können die Biosensoren nach Abschluss des Köderladeschritts 30 s lang in Streptavidin-Blocking-Puffer (Biocytin) getaucht werden, gefolgt von einem Waschen in BLI-Puffer. Dadurch wird die ungebundene Streptavidin-Oberfläche blockiert und eine unspezifische Bindung verhindert.
    3. Öffnen Sie nach Abschluss des Zuordnungsschritts den Deckel und ersetzen Sie den Schlauch "A" durch den Schlauch "D". Schieben Sie ihn unter den Biosensor und schließen Sie den Deckel.
    4. Nachdem der Dissoziationsschritt abgeschlossen ist, öffnen Sie den Deckel, nehmen Sie den Biosensor ab und legen Sie ihn in das Biosensorfach, das den BLI-Puffer enthält. Stellen Sie sicher, dass der Biosensor vollständig in den Puffer getaucht und für die nächsten Schritte ausreichend hydratisiert ist. Reinigen Sie den Tropfenhalter mit Assay-Puffer, trocknen Sie ihn mit fusselfreien Tüchern ab und entfernen Sie das Röhrchen "D" aus dem Röhrchenhalter. Der Biosensor ist nun mit dem Substrat 3'Bio-ss-poly (dT)32 beschichtet.
  4. Proteinbindung
    1. Pipettieren Sie 250 μl BLI-Puffer in zehn schwarze 0,5-ml-Mikrofuge-Röhrchen. Beschriften Sie sie mit A1 bis A5 und D1 bis D5.
    2. Geben Sie in einer weiteren 96-Well-Platte 200 μl Stripping-Puffer in die Vertiefung, entsprechend der Position des hydratisierten Biosensors.
    3. Reinigen Sie den Tropfenhalter vor Beginn des Assays 3x mit BLI-Puffer.
    4. Öffnen Sie eine neue Datei in der Software und wählen Sie im linken Bereich Basic Kinetics aus. Benennen Sie den Assay und fügen Sie bei Bedarf eine Beschreibung hinzu (Ergänzende Abbildung 2). Passen Sie die Ausführungseinstellungen nach Bedarf an (Tabelle 1).
    5. Legen Sie das mit A1 gekennzeichnete Röhrchen in den Röhrchenhalter und befestigen Sie den 3'Bio-ss-poly (dT)32-beschichteten Biosensor am BLI-System. Schieben Sie das Rohr unter den Biosensor und drücken Sie auf Ausführen.
    6. Nachdem Sie den ersten Basisschritt abgeschlossen haben, öffnen Sie den Deckel, geben Sie 4 μl des BLI-Puffers in den Tropfenhalter und schieben Sie ihn unter den Biosensor. Dies ist die Proteinkonzentration von 0 nM und dient als Referenzkurve.
    7. Ersetzen Sie nach Abschluss des Assoziationsschritts das Rohr A1 durch D1 und schieben Sie es unter den Biosensor.
    8. Sobald der Dissoziationsschritt abgeschlossen ist, entfernen Sie den Biosensor und setzen Sie ihn wieder in sein Fach ein. Stellen Sie sicher, dass der Biosensor vollständig in den Puffer getaucht und für die nächsten Schritte ausreichend hydratisiert ist. Entfernen Sie das Röhrchen D1, reinigen Sie den Tropfenhalter mit Assay-Puffer und trocknen Sie ihn mit einem fusselfreien Tuch.
    9. Als nächstes wird die Bindungskurve für 5 nM RPA-Aktien erhalten. Geben Sie die Probendetails ein (Konzentration: 5 nM, Molekulargewicht: 116 KDa) und drücken Sie Calc. Dadurch wird die Proteinkonzentration in μg/μL berechnet.
    10. Befestigen Sie den 3'Bio-ss-poly (dT)32-beschichteten Biosensor und setzen Sie den Schlauch A2 in den Schlauchhalter ein. Schieben Sie es unter den Biosensor und klicken Sie auf Ausführen.
    11. Geben Sie nach der Baseline 4 μl 5 nM RPA auf den Tropfenhalter und schieben Sie ihn unter den Biosensor. Schließen Sie den Deckel und überwachen Sie die Assoziationskurve. Die Bindung des Proteins an den Köder kann durch eine Kurve sichtbar gemacht werden, die höher als die Basiskurve verläuft. Ersetzen Sie nach dem Assoziationsschritt A2 durch D2, schieben Sie es unter den Biosensor und schließen Sie den Dissoziationsschritt ab.
    12. Entfernen Sie den Biosensor, tauchen Sie ihn für 30 s in den Stripping-Puffer und tauchen Sie ihn dann für 3 Minuten in den BLI-Puffer.
      HINWEIS: Die Regenerationseffizienz hängt vom immobilisierten Köder und dem gestörten Analyten ab. Einige immobilisierte Biosensoren können zehn oder mehr Regenerationszyklen überstehen. Wir konnten biotinyliertes 3'Bio-ss-poly (dT)32-Substrat mehr als dreimal abstreifen (Ergänzende Abbildung 3), ohne eine merkliche Veränderung der Reaktion zu beobachten.
    13. Wiederholen Sie die Schritte 2.4.9 bis 2.4.12 für die anderen drei Konzentrationen von RPA 10 nM, 20 nM und 40 nM. Stellen Sie sicher, dass der Biosensor für jede Konzentration entfernt wird.
      HINWEIS: Für BLI-Assays empfehlen Experten die Verwendung von vier Konzentrationen (ohne die Referenzkurve), die für genaue kinetische Messungen etwa zwischen dem 0,1- und dem 10-fachen des erwarteten KD liegen. Hier wurden die vier Konzentrationen durch serielle Verdünnungen erhalten.
  5. Analyse von Daten und Berechnung von KD-Werten
    1. Vor der Berechnung des K D-Wertes ist es notwendig, das Sensorgramm auf jede Konzentration der RPA-Bindung auf dem 3'Bio-ss-poly (dT)32-Substrat visuell zu überprüfen. Stellen Sie sicher, dass das BLI-Signal mit zunehmender RPA-Konzentration zunimmt, bis die immobilisierte DNA gesättigt ist (Abbildung 4).
      HINWEIS: Um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen, stellen Sie sicher, dass mindestens vier Proteinkonzentrationen erfolgreich an das Substrat gebunden sind, mit Ausnahme der Analytkonzentration von 0 nM. Lesen Sie den Abschnitt "Diskussion", um mögliche Fehler zu beheben.
    2. Überprüfen Sie in der Tabelle 'Run List' Ref auf 0 nM Analytkonzentration, um als Referenzkurve zu dienen. Aktivieren Sie die Option Analysieren für alle Konzentrationen des Analyten.
    3. Wählen Sie als Nächstes sowohl Start der Assoziation als auch Start der Dissoziation für die schrittweise Korrektur aus. Dadurch wird der Beginn der Assoziation mit dem Ende der Basislinie und der Beginn der Dissoziation mit dem Ende der Assoziation ausgerichtet, was in der Regel durch unterschiedliche Reflexionsmuster zwischen dem Tropfenhalter und der Röhre verursacht wird, wenn der Puffer gut übereinstimmt.
    4. Wählen Sie für diesen Assay Global Fitting (1:1). Die globale Analyse berechnet die KD-Werte für einen gesamten Satz von Proteinkonzentrationen, während die lokale Analyse für eine einzelne Proteinkonzentration gilt.
      HINWEIS: Die mit dem Gerät gelieferte Software ermöglicht nur eine 1:1-Anpassung. Dies könnte ein potenzieller Vorbehalt sein, wenn erwartet wird, dass der Köder und der Analyt in andere passende Modelle passen. Die Daten aus dieser Software können in eine andere Plotsoftware exportiert und in die erforderlichen Anpassungsmodelle eingepasst werden.
    5. Wählen Sie als Nächstes Analysieren aus. Dadurch werden die Werte KD, ka/k d berechnet (Tabelle 2). Der Fehler ka und kd innerhalb von 10 % des Wertes wird im Allgemeinen als akzeptabel angesehen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass diese Werte innerhalb angemessener Grenzen liegen. Wenn der Fehler weniger als 10 % beträgt, deutet dies darauf hin, dass die Anpassung der Daten für die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen biologischen Molekülen zuverlässig ist. Darüber hinaus sollte die berechnete KD (Gleichgewichtsdissoziationskonstante) unter Verwendung dieser ka - und kd-Werte für die meisten praktischen Anwendungen ausreichend genau sein18.
    6. Um die angepassten Daten zu exportieren, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Diagramm, das mit den analysierten Daten erstellt wurde. Wählen Sie "Daten exportieren" und dann "Text/Daten" aus. Klicken Sie auf Datei und Durchsuchen , um die Daten im Format ".dat" zu speichern. Diese Datei kann in Microsoft Excel geöffnet und in anderer Software zum Plotten von Diagrammen verwendet werden.
      HINWEIS: Die globale Anpassung berücksichtigt alle Bindungskurvendaten innerhalb der Gruppe, während sich die lokale Anpassung ausschließlich auf die kinetischen Parameter für jede einzelne Analytkonzentration konzentriert.

3. Einrichten des Instruments für die Ausführung erweiterter Kinetik

  1. Öffnen Sie die Software und wählen Sie im linken Bereich Advanced Kinetics (Ergänzende Abbildung 1).
  2. Setzen Sie eine 96-Well-Platte in das Fach ein, in dem sich die Biosensoren befinden. Geben Sie 200 μl BLI-Puffer in fünf Vertiefungen. Platzieren Sie das Tablett mit den Biosensoren so auf der 96-Well-Platte, dass fünf Biosensoren in die Vertiefung mit dem Puffer eintauchen.
  3. Klicken Sie in der Software auf Hydrate und schalten Sie den Timer für 10 Minuten ein, sodass der einzelne Biosensor mindestens 10 Minuten lang hydratisieren kann.
  4. Während die Biosensoren hydratisieren, pipettieren Sie 250 μl BLI-Puffer in zehn schwarze 0,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Beschriften Sie sie als A1 bis A5 und D1 bis D5.
  5. Geben Sie die Details in der Software ein (Name: Substrate Coating und Beschreibung des Assays: RPA-3'Bio-ss-poly (dT)32: Advanced Kinetics).
  6. Geben Sie die Dauer für jeden Schritt ein (Ergänzende Abbildung 4). Anfängliche Baseline (30 s), Belastung (120 s), Baseline (30 s), Assoziation (120 s), Dissoziation (120 s). Passen Sie die Ausführungseinstellungen nach Bedarf an (Tabelle 1).
    1. Geben Sie die Details in der Software ein (Konzentration: 0 nM, Molekulargewicht: 116 kDa) und drücken Sie Calc.
  7. Setzen Sie den Schlauch A1 in den Schlauchhalter ein und befestigen Sie den Biosensor. Schieben Sie den Röhrchenhalter unter den Biosensor und drücken Sie Ausführen, um die anfängliche Ausgangsbasis zu erhalten.
  8. Geben Sie 4 μl 12,5 nM Substrat in den Tropfenhalter und schieben Sie es unter den Biosensor. Schließen Sie den Deckel. Dadurch wird das Substrat auf den Biosensor geladen. Ersetzen Sie A1 durch D1 im Röhrchenhalter und schieben Sie es unter den Biosensor. Dies ergibt die Basiskurve.
  9. Reinigen Sie den Tropfenhalter mit einem fusselfreien Tuch und laden Sie 4 μl BLI-Puffer ein. Schieben Sie es unter den Biosensor und schließen Sie den Deckel. Dies ist die Proteinkonzentration von 0 nM und dient als Referenzkurve.
  10. Schieben Sie nach Abschluss des Assoziationsschritts das D2-Rohr unter den Biosensor. Fahren Sie mit dem Dissoziationsschritt fort. Warten Sie, bis die Dissoziation abgeschlossen ist.
  11. Nehmen Sie den Biosensor ab, entfernen Sie D2 aus dem Röhrchenhalter und reinigen Sie den Tropfenhalter mit einem fusselfreien Tuch.
  12. Geben Sie die Details (Konzentration: 5 nM, Molekulargewicht: 116 kDa) für den nächsten Lauf ein und drücken Sie Calc.
  13. Befestigen Sie den zweiten Biosensor an der BLItz-Anlage, setzen Sie den Schlauch A2 in den Schlauchhalter ein und schieben Sie ihn unter den Biosensor.
  14. Nachdem Sie die anfängliche Ausgangsbasis festgelegt haben, geben Sie 4 μl 12,5 nM-Substrat in den Tropfenhalter. Schieben Sie es unter den Biosensor und schließen Sie den Deckel. Ersetzen Sie den Schlauch A2 durch D3 und schieben Sie ihn unter den Biosensor. Geben Sie anschließend 4 μl 10 nM RPA in den Röhrchenhalter und schieben Sie es unter den Biosensor.
  15. Nach der Assoziation schieben Sie D4 zur Dissoziation unter den Biosensor.
  16. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.12 bis 3.1.15 für die folgenden drei RPA-Konzentrationen (10 nM, 20 nM, 40 nM). Die Bindungskurven für diese Konzentrationen sind in Abbildung 5 dargestellt.
  17. Die Datenanalyse und der KD-Wert können in der gleichen Prozedur wie die BLI-Grundkinetik angepasst werden (Schritt 2.5, Tabelle 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Bei BLI wird weißes Licht von der Grenzfläche von Bioschicht/Puffer und der internen Referenzgrenzfläche zum Spektrometer reflektiert. Das resultierende Interferenzmuster wird aufgezeichnet und die spektrale Verschiebung über einen bestimmten Zeitraum gemessen und als Antwort der Bindungskurven in nm dargestellt. Eine repräsentative Abbildung, die die Biosensorspitze mit und ohne Analytbindung und die entsprechende spektrale Wellenlängenverschiebung (nm) zeigt, ist in

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

Die Fähigkeit, die Bindungskinetik eines Proteins an sein Substrat unter Verwendung von BLI zu analysieren, bietet die Möglichkeit, die spezifischen Faktoren (wie Sequenz, Struktur oder Länge einer DNA), die die Protein-DNA-Wechselwirkungen innerhalb der Zelle steuern, zu isolieren und zu charakterisieren19. Das Octet N1-System, das auf den Prinzipien der Biolayer-Interferometrie basiert, ermöglicht die quantitative Messung von Protein-Protein- und Protein-Nuk...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Offenlegungen

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu deklarieren.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Science Foundation (1929346) und der American Cancer Society (RSG-21-028-01) finanziert. Wir möchten uns auch bei den Mitgliedern des Balakrishnan-Labors für hilfreiche Gespräche bedanken.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 mL Micro Centrifuge TubesGlobe Scientific111554A
96 Well Standard Black MicroplateDot Scientific4ti-0223
Biotinylated poly dT OligonucleotideIDT
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153-10G
Dithiothreitol (DTT)Dot ScientificDSD11000-10
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Dot ScientificDSE57020-500
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-500
Kimtec Science Kimwipes Kimtech34120
Octet N1 SoftwareSartorius 1.4.0.13
Octet SA Biosensor Sartorius 18-5019
PBS pH 7.2 (10x)Gibco1666711
Personal Assay Octet N1 SystemSartorius 
Phosphoric Acid Ward's Science470302-024
Sodium Chloride (NaCl)Dot ScientificDSS23020-5000
Tris BaseDot ScientificDST60040-5000
Tween20 Bio-Rad170-6531

Referenzen

  1. Kalodimos, C. G., et al. Structure and flexibility adaptation in non-specific and specific protein-DNA complexes. Science. 305 (5682), 386-389 (2004).
  2. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9 (23), 6505-6525 (1981).
  3. Lane, D., Prentki, P., Chandler, M. Use of gel retardation to analyze protein-nucleic acid interactions. Microbiol Rev. 56 (4), 509-528 (1992).
  4. Dyer, R. B., Herzog, N. K. Immunodepletion EMSA: A novel method to identify proteins in a protein-DNA complex. Nucleic Acids Res. 23 (16), 3345-3346 (1995).
  5. Dudley, R. K. A laboratory guide to in vitro studies of protein-DNA interactions. FEBS Lett. 306, 2-3 (1991).
  6. Tsai, C., Smider, V., Hwang, B. J., Chu, G. Electrophoretic mobility shift assays for protein-DNA complexes involved in DNA repair. Methods Mol Biol. 920, 53-78 (2012).
  7. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).
  8. Heffler, M. A., Walters, R. D., Kugel, J. F. Using electrophoretic mobility shift assays to measure equilibrium dissociation constants: GAL4-p53 binding DNA as a model system. Biochem Mol Biol Educ. 40 (6), 383-387 (2012).
  9. Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. J Vis Exp. (84), e51383(2014).
  10. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J Pharm Biomed Anal. 72, 150-154 (2013).
  11. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
  12. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).
  13. Schasfoort, R. B. M., Tudos, A. J. Handbook of surface plasmon resonance. , RSC Pub. (2008).
  14. Douzi, B. Surface plasmon resonance: A sensitive tool to study protein-protein interactions. Methods Mol Biol. 2715, 363-382 (2024).
  15. Douzi, B. Protein-protein interactions: Surface plasmon resonance. Methods Mol Biol. 1615, 257-275 (2017).
  16. Drescher, D. G., Selvakumar, D., Drescher, M. J. Analysis of protein interactions by surface plasmon resonance. Adv Protein Chem Struct Biol. 110, 1-30 (2018).
  17. Martin, S. R., Ramos, A., Masino, L. Biolayer interferometry: Protein-RNA interactions. Methods Mol Biol. 2263, 351-368 (2021).
  18. Apiyo, D. Biomolecular binding kinetics assays on the Octet BLI platform. , https://www.sartorius.com/resource/blob/742330/05671fe2de45d16bd72b8078ac28980d/octet-biomolecular-binding-kinetics-application-note-4014-en-1--data.pdf (2022).
  19. Barrows, J. K., Van Dyke, M. W. Biolayer interferometry for DNA-protein interactions. PLoS One. 17 (2), e0263322(2022).
  20. Desai, M., Di, R., Fan, H. Application of biolayer interferometry (BLI) for studying protein-protein interactions in transcription. J Vis Exp. (149), e59687(2019).
  21. Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic acid interactions by biolayer interferometry. Curr Protoc Protein Sci. 79, 19.25.1-19.25.26 (2015).
  22. Petersen, R. L. Strategies using bio-layer interferometry biosensor technology for vaccine research and development. Biosensors (Basel). 7 (4), 49(2017).
  23. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization. Comb Chem High Throughput Screen. 12 (8), 791-800 (2009).
  24. Wold, M. S. Replication protein A: A heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism. Annu Rev Biochem. 66, 61-92 (1997).
  25. Qureshi, M. H., Ray, S., Sewell, A. L., Basu, S., Balci, H. Replication protein A unfolds G-quadruplex structures with varying degrees of efficiency. J Phys Chem B. 116 (19), 5588-5594 (2012).
  26. Wold, M. S., Kelly, T. Purification and characterization of replication protein A, a cellular protein required for in vitro replication of simian virus 40 DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (8), 2523-2527 (1988).
  27. Bochkareva, E., Korolev, S., Lees-Miller, S. P., Bochkarev, A. Structure of the RPA trimerization core and its role in the multistep DNA-binding mechanism of RPA. EMBO J. 21 (7), 1855-1863 (2002).
  28. Brosey, C. A., et al. NMR analysis of the architecture and functional remodeling of a modular multidomain protein, RPA. J Am Chem Soc. 131 (18), 6346-6347 (2009).
  29. Fanning, E., Klimovich, V., Nager, A. R. A dynamic model for replication protein A (RPA) function in DNA processing pathways. Nucleic Acids Res. 34 (15), 4126-4137 (2006).
  30. Gibb, B., et al. Protein dynamics during presynaptic-complex assembly on individual single-stranded DNA molecules. Nat Struct Mol Biol. 21 (10), 893-900 (2014).
  31. Nguyen, B., et al. Diffusion of human replication protein A along single-stranded DNA. J Mol Biol. 426 (19), 3246-3261 (2014).
  32. Brosey, C. A., et al. Functional dynamics in replication protein A DNA binding and protein recruitment domains. Structure. 23 (6), 1028-1038 (2015).
  33. Chen, R., Subramanyam, S., Elcock, A. H., Spies, M., Wold, M. S. Dynamic binding of replication protein a is required for DNA repair. Nucleic Acids Res. 44 (12), 5758-5772 (2016).
  34. Kemmerich, F. E., et al. Force regulated dynamics of RPA on a DNA fork. Nucleic Acids Res. 44 (12), 5837-5848 (2016).
  35. Pokhrel, N., et al. Dynamics and selective remodeling of the DNA-binding domains of RPA. Nat Struct Mol Biol. 26 (2), 129-136 (2019).
  36. Wang, Q. M., et al. Human replication protein A induces dynamic changes in single-stranded DNA and RNA structures. J Biol Chem. 294 (38), 13915-13927 (2019).
  37. Wyka, I. M., Dhar, K., Binz, S. K., Wold, M. S. Replication protein A interactions with DNA: Differential binding of the core domains and analysis of the DNA interaction surface. Biochemistry. 42 (44), 12909-12918 (2003).
  38. Kim, C., Snyder, R. O., Wold, M. S. Binding properties of replication protein A from human and yeast cells. Mol Cell Biol. 12 (7), 3050-3059 (1992).
  39. Caldwell, C. C., Spies, M. Dynamic elements of replication protein A at the crossroads of DNA replication, recombination, and repair. Crit Rev Biochem Mol Biol. 55 (5), 482-507 (2020).
  40. Mishra, A. K., Dormi, S. S., Turchi, A. M., Woods, D. S., Turchi, J. J. Chemical inhibitor targeting the replication protein A-DNA interaction increases the efficacy of Pt-based chemotherapy in lung and ovarian cancer. Biochem Pharmacol. 93 (1), 25-33 (2015).
  41. Gavande, N. S., et al. Structure-guided optimization of replication Protein A (RPA)-DNA interaction inhibitors. ACS Med Chem Lett. 11 (6), 1118-1124 (2020).
  42. Ana Jug, T. B., Janez Ilaš, Biolayer interferometry and its applications in drug discovery and development. TrAC Trends Anal Chem. 176, 117741(2024).
  43. Gator Bio, I. Using BLI for viral and lipid-based vector analytics. , News Medical. https://www.news-medical.net/whitepaper/20230322/Using-BLI-for-viral-and-lipid-based-vector-analytics.aspx (2023).
  44. Noy-Porat, T., et al. Characterization of antibody-antigen interactions using biolayer interferometry. STAR Protoc. 2 (4), 100836(2021).
  45. Onyekachi Ononye, S. S., et al. Biochemical impact of p300-mediated acetylation of replication protein A: Implications for DNA metabolic pathway choice. bioRxiv. , (2024).
  46. Weeramange, C. J., Fairlamb, M. S., Singh, D., Fenton, A. W., Swint-Kruse, L. The strengths and limitations of using biolayer interferometry to monitor equilibrium titrations of biomolecules. Protein Sci. 29 (4), 1018-1034 (2020).
  47. Artem Stetsenko, A. G. An Overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization. Crystals. 7 (7), 197(2017).
  48. Hubbe, M. A., Szlek, D. B., Vera, R. E. Detergency mechanisms and cellulosic surfaces: A review. BioResources. 17 (4), 7167-7249 (2022).
  49. Renee Tobias, S. K., Apiyo, A. Research the Industry Standard for Label-Free of Biomolecular Interactions Analysis (BIA). , https://www.sartorius.com/en/products/biolayer-interferometry/bli-resources (2021).
  50. Octet NTA Biosensor Kinetic Assays. , Sartorius. https://www.sartorius.com/resource/blob/552398/b27ccc2fdfde7a9320909572ced3f6a1/ni-nta-biosensor-kinetic-assays-technical-note-en-sartorius-data.pdf (2024).
  51. Application Guides: Kinetics and affinity measurements with Biacore systems. , Cytiva. Available from: https://cdn.cytivalifesciences.com/api/public/content/digi-33042-pdf (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

BiochemieAusgabe 215BLI KinetikBiolayer InterferometrieProtein DNA WechselwirkungenDissoziationskonstanteAssoziationgrundlegende Kinetikfortgeschrittene Kinetik

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten