JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

この記事では、ストレプトアビジンベースの生体層干渉法(BLI)システムを使用してDNA-タンパク質相互作用を研究するためのプロトコルについて説明します。本稿では、相互作用の平衡結合親和性(KD)を決定するために、基本的または高度な結合動力学を利用するための基本的なステップと考慮事項を概説しています。

要約

タンパク質とDNAの相互作用は、重要な細胞プロセスを支えています。これらの相互作用を理解することは、さまざまな経路の分子メカニズムを解明するために重要です。DNA分子の構造、配列、長さなどの重要な要素は、タンパク質の結合に大きな影響を与える可能性があります。バイオレイヤーインターフェロメトリー(BLI)は、分子間の結合速度を測定するラベルフリー技術であり、タンパク質-DNA相互作用を定量的に研究するための簡単で正確なアプローチを提供します。従来のゲルベースの方法に対するBLIの主な利点は、結合速度に関するリアルタイムのデータを提供できることであり、動的なタンパク質-DNA相互作用の平衡解離定数(KD)を正確に測定できます。この記事では、DNA複製タンパク質、複製タンパク質A(RPA)、および一本鎖DNA(ssDNA)基質間の相互作用のKD 値を決定するための基本的なプロトコルを示します。RPAはssDNAに高い親和性で結合しますが、生物学的経路内でのその後のタンパク質相互作用を促進するためにも簡単に置換する必要があります。記載のBLIアッセイでは、ビオチン化ssDNAをストレプトアビジン被覆バイオセンサーに固定化します。次に、RPAのバイオセンサー結合DNAへの結合速度(会合と解離)が測定されます。得られたデータを解析し、システムソフトウェアを用いて、会合率定数(ka)、解離率定数(kd)、平衡結合定数(KD)の正確な値を導き出します。

概要

細胞タンパク質は、生体内で発生する複雑な生物学的プロセスを調整する上で極めて重要な役割を果たします。これらの経路の最適な機能は、パートナータンパク質や核酸との相互作用など、タンパク質と細胞内の他の生体分子との相互作用に依存しています1。したがって、細胞プロセスの複雑さを理解するには、タンパク質-核酸相互作用のダイナミクスを深く理解する必要があります。

従来、タンパク質-核酸相互作用は、電気泳動移動度ゲルシフトアッセイ(EMSA)2を用いて研究されてきました。このアッセイでは、タンパク質を合成オリゴヌクレオチド(特定の長さまたは配列を含むDNA/RNA)と短時間インキュベートし、その後、反応を天然のポリアクリルアミド(PAGE)ゲル3,4,5上で電気泳動します。タンパク質-オリゴヌクレオチド相互作用の可視化を可能にするために、オリゴヌクレオチドは通常、32Pで放射性標識されるか、蛍光分子でタグ付けされます。タンパク質が相互作用してオリゴヌクレオチドに結合すると、タンパク質の結合によりゲル内の核酸の移動が遅くなります6,7。したがって、この方法はゲルシフトまたはゲル遅延アッセイとも呼ばれます。この方法は広く使用されていますが、この方法を使用してKD値を取得する際には、弱い結合または動的結合による低分解能、非常に高濃度のタンパク質の必要性、より多くの労力など、考慮すべきいくつかの制限があります。さらに、EMSAはリアルタイムアッセイではないため、結合速度を正確に測定することはできません7,8。

これらの制限を克服するために、表面プラズモン共鳴(SPR)や生体層干渉法(BLI)などの革新的な技術が登場しました9,10,11,12。どちらの方法も、分子間の会合/解離速度定数と親和性定数をラベルフリーで測定します。タンパク質にタグを付ける必要がないため、これらの技術により、タンパク質の特性を変化させたり、結合部位をブロックしたりするリスクが排除されます。SPRでは、偏光がセンサー(金属伝導膜、通常は金)と相互作用し、プラズモンと呼ばれる電子電荷密度波を生成します。この相互作用により、反射ビームの強度が減少し、検出器は共振角13として知られる特定の角度の変化を測定する。リガンド(核酸)と分析物(タンパク質)の相互作用を研究するには、リガンドをセンサーチップ上の1つのフローセルに固定化し、分析物を固定化リガンドを含むフローセルに注入します。分析物をリガンドに結合すると、センサー表面付近の屈折率に検出可能な変化が生じ、分子相互作用の測定が可能になります14,15,16。

バイオレイヤー干渉法(BLI)は、バイオセンサーの先端の底面に配位子(ベイト)とその結合パートナー(分析物)からなるバイオレイヤーを持つ光ファイバーを光が通過する際の光干渉のパターンを測定するものです。光は先端を透過し、バイオレイヤーの特性によりバイオレイヤーの両端で反射されます。バイオレイヤーの厚さは、反射光のパターンに影響を与える結合分子の数に比例します。相対強度の曲線の変化を比較することにより、基準界面からの反射光と生体層/バッファ界面からの反射光との間の干渉によって引き起こされる波長により、生体層の厚さ変化を決定できます。より多くの分子が結合すると、より大きなシフトが発生するため、BLIは生体分子の相互作用をリアルタイムで研究するための強力なツールになります。干渉パターンの変化は測定され、スペクトルシフト17,18としてセンサーグラムで表されます(図1A)。結合相互作用の性質は、適切な制御、例えば、結合パートナー19、20、21のリガンド変動濃度を欠くセットアップなどを用いて、正確に決定することができる。SPRと比較して、BLIは費用対効果が高く、ユーザーフレンドリーであるため、幅広い研究者が利用できます。さらに、BLIで使用されるサンプルは、劣化や凝集がなければ無傷のままです。これにより、それらを回収して再利用することができ、廃棄物を最小限に抑えることができます。BLI装置はマイクロ流体を使用せずに動作するため、メンテナンス/手入れの必要性、目詰まり、脱気バッファーの使用など、流体システムの欠点を排除します。また、ろ過されていないタンパク質サンプルや粗タンパク質サンプルによる装置の汚染リスクも最小限に抑えられます。

BLI実験では、バイオセンサー上にベイト分子を固定化することでバイオレイヤーを確立します。バイオセンサーのバイオレイヤーは、さまざまなタグと相互作用することができるため、分子(核酸、タンパク質、抗体、ウイルス、低分子など)間の相互作用を研究することができます22.ビオチン/ストレプトアビジン、6X-Hisタグ/Ni-NTA、FLAG/抗FLAG、GST/抗GST、抗体/抗Fcなど、さまざまな捕捉戦略を使用して、この固定化を確立することができます。固定化されたリガンドの構造と活性を維持することは、バイオセンサーを選択する際に重要です。干渉パターンの変化は、結合分子の量とマトリックス23によって影響を受ける。タンパク質と核酸の相互作用は、ストレプトアビジンでコーティングされたバイオセンサーに固定化できるビオチン化オリゴヌクレオチドプローブを使用して研究されます。固定化されたベイト(オリゴヌクレオチド)と相互作用すると予想されるタンパク質サンプルは、結合バッファー内で一定時間オリゴヌクレオチドと接触して会合を測定し、その後ブランク結合バッファーに切り替えて解離を測定します。分析種の結合とそれに対応する結合曲線の変化の概略図を 図 1B に示します。さらに、タンパク質-核相互作用は、タンパク質(ベイト)がバイオセンサーで捕捉され、核酸(分析物)と相互作用する逆固定化経路によっても研究できます。

現在、バイオレイヤー干渉法の原理で動作する複数の機器が市販されています。簡単で費用対効果の高い機器はOctet N1システムとして知られており、データスループット用の単一チャネルを備えています。手動操作が必要で、最小限のサンプル量(4μL)を消費し、周囲温度9,23でサンプル分析を行います。このシングルチャンネル装置は、10 kDaを超えるタンパク質の結合効率を検出し、マイクロモル(μM)からナノモル(nM)の範囲11,12の親和性を測定できます。自動データ読み取り用の2、8、16、および96チャンネルを備えた一部の機器も利用可能であり、96または384ウェルフォーマット19,20の両方と互換性があります。これらの機器の中には、4°Cから40°Cの間で動作させ、分子量が150Daの生体分子を検出し、ピコモル範囲19,21に対するミリモル内の親和性を測定することもできます。説明したシステムは費用対効果が高いですが、複数のチャンネルを備えた高価な機器は、高スループットの自動処理を提供します。これらの高度なシステムは、生物学的薬物分子の特性評価および開発に一般的に採用されている9,23。

現在のプロトコルでは、シングルチャネルの手動バイオレイヤー干渉法システムを使用して、複製タンパク質A(RPA)の一本鎖DNA(ss-DNA)への結合パラメータを測定する手順を説明しています。RPAは、ヘテロ三量体のssDNA結合タンパク質複合体であり、DNAの複製、修復、組換えなど、DNA代謝のほぼすべての側面で重要な役割を果たしている24。ssDNAに対する高い親和性(サブナノモル範囲と測定)により、さまざまなDNA取引中に生成されるssDNAに迅速に結合し、核分解分解から保護し、他の下流タンパク質の即時結合を防ぐことができます。RPAは、G-四重鎖25のような非標準的な二次および三次構造の形成を防ぐ上でも重要な役割を果たす。ヒトRPAは、RPA70(70 kDa)、RPA32(32 kDa)、およびRPA14(14 kDa)の3つのサブユニットで構成されており、それぞれRPA 1、RPA 2、およびRPA 3とも呼ばれ、それぞれ24、26、27。これらのサブユニットには、AからFとラベル付けされた6つのオリゴヌクレオチド/オリゴ糖結合フォールド(OBフォールド)があります。これらのうち、DNA結合ドメイン(DBD)は、RPA1(DBD-A、DBD-B、DBD-C)およびRPA2(DBD-D)サブユニット28上にあります。DNAの長さに応じて、RPAは異なる結合モードを示し、異なるDBDが特定のDNAの長さに結合すると最初に考えられた29。最近の構造研究および単一分子研究のデータは、これらのモデルを改良するのに役立ち、RPAのさまざまなDBDの結合が当初提案されていた30,31,32,33,34,35,36よりも動的であることを示唆しています。この動的結合特性の特徴は、RPAが特定のDNA取引中にDNA基質にしっかりと結合できる必要があるため、RPAの機能に不可欠です。ただし、生物学的プロセス中に基質から変位して、基質を次のタンパク質に引き渡すこともできる必要があります。異なる生化学的手法を用いて、RPAのKDは、ss-(polydT)30基質で約0.4nM、ss-(polydA)257およびdG-(polydG)602基質でそれぞれ80nMおよび200nMであると決定されている(蛍光偏光異方性(FPA)37,38によって測定)。また、RPAは、プリンと比較して、ピリミジンに富む配列への結合に対する好みが約50倍高いことを示しています。RPAのKD測定は、生化学的手法によって異なることが分かっていますが、すべての測定値はナノモル範囲にあり、RPAのssDNAに対する高い結合親和性が示唆されています。全反射蛍光顕微鏡(TIRFM)を用いて、DNAの長さに基づいて、RPAが少なくとも2つの結合モードに関連していることが発見されました:1つは高速解離(Kd、680pM)で定義され、1つは低速解離(Kd、60pM)複合体33,39で定義されました。ほぼすべてのDNA代謝経路に極めて重要な関与をしていることから、RPAと一本鎖DNA(ssDNA)との相互作用を妨げる阻害剤の作成に強い関心が寄せられています。これらの化学阻害剤は、DNA損傷応答を妨害し、がん細胞を臨床治療で使用されるDNA損傷剤に対してより感受性を持たせるのに不可欠です。BLIアッセイを利用することで、RPAの結合機能の調節における阻害剤の有効性の正確な定量的評価が可能になります40,41。

BLIセットアップでは、基本動力学と高度な動力学の異なる設定が可能です。基本動力学モードでは、アッセイはベースラインの確立、関連、および解離の3つの主要な段階で構成されます。ただし、このアッセイを実行する前に、バイオセンサーを機器を使用して、または実験室のベンチで手動で個別にコーティングする必要があります。逆に、アドバンスト・キネティクス・モードは、基本的な3つのステップを超えて拡張され、追加のステップを組み込むことができます。これらの補足的なステップは、バイオセンサーをバッファーの変化に合わせて調整したり、その後のタンパク質相互作用の検出を容易にするなど、さまざまな目的に役立ちます。高度な動力学により、餌とバイオセンサーが無傷のままであれば、優れた再生方法によって分析物から分析物を取り除くこともできます。一般に、アドバンスドキネティクスは、アッセイに複数のステップが関与している場合、またはアッセイをより複雑な形式で実行する必要がある場合に、基本的なキネティクスよりも使用されます。

このプロトコールでは、同じベイト[3'Bio-ss-poly(dT)32]と分析物(RPA)を使用した両方の方法の概要を説明します。ストレプトアビジンコーティングされたバイオセンサーを使用して餌を固定し、分析物のKD 測定値を取得します。このプロトコルでは、シングルチャネル装置バイオレイヤー干渉法を使用してBLIアッセイを実施するための完全なアプローチについて説明し、バイオセンサーベイトの調製、バッファーに関する考慮事項、および手順の段階的な概要をカバーしています。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

本試験で使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. ベイト、分析物、バッファーの調製、ドロップホルダーの洗浄

  1. 装置のセットアップ:実験を開始する少なくとも1時間前に装置の電源を入れます。これにより、ランプがウォームアップします。
  2. ストリッピングおよびクリーニングバッファーの調製
    1. ストリッピングバッファー:0.15 Mリン酸[pH 2.0]を50 mL調製します。
    2. 洗浄バッファー:0.5 N HClを10 mL調製します。
  3. BLIバッファーの調製
    1. 1x BLIバッファー(50 mM Tris pH 7.5、1 mM EDTA、100 mM NaCl、0.1 mg/mL BSA、1 mM DTT、0.05% Tween 20)50 mLを調製します。このバッファーは4°Cで保存してください。 このアッセイを設定する前に、バッファーを室温に戻してください。
      注:経年劣化した緩衝液はpHの変化や凝集体の形成を受ける可能性があり、微生物汚染があり、結果の再現性と精度が損なわれる可能性があるため、アッセイ用に新鮮な緩衝液を調製することを強くお勧めします。2週間以上保存されたバッファーを使用することはお勧めしません。
  4. ベイト/基質の調製
    1. BLIバッファーを用いて、12.5 nMの3'Bio-ss-poly (dT)32 基質(5' TTT TTT TTT TT TTT TT 3'Bio)を調製します。
  5. タンパク質濃縮ストックの調製
    1. BLIバッファーを使用して、4つの濃度のRPA(5 nM、10 nM、20 nM、40 nM)を調製します。タンパク質の最高濃度(40 nM)は、BLIバッファーでストックタンパク質を希釈することによって得られます。その後の希釈液は、40 nMの作業溶液の段階希釈によって調製されます。安定性を維持するために、実験中、すべてのタンパク質ストックが氷上に保たれていることを確認してください。
  6. ドロップホルダーの清掃
    1. 4 μLの蒸留水を加え、糸くずの出ないワイプでドロップホルダーを清掃します(3回繰り返します)。次に、4μLの70%エタノールでこの手順を繰り返し、糸くずの出ないワイプで清掃します。このステップにより、表面の汚染物質やほこりの粒子を確実に除去できます。
    2. 0.5N HClを4μL加え、ドロップホルダーに1分間放置します。糸くずの出ない拭き取りで拭き取り、この手順をもう一度繰り返します。これにより、ドロップホルダーの深いクリーニングが保証されます。ディープクリーニングは、以前の使用で乾燥した液滴のドロップホルダーをクリーニングするのに特に便利です。
    3. 1手順1を繰り返して、ドロップホルダーを蒸留水と70%エタノールで洗い、糸くずの出ないワイプで拭いて乾かします。これで、ドロップホルダーを使用する準備が整いました。

2. 基本的な動力学

  1. 機器とソフトウェアのセットアップ
    1. ソフトウェアを開き、左側のパネルで [Basic Kinetics ]を選択します(補足図1)。
    2. バイオセンサーのラックをトレイから取り外し(市販のソースから入手)、96ウェルプレートをトレイに置きます。200 μLのBLIバッファーを最初のウェルに加えます。次に、バイオセンサーのトレイを96ウェルプレートの上に戻し、各バイオセンサーが対応するウェルに挿入されていることを確認します。これで、最初のバイオセンサーを最初のウェルのBLIバッファーに浸す必要があります。
    3. ソフトウェアで、[ ハイドレート ]をクリックしてタイマーを10分間オンにし、単一のバイオセンサーが少なくとも10分間ハイドレートできるようにします。このステップにより、バイオセンサーが水分を補給し、BLIアッセイの準備が整います。
    4. バイオセンサーが水和されている間に、250 μLのBLIバッファーを2本の0.5 mLチューブにピペットで移します。1 つを "A" (関連付け) とラベル付けし、もう 1 つを "D" (解離) とラベル付けします。
    5. ソフトウェアに詳細を記入します(名前:Substrate Coating、アッセイの説明:RPA-3'Bio-ss-poly(dT)32:Basic Kinetics)。
    6. 各ステップの実行設定を調整します:ベースライン(30秒)、関連(120秒)、解離(120秒)(表1)。チューブとドロップホルダーのシェーカーをオンのままにします。シェーカーの速度は2200rpm(範囲、1000〜2600rpm)に設定されており、バイオセンサー表面付近の限られた拡散によって引き起こされる物質輸送の影響を防ぎます。
      注:データ取得を改善するために、結合速度論アッセイを設定する際の各ステップ(ベースライン、ローディング、アソシエーション、解離)のデュレーションを最適化することをお勧めします。
  2. ベースライン曲線の確立
    1. チューブAをチューブホルダーに入れ、水和バイオセンサーをBLIシステムに取り付けます。チューブホルダーをバイオセンサーの下にスライドさせます( 図2の位置A)。
      注:実験中は、バイオセンサーを完全に乾燥させないでください。乾燥させると、実験の測定値が大幅に歪む可能性があります。
    2. [実行]をクリックし、プロンプトメッセージの指示に従います。
    3. 最初のベースラインが完了したら、蓋を開けて 4 μL の BLI バッファーをドロップホルダーに加えます。同じバイオセンサーの下を右にスライドさせます( 図2の位置B)。蓋を閉じ、ソフトウェアでBLI曲線を監視します(図3、青い曲線)。
    4. 完了後、蓋を開けてチューブ「A」を「D」に交換し、バイオセンサーの下にスライドさせます( 図2の位置A)。蓋を閉めて、解離ステップを進めます。完了後、蓋を開けてバイオセンサーを取り外し、トレイに戻して、バイオセンサーがBLIバッファーに浸されていることを確認します。
    5. サンプル/バッファーを取り外し、ドロップホルダーをバッファーで洗浄してから、糸くずの出ないワイプで乾燥させ、チューブホルダーからチューブ「D」を取り外します。
  3. 基板コーティング
    1. チューブAをチューブホルダーに入れ、水和バイオセンサーをBLIシステムに取り付けます。チューブホルダーをバイオセンサーの下にスライドさせ、Runを押します 。
    2. 最初のベースラインステップの後、4 μLの12.5 nM基質[3'Bio-ss-poly (dT)32]をドロップホルダーに加え、バイオセンサーの下にスライドさせます。蓋を閉め、ソフトウェアでBLI曲線を監視します。この応答がベースラインよりも高いことを確認します(図3)。
      注:基質濃度は、バイオセンサーを異なる濃度(バイオセンサーごとに1つの濃度のみ)でコーティングし、結合曲線を観察することで最適化できます。ベースラインと比較して目に見えて高いシグナルを持つ結合曲線は、基板コーティングを確認するのに十分です。バイオセンサーに負荷がかかりすぎると、立体障害や表面の混雑につながる可能性があります。 図3は、ビオチン化3'Bio-ss-poly(dT)32 基質の5つの濃度の曲線を示しています。さらに、ベイトローディングステップが完了した後、バイオセンサーをストレプトアビジンブロッキングバッファー(バイオシチン)に30秒間浸漬し、続いてBLIバッファーで洗浄することができます。これにより、結合していないストレプトアビジン表面がブロックされ、非特異的結合が防止されます。
    3. 関連付け手順が完了したら、蓋を開けてチューブ「A」をチューブ「D」と交換します。バイオセンサーの下にスライドさせて蓋を閉めます。
    4. 解離ステップが完了したら、蓋を開けてバイオセンサーを取り外し、BLIバッファーの入ったバイオセンサートレイに置きます。バイオセンサーがバッファーに完全に浸され、次のステップのために十分に水和されていることを確認してください。ドロップホルダーをアッセイバッファーで洗浄し、糸くずの出ないワイプで乾燥させ、チューブホルダーからチューブ「D」を取り外します。バイオセンサーは、3'Bio-ss-poly (dT)32 基板でコーティングされています。
  4. タンパク質結合
    1. 250 μLのBLIバッファーを10本の0.5 mL黒色マイクロチューブにピペットで移します。A1 から A5 および D1 から D5 のラベルを付けます。
    2. 別の96ウェルプレートで、水和バイオセンサーの位置に対応する200 μLのストリッピングバッファーをウェルに加えます。
    3. アッセイを開始する前に、ドロップホルダーをBLIバッファーで3回洗浄します。
    4. ソフトウェアで新しいファイルを開き、左側のパネルで [基本キネティクス ]を選択します。アッセイに名前を付け、必要に応じて説明を追加します(補足図2)。必要に応じて、実行設定を調整します(表1)。
    5. A1とラベル付けされたチューブをチューブホルダーに入れ、3'Bio-ss-poly(dT)32コーティングされたバイオセンサーをBLIシステムに取り付けます。チューブをバイオセンサーの下にスライドさせ、Runを押します 。
    6. 最初のベースラインステップが完了したら、蓋を開け、BLIバッファー4μLをドロップホルダーに加え、バイオセンサーの下にスライドさせます。これが0 nMのタンパク質濃度であり、参照曲線として機能します。
    7. 関連付け手順が完了したら、チューブA1をD1と交換し、バイオセンサーの下にスライドさせます。
    8. 解離ステップが完了したら、バイオセンサーを取り外してトレイに戻します。バイオセンサーがバッファーに完全に浸され、次のステップのために十分に水分補給されていることを確認してください。チューブD1を取り外し、アッセイバッファーでドロップホルダーを洗浄し、糸くずの出ないワイプで乾かします。
    9. 次に、5 nM RPAストックの結合曲線を取得します。サンプルの詳細(濃度:5 nM、分子量:116 KDa)を記入し、 Calcを押します。これにより、タンパク質濃度がμg/μLで計算されます。
    10. 3'Bio-ss-poly(dT)32コーティングされたバイオセンサーを取り付け、チューブホルダーにチューブA2を入れます。バイオセンサーの下にスライドさせて、 実行を押します。
    11. ベースライン化後、4 μL の 5 nM RPA をドロップホルダーに添加し、バイオセンサーの下にスライドさせます。蓋を閉め、関連付け曲線を監視します。ベイトへのタンパク質の結合は、ベースライン曲線よりも高い曲線で視覚化できます。関連付けステップの後、A2をD2に交換し、バイオセンサーの下にスライドさせて、解離ステップを完了します。
    12. バイオセンサーを取り外し、ストリッピングバッファーに30秒間浸した後、BLIバッファーに3分間浸します。
      注:再生効率は、固定化された餌と破壊された分析物に依存します。一部の固定化バイオセンサーは、10回以上の再生サイクルに耐えることができます。ビオチン化した3'Bio-ss-poly(dT)32 基質を3回以上ストリッピングすることができ(補足図3)、応答に顕著な変化は観察されませんでした。
    13. 他の3つの濃度のRPA 10 nM、20 nM、および40 nMについて、手順2.4.9〜2.4.12を繰り返します。濃度ごとにバイオセンサーを剥がしてください。
      注:BLIアッセイの場合、専門家は、正確な速度論的測定のために、 予想されるKDの約0.1倍から10倍の範囲の4つ(参照曲線を除く)濃度を使用することを推奨しています。ここでは、4つの濃度を段階希釈によって取得しました。
  5. データの分析とKD 値の計算
    1. KD値を計算する前に、3'Bio-ss-poly(dT)32基板上のRPA結合の各濃度のセンサーグラムを視覚的に検査する必要があります。固定化されたDNAが飽和するまで、RPAの濃度が増加するとBLIシグナルが増加することを確認します(図4)。
      注:信頼性の高い結果を得るには、0 nMの分析種濃度を除く、少なくとも4つのタンパク質濃度が基質に正常に結合していることを確認してください。ディスカッションセクションを参照して、潜在的なエラーのトラブルシューティングを行います。
    2. 表「Run List」で、参照曲線として機能する0 nM分析種濃度の Ref を確認します。分析物のすべての濃度について、 分析 を確認します。
    3. 次に、ステップ修正のために Start of association と Start of dissociation の両方を選択します。これにより、関連付けの開始がベースラインの終了に、解離の開始が関連付けの終了に位置合わせされますが、これは通常、バッファーがよく一致する場合、ドロップホルダーとチューブの間の反射パターンが異なるために発生します。
    4. このアッセイには 、グローバル フィッティング(1:1)を選択します。グローバル解析では、タンパク質濃度のセット全体に対するKD 値が計算されますが、ローカル解析では単一のタンパク質濃度に対するKD値が計算されます。
      注意: 機器に付属のソフトウェアでは、1:1のフィッティングのみが可能です。これは、ベイトと分析物が他のフィッティングモデルに適合すると予想される場合の潜在的な注意点となる可能性があります。このソフトウェアからのデータは、他のプロットソフトウェアにエクスポートして、必要なフィッティングモデルに適合させることができます。
    5. 次に、[ 分析] を選択します。これにより、KD、ka/kd の値が計算されます(表2)。 ka と kd の誤差が値の 10% 以内であれば、一般的に許容できると考えられます。
      注: これらの値が妥当な範囲内であることを確認してください。誤差が10%未満の場合、データのフィッティングが生体分子間の相互作用を研究するために信頼できることを示唆しています。さらに、これらのkaおよびkdの値を使用して計算されたKD(平衡解離定数)は、ほとんどの実用的なアプリケーション18に対して十分に正確であるはずです。
    6. フィットデータをエクスポートするには、解析されたデータを使用して生成されたグラフを右クリックします。「 データのエクスポート」を選択し、「 テキスト/データ」を選択します。 「ファイル 」と 「参照 」をクリックして、データを「.dat」形式で保存します。このファイルは、Microsoft Excelで開いたり、他のソフトウェアでグラフプロットに使用したりできます。
      注:グローバルフィッティングは、グループ内のすべての結合曲線データを考慮しますが、ローカルフィッティングは、個々の分析物濃度の動的パラメータのみに焦点を当てます。

3. 高度な動力学を実行するための装置のセットアップ

  1. ソフトウェアを開き、左側のパネルで [Advanced Kinetics ]を選択します(補足図1)。
  2. バイオセンサーを保持しているトレイに96ウェルプレートを置きます。5つのウェルに200μLのBLIバッファーを加えます。バイオセンサーのトレイを96ウェルプレートに置き、5つのバイオセンサーがバッファーを含むウェルに浸るようにします。
  3. ソフトウェアで、[ ハイドレート ]をクリックしてタイマーを10分間オンにし、単一のバイオセンサーが少なくとも10分間ハイドレートできるようにします。
  4. バイオセンサーが水分を補給している間に、250 μLのBLIバッファーを10本の0.5 mL黒色遠心チューブにピペットで移します。A1 から A5 および D1 から D5 のラベルを付けます。
  5. ソフトウェアに詳細を記入します(名前:Substrate Coating、アッセイの説明:RPA-3'Bio-ss-poly (dT)32:Advanced Kinetics)。
  6. 各ステップの期間を入力します(補足図4)。初期ベースライン(30秒)、負荷(120秒)、ベースライン(30秒)、関連(120秒)、解離(120秒)。必要に応じて、実行設定を調整します(表1)。
    1. ソフトウェアの詳細(濃度:0 nM、分子量:116 kDa)を入力し、 Calcを押します。
  7. チューブA1をチューブホルダーに入れ、バイオセンサーを取り付けます。チューブホルダーをバイオセンサーの下にスライドさせ、 Runを押して初期ベースラインを取得します。
  8. 4 μL の 12.5 nM 基質をドロップホルダーに加え、バイオセンサーの下にスライドさせます。蓋を閉めます。これにより、基質がバイオセンサーにロードされます。チューブホルダーのA1をD1に交換し、バイオセンサーの下にスライドさせます。これにより、ベースライン曲線が得られます。
  9. ドロップホルダーを糸くずの出ないワイプで清掃し、BLIバッファー4μLをロードします。バイオセンサーの下に滑り込ませ、フタを閉めます。これが0 nMのタンパク質濃度であり、参照曲線として機能します。
  10. 関連付け手順が完了したら、D2チューブをバイオセンサーの下にスライドさせます。解離ステップに進みます。分離が完了するまで待ちます。
  11. バイオセンサーを取り外し、チューブホルダーからD2を取り外し、糸くずの出ないワイプでドロップホルダーを清掃します。
  12. 次回の実行の詳細(濃度:5 nM、分子量:116 kDa)を入力し、 Calcを押します。
  13. 2つ目のバイオセンサーをBLItzシステムに取り付け、チューブA2をチューブホルダーに入れ、バイオセンサーの下にスライドさせます。
  14. 初期ベースラインを設定したら、4 μL の 12.5 nM 基質をドロップホルダーに加えます。バイオセンサーの下に滑り込ませ、フタを閉めます。チューブA2をD3に交換し、バイオセンサーの下にスライドさせます。次に、10 nMのRPAストック4 μLをチューブホルダーに加え、バイオセンサーの下にスライドさせます。
  15. 関連付け後、D4をバイオセンサーの下にスライドさせて解離させます。
  16. 後続の 3 つの濃度の RPA(10 nM、20 nM、40 nM)について、ステップ 3.1.12 から 3.1.15 を繰り返します。これらの濃度の結合曲線を 図 5 に示します。
  17. データ解析とKD 値は、BLIの基本動力学と同じ手順で適合させることができます(ステップ2.5、 表2)。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

BLIでは、白色光はバイオレイヤー/バッファーの界面と内部基準界面から分光器に反射されます。結果として生じる干渉パターンが記録され、スペクトルシフトが一定期間にわたって測定され、結合曲線の応答としてnmで表されます。 図1に、分析物が結合する場合とない場合のバイオセンサーチップと、それに対応するスペクトル波長シフト(nm)...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

BLIを用いて任意のタンパク質のその基質への結合速度論を解析する能力は、細胞内のタンパク質-DNA相互作用を支配する特定の因子(DNAの配列、構造、または長さなど)を単離し、特徴付ける手段を提供する19。オクテットN1システムは、バイオレイヤー干渉法の原理に依存しており、タンパク質-タンパク質およびタンパク質-核酸相互作用の定量的測定...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

開示事項

著者には、宣言する利益相反はありません。

謝辞

この研究は、全米科学財団(1929346)と米国がん協会(RSG-21-028-01)からの助成金によって資金提供されました。また、バラクリシュナン研究室の皆さんにも、有益な議論をいただき、ありがとうございました。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 mL Micro Centrifuge TubesGlobe Scientific111554A
96 Well Standard Black MicroplateDot Scientific4ti-0223
Biotinylated poly dT OligonucleotideIDT
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153-10G
Dithiothreitol (DTT)Dot ScientificDSD11000-10
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Dot ScientificDSE57020-500
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-500
Kimtec Science Kimwipes Kimtech34120
Octet N1 SoftwareSartorius 1.4.0.13
Octet SA Biosensor Sartorius 18-5019
PBS pH 7.2 (10x)Gibco1666711
Personal Assay Octet N1 SystemSartorius 
Phosphoric Acid Ward's Science470302-024
Sodium Chloride (NaCl)Dot ScientificDSS23020-5000
Tris BaseDot ScientificDST60040-5000
Tween20 Bio-Rad170-6531

参考文献

  1. Kalodimos, C. G., et al. Structure and flexibility adaptation in non-specific and specific protein-DNA complexes. Science. 305 (5682), 386-389 (2004).
  2. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9 (23), 6505-6525 (1981).
  3. Lane, D., Prentki, P., Chandler, M. Use of gel retardation to analyze protein-nucleic acid interactions. Microbiol Rev. 56 (4), 509-528 (1992).
  4. Dyer, R. B., Herzog, N. K. Immunodepletion EMSA: A novel method to identify proteins in a protein-DNA complex. Nucleic Acids Res. 23 (16), 3345-3346 (1995).
  5. Dudley, R. K. A laboratory guide to in vitro studies of protein-DNA interactions. FEBS Lett. 306, 2-3 (1991).
  6. Tsai, C., Smider, V., Hwang, B. J., Chu, G. Electrophoretic mobility shift assays for protein-DNA complexes involved in DNA repair. Methods Mol Biol. 920, 53-78 (2012).
  7. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).
  8. Heffler, M. A., Walters, R. D., Kugel, J. F. Using electrophoretic mobility shift assays to measure equilibrium dissociation constants: GAL4-p53 binding DNA as a model system. Biochem Mol Biol Educ. 40 (6), 383-387 (2012).
  9. Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. J Vis Exp. (84), e51383(2014).
  10. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J Pharm Biomed Anal. 72, 150-154 (2013).
  11. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
  12. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).
  13. Schasfoort, R. B. M., Tudos, A. J. Handbook of surface plasmon resonance. , RSC Pub. (2008).
  14. Douzi, B. Surface plasmon resonance: A sensitive tool to study protein-protein interactions. Methods Mol Biol. 2715, 363-382 (2024).
  15. Douzi, B. Protein-protein interactions: Surface plasmon resonance. Methods Mol Biol. 1615, 257-275 (2017).
  16. Drescher, D. G., Selvakumar, D., Drescher, M. J. Analysis of protein interactions by surface plasmon resonance. Adv Protein Chem Struct Biol. 110, 1-30 (2018).
  17. Martin, S. R., Ramos, A., Masino, L. Biolayer interferometry: Protein-RNA interactions. Methods Mol Biol. 2263, 351-368 (2021).
  18. Apiyo, D. Biomolecular binding kinetics assays on the Octet BLI platform. , https://www.sartorius.com/resource/blob/742330/05671fe2de45d16bd72b8078ac28980d/octet-biomolecular-binding-kinetics-application-note-4014-en-1--data.pdf (2022).
  19. Barrows, J. K., Van Dyke, M. W. Biolayer interferometry for DNA-protein interactions. PLoS One. 17 (2), e0263322(2022).
  20. Desai, M., Di, R., Fan, H. Application of biolayer interferometry (BLI) for studying protein-protein interactions in transcription. J Vis Exp. (149), e59687(2019).
  21. Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic acid interactions by biolayer interferometry. Curr Protoc Protein Sci. 79, 19.25.1-19.25.26 (2015).
  22. Petersen, R. L. Strategies using bio-layer interferometry biosensor technology for vaccine research and development. Biosensors (Basel). 7 (4), 49(2017).
  23. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization. Comb Chem High Throughput Screen. 12 (8), 791-800 (2009).
  24. Wold, M. S. Replication protein A: A heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism. Annu Rev Biochem. 66, 61-92 (1997).
  25. Qureshi, M. H., Ray, S., Sewell, A. L., Basu, S., Balci, H. Replication protein A unfolds G-quadruplex structures with varying degrees of efficiency. J Phys Chem B. 116 (19), 5588-5594 (2012).
  26. Wold, M. S., Kelly, T. Purification and characterization of replication protein A, a cellular protein required for in vitro replication of simian virus 40 DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (8), 2523-2527 (1988).
  27. Bochkareva, E., Korolev, S., Lees-Miller, S. P., Bochkarev, A. Structure of the RPA trimerization core and its role in the multistep DNA-binding mechanism of RPA. EMBO J. 21 (7), 1855-1863 (2002).
  28. Brosey, C. A., et al. NMR analysis of the architecture and functional remodeling of a modular multidomain protein, RPA. J Am Chem Soc. 131 (18), 6346-6347 (2009).
  29. Fanning, E., Klimovich, V., Nager, A. R. A dynamic model for replication protein A (RPA) function in DNA processing pathways. Nucleic Acids Res. 34 (15), 4126-4137 (2006).
  30. Gibb, B., et al. Protein dynamics during presynaptic-complex assembly on individual single-stranded DNA molecules. Nat Struct Mol Biol. 21 (10), 893-900 (2014).
  31. Nguyen, B., et al. Diffusion of human replication protein A along single-stranded DNA. J Mol Biol. 426 (19), 3246-3261 (2014).
  32. Brosey, C. A., et al. Functional dynamics in replication protein A DNA binding and protein recruitment domains. Structure. 23 (6), 1028-1038 (2015).
  33. Chen, R., Subramanyam, S., Elcock, A. H., Spies, M., Wold, M. S. Dynamic binding of replication protein a is required for DNA repair. Nucleic Acids Res. 44 (12), 5758-5772 (2016).
  34. Kemmerich, F. E., et al. Force regulated dynamics of RPA on a DNA fork. Nucleic Acids Res. 44 (12), 5837-5848 (2016).
  35. Pokhrel, N., et al. Dynamics and selective remodeling of the DNA-binding domains of RPA. Nat Struct Mol Biol. 26 (2), 129-136 (2019).
  36. Wang, Q. M., et al. Human replication protein A induces dynamic changes in single-stranded DNA and RNA structures. J Biol Chem. 294 (38), 13915-13927 (2019).
  37. Wyka, I. M., Dhar, K., Binz, S. K., Wold, M. S. Replication protein A interactions with DNA: Differential binding of the core domains and analysis of the DNA interaction surface. Biochemistry. 42 (44), 12909-12918 (2003).
  38. Kim, C., Snyder, R. O., Wold, M. S. Binding properties of replication protein A from human and yeast cells. Mol Cell Biol. 12 (7), 3050-3059 (1992).
  39. Caldwell, C. C., Spies, M. Dynamic elements of replication protein A at the crossroads of DNA replication, recombination, and repair. Crit Rev Biochem Mol Biol. 55 (5), 482-507 (2020).
  40. Mishra, A. K., Dormi, S. S., Turchi, A. M., Woods, D. S., Turchi, J. J. Chemical inhibitor targeting the replication protein A-DNA interaction increases the efficacy of Pt-based chemotherapy in lung and ovarian cancer. Biochem Pharmacol. 93 (1), 25-33 (2015).
  41. Gavande, N. S., et al. Structure-guided optimization of replication Protein A (RPA)-DNA interaction inhibitors. ACS Med Chem Lett. 11 (6), 1118-1124 (2020).
  42. Ana Jug, T. B., Janez Ilaš, Biolayer interferometry and its applications in drug discovery and development. TrAC Trends Anal Chem. 176, 117741(2024).
  43. Gator Bio, I. Using BLI for viral and lipid-based vector analytics. , News Medical. https://www.news-medical.net/whitepaper/20230322/Using-BLI-for-viral-and-lipid-based-vector-analytics.aspx (2023).
  44. Noy-Porat, T., et al. Characterization of antibody-antigen interactions using biolayer interferometry. STAR Protoc. 2 (4), 100836(2021).
  45. Onyekachi Ononye, S. S., et al. Biochemical impact of p300-mediated acetylation of replication protein A: Implications for DNA metabolic pathway choice. bioRxiv. , (2024).
  46. Weeramange, C. J., Fairlamb, M. S., Singh, D., Fenton, A. W., Swint-Kruse, L. The strengths and limitations of using biolayer interferometry to monitor equilibrium titrations of biomolecules. Protein Sci. 29 (4), 1018-1034 (2020).
  47. Artem Stetsenko, A. G. An Overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization. Crystals. 7 (7), 197(2017).
  48. Hubbe, M. A., Szlek, D. B., Vera, R. E. Detergency mechanisms and cellulosic surfaces: A review. BioResources. 17 (4), 7167-7249 (2022).
  49. Renee Tobias, S. K., Apiyo, A. Research the Industry Standard for Label-Free of Biomolecular Interactions Analysis (BIA). , https://www.sartorius.com/en/products/biolayer-interferometry/bli-resources (2021).
  50. Octet NTA Biosensor Kinetic Assays. , Sartorius. https://www.sartorius.com/resource/blob/552398/b27ccc2fdfde7a9320909572ced3f6a1/ni-nta-biosensor-kinetic-assays-technical-note-en-sartorius-data.pdf (2024).
  51. Application Guides: Kinetics and affinity measurements with Biacore systems. , Cytiva. Available from: https://cdn.cytivalifesciences.com/api/public/content/digi-33042-pdf (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

BLIDNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved