JoVE Logo
Auteurs
Contactez-nous

S'identifier

Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.

Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Cet article décrit un protocole permettant d’étudier les interactions ADN-protéines à l’aide d’un système d’interférométrie de biocouche (BLI) à base de streptavidine. Il décrit les étapes et les considérations essentielles pour l’utilisation de la cinétique de liaison de base ou avancée pour déterminer l’affinité de liaison à l’équilibre (KD) de l’interaction.

Résumé

Les interactions protéine-ADN sous-tendent les processus cellulaires essentiels. La compréhension de ces interactions est essentielle pour élucider les mécanismes moléculaires de diverses voies. Des facteurs clés tels que la structure, la séquence et la longueur d’une molécule d’ADN peuvent influencer de manière significative la liaison aux protéines. L’interférométrie de biocouche (BLI) est une technique sans marquage qui mesure la cinétique de liaison entre les molécules, offrant une approche simple et précise pour étudier quantitativement les interactions protéine-ADN. L’un des principaux avantages de la BLI par rapport aux méthodes traditionnelles basées sur le gel est sa capacité à fournir des données en temps réel sur la cinétique de liaison, ce qui permet de mesurer avec précision la constante de dissociation à l’équilibre (KD) pour les interactions dynamiques protéine-ADN. Cet article présente un protocole de base pour déterminer la valeur KD de l’interaction entre une protéine de réplication de l’ADN, la protéine de réplication A (RPA) et un substrat d’ADN simple brin (ADNsb). La RPA se lie à l’ADNsb avec une grande affinité, mais doit également être facilement déplacée pour faciliter les interactions protéiques ultérieures dans les voies biologiques. Dans le test BLI décrit, l’ADNsb biotinylé est immobilisé sur un biocapteur enrobé de streptavidine. La cinétique de liaison (association et dissociation) de la RPA à l’ADN lié au biocapteur est ensuite mesurée. Les données résultantes sont analysées pour dériver des valeurs précises pour la constante de vitesse d’association (ka), la constante de vitesse de dissociation (kd) et la constante de liaison à l’équilibre (K D) à l’aided’un logiciel système.

Introduction

Les protéines cellulaires jouent un rôle central dans l’orchestration des processus biologiques complexes qui se produisent dans les organismes vivants. Le fonctionnement optimal de ces voies dépend de l’interaction entre les protéines et d’autres biomolécules à l’intérieur de la cellule, y compris les interactions avec les protéines partenaires et les acides nucléiques1. Ainsi, la compréhension des subtilités des processus cellulaires nécessite une compréhension approfondie de la dynamique des interactions protéine-acide nucléique.

Traditionnellement, les interactions protéine-acide nucléique ont été étudiées à l’aide de tests de déplacement électrophorétique sur gel de mobilité (EMSA)2. Dans ce test, les protéines sont incubées avec des oligonucléotides synthétiques (soit de l’ADN/ARN, contenant des longueurs ou des séquences spécifiques) pendant une courte période, puis la réaction est électrophorésisée sur un gel de polyacrylamide natif (PAGE) 3,4,5. Pour permettre la visualisation de l’interaction protéine-oligonucléotide, les oligonucléotides sont généralement marqués radioactivement avec du 32P ou marqués avec des molécules fluorescentes. Si la protéine interagit et se lie à l’oligonucléotide, la liaison de la protéine ralentit la mobilité de l’acide nucléique dans le gel 6,7. Ainsi, cette méthode est également appelée test de décalage de gel ou de retard de gel. Bien que cette méthode ait été largement utilisée, il y a quelques limites à prendre en compte lors de l’utilisation de cette méthode pour obtenir des valeurs KD, notamment une faible résolution due à une liaison faible ou dynamique, la nécessité d’une concentration significativement élevée de protéines et plus d’efforts. De plus, les EMSA ne sont pas des tests en temps réel et, par conséquent, ne peuvent pas mesurer avec précision la cinétiquede liaison 7,8.

Des techniques innovantes telles que la résonance plasmonique de surface (SPR) et l’interférométrie de biocouche (BLI) ont émergé pour surmonter ces limitations 9,10,11,12. Les deux méthodes mesurent les constantes de taux d’association/dissociation et les constantes d’affinité entre les molécules sans marquage. Comme il n’est pas nécessaire de marquer la protéine, ces techniques éliminent le risque d’altérer les propriétés de la protéine ou de bloquer le site de liaison. Dans SPR, la lumière polarisée interagit avec un capteur (un film conducteur métallique, généralement de l’or), générant une onde de densité de charge électronique appelée plasmon. Cette interaction diminue l’intensité du faisceau réfléchi et un détecteur mesure le changement de l’angle spécifique, connu sous le nom d’angle de résonance13. Pour étudier les interactions ligand (acide nucléique) - analyte (protéine), le ligand est immobilisé dans une cellule d’écoulement sur la puce du capteur, et l’analyte est injecté dans la cellule d’écoulement contenant le ligand immobilisé. Lors de la liaison de l’analyte au ligand, il y a un changement détectable de l’indice de réfraction près de la surface du capteur, permettant ainsi de mesurer les interactions moléculaires 14,15,16.

L’interférométrie de biocouche (BLI) mesure le modèle d’interférence lumineuse lorsque la lumière passe à travers une fibre optique avec une biocouche, composée d’un ligand (appât) et de son partenaire de liaison (analyte), à la surface inférieure de la pointe du biocapteur. La lumière est transmise à travers l’extrémité et réfléchie aux deux extrémités de la biocouche en raison des propriétés de la biocouche. L’épaisseur de la biocouche est proportionnelle au nombre de molécules liées qui influencent le motif de la lumière réfléchie. En comparant la variation de la courbe d’intensité relative vs. Longueur d’onde causée par l’interférence entre la lumière réfléchie de l’interface de référence et de l’interface biocouche/tampon, la variation d’épaisseur de la biocouche peut être déterminée. Lorsqu’un plus grand nombre de molécules se lient, un décalage plus important se produit, ce qui fait de BLI un outil puissant pour étudier les interactions biomoléculaires en temps réel. La variation du diagramme d’interférence est mesurée et représentée sur un sensorgramme sous la forme d’un décalage spectral17,18 (Figure 1A). La nature de l’interaction de liaison peut être déterminée avec précision en utilisant des contrôles appropriés, tels qu’une configuration dépourvue des concentrations de ligands variables du partenaire de liaison 19,20,21. Par rapport à la SPR, BLI est rentable et convivial, ce qui la rend accessible à un large éventail de chercheurs. De plus, les échantillons utilisés dans le BLI restent intacts s’il n’y a pas de dégradation ou d’agrégation. Cela permet de les récupérer et de les réutiliser, minimisant ainsi les déchets. L’instrument BLI fonctionne sans l’utilisation de la microfluidique, éliminant ainsi les inconvénients du système fluidique, tels que la nécessité de maintenance/entretien, le colmatage ou l’utilisation de tampons dégazés. Il minimise également le risque de contamination de l’instrument en raison d’échantillons de protéines non filtrées ou brutes.

Dans une expérience BLI, la biocouche est établie en immobilisant la molécule d’appât sur le biocapteur. La biocouche des biocapteurs peut interagir avec différents tags, permettant d’étudier les interactions entre molécules (notamment les acides nucléiques, les protéines, les anticorps, les virus, les petites molécules, etc.)22. Diverses stratégies de capture, y compris la biotine/streptavidine, le 6X-His-tag/Ni-NTA, le FLAG/anti-FLAG, le GST/anti-GST et les anticorps/anti-Fc, peuvent être employées pour établir cette immobilisation. Le maintien de la structure et de l’activité du ligand immobilisé est crucial lors du choix du biocapteur. Les changements dans le motif d’interférence sont influencés par la quantité de molécule liée ainsi que par la matrice23. Les interactions protéine-acide nucléique sont étudiées à l’aide de sondes oligonucléotidiques biotinylées qui peuvent être immobilisées sur des biocapteurs recouverts de streptavidine. Les échantillons de protéines susceptibles d’interagir avec l’appât immobilisé (oligonucléotide) sont en contact avec l’oligonucléotide pendant une période spécifique dans un tampon de liaison pour mesurer l’association, puis passent à un tampon de liaison à blanc pour mesurer la dissociation. Une représentation schématique de la liaison de l’analyte et des changements correspondants dans la courbe de liaison est illustrée à la figure 1B. De plus, les interactions protéine-nucléique peuvent également être étudiées par une voie d’immobilisation inversée, dans laquelle la protéine (appât) est capturée sur le biocapteur et interagit avec l’acide nucléique (analyte).

À l’heure actuelle, il existe dans le commerce de nombreux instruments fonctionnant selon le principe de l’interférométrie de la biocouche. Un instrument simple et rentable est connu sous le nom de système Octet N1, qui dispose d’un seul canal pour le débit de données. Il nécessite une utilisation manuelle, consomme un volume d’échantillon minimal (4 μL) et effectue l’analyse d’échantillons à des températures ambiantes 9,23. Cet instrument à canal unique peut détecter l’efficacité de liaison des protéines supérieures à 10 kDa et mesure les affinités dans la gamme micromolaire (μM) à nanomolaire (nM)11,12. Certains instruments à 2, 8, 16 et 96 canaux pour la lecture automatique des données sont également disponibles et compatibles avec les formats 96 ou 384 puits19,20. Certains de ces instruments peuvent également fonctionner entre 4 °C et 40 °C, détecter des biomolécules de poids moléculaire aussi bas que 150 Da et mesurer des affinités comprises entre le millimolaire et le picomolaire de19,21. Bien que le système décrit soit rentable, les instruments plus coûteux à plusieurs canaux offrent un traitement automatique à haut débit. Ces systèmes avancés sont couramment utilisés dans la caractérisation et le développement de molécules médicamenteuses biologiques 9,23.

Le protocole actuel décrit les étapes impliquées dans la mesure des paramètres de liaison de la protéine de réplication A (RPA) à l’ADN simple brin (ADN-ss) à l’aide du système d’interférométrie manuelle de biocouche à canal unique. La RPA est un complexe protéique hétérotrimérique de liaison à l’ADNsb qui joue un rôle essentiel dans presque tous les aspects du métabolisme de l’ADN, y compris la réplication, la réparation et la recombinaison de l’ADN24. En raison de sa grande affinité pour l’ADNss (mesuré dans la gamme subnanomolaire), il peut se lier rapidement à l’ADNss généré lors de diverses transactions d’ADN, le protéger de la dégradation nucléolytique et empêcher la liaison impromptue d’autres protéines en aval. La RPA joue également un rôle essentiel dans la prévention de la formation de structures secondaires et tertiaires non canoniques, telles que les G-quadruplexes25. La RPA humaine est composée de trois sous-unités : RPA70 (70 kDa), RPA32 (32 kDa) et RPA14 (14 kDa), également appelées RPA 1, RPA 2 et RPA 3, respectivement24, 26, 27. Ces sous-unités abritent six plis de liaison oligonucléotides/oligosaccharides (OB-folds) marqués de A à F. Parmi ceux-ci, les domaines de liaison à l’ADN (DBD) se trouvent sur les sous-unités RPA1 (DBD-A, DBD-B, DBD-C) et RPA2 (DBD-D)28. On a d’abord pensé que, selon la longueur de l’ADN, la RPA présente différents modes de liaison où différents DBD étaient engagés à des longueurs d’ADN spécifiques29. Les données provenant d’études structurales et de molécules uniques récentes ont permis d’affiner ces modèles pour suggérer que la liaison des différents DBD de la RPA est plus dynamique que ce qui avait été initialement suggéré 30,31,32,33,34,35,36. Cette caractéristique de la propriété de liaison dynamique est essentielle au fonctionnement de la RPA, car la RPA devrait être capable de se lier étroitement au substrat d’ADN lors de certaines transactions d’ADN ; Cependant, il doit également être capable de se déplacer du substrat pour passer le substrat à la protéine suivante au cours du processus biologique. À l’aide de différentes techniques biochimiques, il a été déterminé que le KD pour RPA est d’environ 0,4 nM pour un substrat ss-(polydT)30, et de 80 nM et 200 nM pour les substrats ss-(polydA)257 et dG-(polydG)602 respectivement, mesuré par anisotropie de polarisation de fluorescence (FPA)37,38. La RPA montre également une préférence environ 50 fois plus élevée pour la liaison aux séquences riches en pyrimidine par rapport aux purines. Bien que différentes techniques biochimiques aient déterminé différentes mesures de KD pour la RPA, toutes les mesures ont été de l’ordre du nanomolaire, suggérant la forte affinité de liaison de la RPA pour l’ADNsb. En utilisant la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale (TIRFM), il a été découvert que, sur la base de la longueur de l’ADN, la RPA s’associait à au moins deux modes de liaison : l’un qui était défini à la dissociation rapide (Kd, 680 pM) et un complexe à dissociation lente (Kd, 60 pM)33,39. Compte tenu de son implication essentielle dans presque toutes les voies métaboliques de l’ADN, il y a eu un vif intérêt pour la création d’inhibiteurs qui peuvent entraver l’interaction entre la RPA et l’ADN simple brin (ADNsb). Ces inhibiteurs chimiques sont essentiels pour perturber la réponse aux dommages de l’ADN, rendant les cellules cancéreuses plus sensibles aux agents endommageant l’ADN utilisés dans les thérapies cliniques. L’utilisation du test BLI permet une évaluation quantitative précise de l’efficacité de l’inhibiteur dans la modulation de la fonction de liaison de la RPA40,41.

La configuration BLI permet des réglages distincts : cinétique de base et avancée. En mode cinétique de base, le test comprend trois étapes principales : l’établissement de la ligne de base, l’association et la dissociation. Cependant, avant d’effectuer ce test, les biocapteurs doivent être revêtus séparément, à l’aide de l’instrument ou manuellement sur la paillasse du laboratoire. À l’inverse, le mode cinétique avancé s’étend au-delà des trois étapes fondamentales, ce qui permet d’incorporer des étapes supplémentaires. Ces étapes supplémentaires peuvent servir à diverses fins, telles que le conditionnement du biocapteur aux modifications du tampon ou la facilitation de la détection d’interactions protéiques ultérieures. La cinétique avancée permet également de dépouiller le biocapteur de l’analyte par une bonne méthode de régénération pour une réutilisation potentielle, à condition que l’appât et le biocapteur restent intacts. En général, la cinétique avancée est utilisée par rapport à la cinétique de base lorsque plusieurs étapes sont impliquées dans le test, ou que le test doit être effectué dans un format plus complexe.

Ce protocole décrit les deux méthodes en utilisant le même appât [3'Bio-ss-poly (dT)32] et le même analyte (RPA). Un biocapteur enrobé de streptavidine sera utilisé pour immobiliser l’appât, et des mesures de KD pour l’analyte seront obtenues. Ce protocole décrit une approche complète pour effectuer un test BLI à l’aide d’un instrument d’interférométrie de biocouche à canal unique, couvrant la préparation d’appâts de biocapteurs, les considérations relatives aux tampons et un aperçu étape par étape de la procédure.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation de l’appât, de l’analyte, des tampons et nettoyage du porte-goutte

  1. Installation de l’instrument : Allumez l’instrument au moins 1 h avant de commencer l’expérience. Cela permettra à la lampe de se réchauffer.
  2. Préparation des tampons de décapage et de nettoyage
    1. Tampon de décapage : Préparez 50 mL d’acide phosphorique 0,15 M [pH 2,0]).
    2. Tampon de nettoyage : Préparez 10 mL de HCl 0,5 N.
  3. Préparation du tampon BLI
    1. Préparez 50 mL de 1 tampon BLI (50 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0,1 mg/mL BSA, 1 mM DTT, 0,05 % Tween 20). Stockez ce tampon à 4 °C. Avant de mettre en place ce test, amenez le tampon à température ambiante.
      REMARQUE : Il est fortement recommandé de préparer des tampons frais pour l’essai, car les tampons vieillis peuvent subir des altérations du pH ou la formation d’agrégats et peuvent présenter des contaminations microbiennes, ce qui peut compromettre la reproductibilité et l’exactitude des résultats. Il n’est pas recommandé d’utiliser des tampons qui ont été stockés pendant plus de deux semaines.
  4. Préparation de l’appât/substrat
    1. Préparez 12,5 nM de substrat 3'Bio-ss-poly (dT)32 (5' TTT TTT TTT TTT TTT TT 3'Bio) à l’aide du tampon BLI.
  5. Préparation des stocks de concentration en protéines
    1. Préparez quatre concentrations de RPA (5 nM, 10 nM, 20 nM, 40 nM) à l’aide d’un tampon BLI. La concentration la plus élevée de la protéine (40 nM) est obtenue en diluant la protéine mère dans un tampon BLI. Les dilutions ultérieures sont préparées par dilution en série de la solution de travail de 40 nM. Assurez-vous que tous les stocks de protéines sont conservés sur de la glace tout au long de l’expérience pour maintenir la stabilité.
  6. Nettoyage du support de goutte
    1. Ajoutez 4 μL d’eau distillée et nettoyez le porte-goutte avec une lingette non pelucheuse (répétez 3 fois). Ensuite, répétez cette étape avec 4 μL d’éthanol à 70 % et nettoyez avec une lingette non pelucheuse. Cette étape assure l’élimination des contaminants de surface et des particules de poussière.
    2. Ajoutez 4 μL de HCl 0,5 N et laissez-le dans le support de goutte pendant 1 min. Nettoyez-le avec une lingette non pelucheuse et répétez cette étape une fois de plus. Cela garantit un nettoyage en profondeur du support de goutte. Le nettoyage en profondeur est particulièrement utile pour nettoyer le porte-gouttes des gouttes séchées lors d’une utilisation précédente.
    3. 1Répétez l’étape 1 pour laver le support de goutte avec de l’eau distillée et de l’éthanol à 70 % et essuyez-le avec une lingette non pelucheuse. Le support de chute est maintenant prêt à être utilisé.

2. Cinétique de base

  1. Configuration de l’instrument et du logiciel
    1. Ouvrez le logiciel et sélectionnez Basic Kinetics sur le panneau de gauche (Figure supplémentaire 1).
    2. Retirez le rack de biocapteurs du plateau (obtenu auprès de sources commerciales) et placez une plaque à 96 puits dans le plateau. Ajoutez 200 μL de tampon BLI dans le premier puits. Ensuite, replacez le plateau de biocapteurs sur la plaque de 96 puits, en vous assurant que chaque biocapteur est inséré dans le puits correspondant. Le premier biocapteur doit maintenant être immergé dans le tampon BLI du premier puits.
    3. Sur le logiciel, cliquez sur Hydrater et allumez la minuterie pendant 10 min, ce qui permet au biocapteur unique de s’hydrater pendant au moins 10 min. Cette étape hydrate le biocapteur pour le rendre prêt pour le test BLI.
    4. Pendant que le biocapteur est hydraté, pipetez 250 μL de tampon BLI dans deux tubes de 0,5 mL. Étiquetez l’un comme « A » (association) et l’autre comme « D » (dissociation).
    5. Remplissez les détails sur le logiciel (Nom : Revêtement du substrat et description du test : RPA- 3'Bio-ss-poly (dT)32 : Cinétique de base).
    6. Ajustez le paramètre de course pour chaque étape : Ligne de base (30 s), Association (120 s), Dissociation (120 s) (Tableau 1). Gardez le shaker allumé pour le tube et le support de goutte. La vitesse de l’agitateur est réglée à 2200 tr/min (plage, 1000-2600 tr/min), ce qui empêche les effets de transport de masse causés par la diffusion limitée près de la surface du biocapteur.
      REMARQUE : Il est recommandé d’optimiser la durée de chaque étape (ligne de base, chargement, association, dissociation) lors de la mise en place d’un test de cinétique de liaison afin d’améliorer l’acquisition des données.
  2. Etablissement d’une courbe de référence
    1. Placez le tube A dans le support de tube et fixez le biocapteur hydraté au système BLI. Faites glisser le support de tube sous le biocapteur (position A, Figure 2).
      REMARQUE : Les biocapteurs ne doivent pas être complètement séchés à aucun moment pendant l’expérience. Si on le laisse sécher, les lectures de l’expérience peuvent être considérablement faussées.
    2. Appuyez sur Exécuter et suivez les instructions du message d’invite.
    3. Après avoir terminé la ligne de base initiale, ouvrez le couvercle et ajoutez 4 μL de tampon BLI dans le support de goutte. Faites-le glisser vers la droite sous le même biocapteur (position B, Figure 2). Fermez le couvercle et surveillez la courbe BLI sur le logiciel (Figure 3, courbe bleue).
    4. Une fois l’opération terminée, ouvrez le couvercle pour remplacer le tube « A » par « D » et glissez-le sous le biocapteur (position A, Figure 2). Fermez le couvercle et procédez à l’étape de dissociation. Une fois l’opération terminée, ouvrez le couvercle, détachez le biocapteur, remettez-le dans le plateau et assurez-vous que le biocapteur est trempé dans le tampon BLI.
    5. Retirez l’échantillon/tampon, nettoyez le support de goutte avec un tampon avant de le sécher avec des lingettes non pelucheuses et retirez le tube « D » du support de tube.
  3. Revêtement du substrat
    1. Placez le tube A dans le support de tube et fixez le biocapteur hydraté au système BLI. Faites glisser le support de tube sous le biocapteur et appuyez sur Exécuter.
    2. Après l’étape de référence initiale, ajoutez 4 μL de substrat 12,5 nM [3'Bio-ss-poly (dT)32] dans le support de goutte et glissez-le sous le biocapteur. Fermez le couvercle et surveillez la courbe BLI sur le logiciel. Assurez-vous que cette réponse est supérieure à la valeur de référence (Figure 3).
      REMARQUE : La concentration du substrat peut être optimisée en enrobant les biocapteurs de différentes concentrations (une seule concentration par biocapteur) et en observant les courbes de liaison. Une courbe de liaison avec un signal visiblement plus élevé par rapport à la ligne de base suffit à confirmer le revêtement du substrat. Une surcharge du biocapteur peut entraîner une gêne stérique ou un encombrement à la surface. La figure 3montre les courbes de cinq concentrations de substrat biotinylé 3'Bio-ss-poly (dT)32 . De plus, une fois l’étape de chargement de l’appât terminée, les biocapteurs peuvent être plongés dans un tampon bloquant la streptavidine (biocytine) pendant 30 s, puis lavés dans un tampon BLI. Cela bloquera la surface non liée de la streptavidine et empêchera la liaison non spécifique.
    3. Une fois l’étape d’association terminée, ouvrez le couvercle et remplacez le tube « A » par le tube « D ». Glissez-le sous le biocapteur et fermez le couvercle.
    4. Une fois l’étape de dissociation terminée, ouvrez le couvercle, détachez le biocapteur et placez-le dans le plateau du biocapteur contenant le tampon BLI. Assurez-vous que le biocapteur est complètement trempé dans le tampon et qu’il est suffisamment hydraté pour les prochaines étapes. Nettoyez le support de gouttes avec un tampon de dosage, séchez-le avec des lingettes non pelucheuses et retirez le tube « D » du support de tube. Le biocapteur est maintenant recouvert du substrat 3'Bio-ss-poly (dT)32 .
  4. Liaison aux protéines
    1. Pipeter 250 μL de tampon BLI dans dix tubes microfuges noirs de 0,5 mL. Étiquetez-les de A1 à A5 et de D1 à D5.
    2. Dans une autre plaque de 96 puits, ajoutez 200 μL de tampon de décapage dans le puits, correspondant à la position du biocapteur hydraté.
    3. Avant de commencer le test, nettoyez le support de goutte 3x avec le tampon BLI.
    4. Ouvrez un nouveau fichier sur le logiciel et sélectionnez Cinétique de base dans le panneau de gauche. Nommez le test et ajoutez-en une description au besoin (figure supplémentaire 2). Ajustez les paramètres d’exécution selon vos besoins (Tableau 1).
    5. Placez le tube étiqueté A1 dans le support de tube et fixez le biocapteur revêtu de 3'Bio-ss-poly (dT)32 au système BLI. Faites glisser le tube sous le biocapteur et appuyez sur Exécuter.
    6. Une fois l’étape de référence initiale terminée, ouvrez le couvercle, ajoutez 4 μL de tampon BLI dans le support de goutte et glissez-le sous le biocapteur. Il s’agira de la concentration en protéines de 0 nM et servira de courbe de référence.
    7. Une fois l’étape d’association terminée, remplacez le tube A1 par le tube D1 et glissez-le sous le biocapteur.
    8. Une fois l’étape de dissociation terminée, retirez le biocapteur et remettez-le dans son plateau. Assurez-vous que le biocapteur est complètement immergé dans le tampon et correctement hydraté pour les prochaines étapes. Retirez le tube D1, nettoyez le support de goutte avec un tampon de dosage et séchez-le avec une lingette non pelucheuse.
    9. Ensuite, la courbe de liaison pour le stock RPA 5 nM sera obtenue. Remplissez les détails de l’échantillon (concentration : 5 nM, poids moléculaire : 116 KDa) et appuyez sur Calc. Cela calculera la concentration en protéines en μg/μL.
    10. Fixez le biocapteur revêtu de 3'Bio-ss-poly (dT)32 et placez le tube A2 dans le support de tube. Glissez-le sous le biocapteur et appuyez sur Exécuter.
    11. Après la ligne de base, ajoutez 4 μL de RPA 5 nM sur le support de goutte et glissez-le sous le biocapteur. Fermez le couvercle et surveillez la courbe d’association. La liaison des protéines à l’appât peut être visualisée par une courbe plus haute que la courbe de base. Après l’étape d’association, remplacez A2 par D2, glissez-le sous le biocapteur et terminez l’étape de dissociation.
    12. Retirez le biocapteur, plongez-le dans le tampon de décapage pendant 30 s, puis trempez-le dans le tampon BLI pendant 3 min.
      REMARQUE : L’efficacité de régénération dépend de l’appât immobilisé et de l’analyte perturbé. Certains biocapteurs immobilisés peuvent résister à dix cycles de régénération ou plus. Nous avons pu décaper le substrat biotinylé 3'Bio-ss-poly (dT)32 plus de trois fois (figure supplémentaire 3) sans observer de changement notable dans la réponse.
    13. Répétez les étapes 2.4.9 à 2.4.12 pour les trois autres concentrations d’APR de 10 nM, 20 nM et 40 nM. Assurez-vous de démonter le biocapteur pour chaque concentration.
      REMARQUE : Pour les tests BLI, les experts recommandent d’utiliser quatre concentrations (à l’exclusion de la courbe de référence), couvrant environ de 0,1x à 10x le KD attendu pour des mesures cinétiques précises. Ici, les quatre concentrations ont été obtenues par dilutions en série.
  5. Analyse des données et calcul des valeurs KD
    1. Avant de calculer la valeur KD , il est nécessaire d’inspecter visuellement le sensorgramme pour chaque concentration de liaison RPA sur le substrat 3'Bio-ss-poly (dT)32 . Assurez-vous que le signal BLI augmente avec l’augmentation de la concentration de RPA jusqu’à ce que l’ADN immobilisé soit saturé (Figure 4).
      REMARQUE : Pour des résultats fiables, assurez-vous qu’au moins quatre concentrations de protéines sont liées avec succès au substrat, à l’exclusion de la concentration d’analyte de 0 nM. Reportez-vous à la section de discussion pour résoudre les erreurs potentielles.
    2. Dans le tableau « Liste d’exécution », cochez Ref pour une concentration d’analyte de 0 nM comme courbe de référence. Cochez la case Analyser pour toutes les concentrations de l’analyte.
    3. Ensuite, sélectionnez à la fois Début de l’association et Début de la dissociation pour la correction d’étape . Cela alignera le début de l’association avec la fin de la ligne de base et le début de la dissociation avec la fin de l’association, qui est généralement causée par des motifs de réflexion différents entre le support de goutte et le tube si le tampon correspond bien.
    4. Sélectionnez Ajustement global (1:1) pour ce test. L’analyse globale calcule les valeurs KD pour un ensemble complet de concentrations de protéines, tandis que l’analyse locale concerne une seule concentration de protéines.
      REMARQUE : Le logiciel accompagnant l’instrument ne permet qu’un ajustement 1:1. Il pourrait s’agir d’une mise en garde potentielle lorsque l’appât et l’analyte devraient s’intégrer dans d’autres modèles d’ajustement. Les données de ce logiciel peuvent être exportées vers d’autres logiciels de traçage et s’intégrer dans les modèles d’ajustement requis.
    5. Ensuite, sélectionnez Analyser. Cela calculera les valeurs KD, ka/kd (Tableau 2). L’erreur ka et kd à moins de 10 % de la valeur est généralement considérée comme acceptable.
      REMARQUE : Assurez-vous que ces valeurs sont dans des limites raisonnables. Si l’erreur est inférieure à 10 %, cela suggère que l’ajustement des données est fiable pour l’étude des interactions entre molécules biologiques. De plus, la KD (constante de dissociation à l’équilibre) calculée à l’aidede ces valeursk a et k d devrait être suffisamment précise pour la plupart des applications pratiques18.
    6. Pour exporter les données ajustées, cliquez avec le bouton droit de la souris sur le graphique généré à partir des données analysées. Choisissez Exporter les données, puis Texte/Données. Cliquez sur Fichier et Parcourir pour enregistrer les données au format .dat. Ce fichier peut être ouvert dans Microsoft Excel et utilisé dans d’autres logiciels pour le traçage de graphiques.
      REMARQUE : L’ajustement global prend en compte toutes les données de la courbe de liaison au sein du groupe, tandis que l’ajustement local se concentre uniquement sur les paramètres cinétiques pour chaque concentration d’analyte individuelle.

3. Configuration de l’instrument pour exécuter une cinétique avancée

  1. Ouvrez le logiciel et sélectionnez Advanced Kinetics sur le panneau de gauche (Figure supplémentaire 1).
  2. Placez une plaque de 96 puits dans le plateau contenant les biocapteurs. Ajouter 200 μL de tampon BLI dans cinq puits. Placez le plateau de biocapteurs sur la plaque de 96 puits de sorte que cinq biocapteurs plongent dans le puits contenant le tampon.
  3. Sur le logiciel, cliquez sur Hydrater et allumez la minuterie pendant 10 min, ce qui permet au biocapteur unique de s’hydrater pendant au moins 10 min.
  4. Pendant que les biocapteurs s’hydratent, pipetez 250 μL de tampon BLI dans dix tubes à centrifuger noirs de 0,5 mL. Étiquetez-les comme A1 à A5 et D1 à D5.
  5. Remplissez les détails sur le logiciel (Nom : Revêtement du substrat et description du test : RPA-3'Bio-ss-poly (dT)32 : Cinétique avancée).
  6. Entrez la durée de chaque étape (Figure supplémentaire 4). Base de référence initiale (30 s), Charge (120 s), Ligne de base (30 s), Association (120 s), Dissociation (120 s). Ajustez les paramètres d’exécution selon vos besoins (Tableau 1).
    1. Remplissez les détails sur le logiciel (Concentration : 0 nM, Poids moléculaire : 116 kDa) et appuyez sur Calc.
  7. Placez le tube A1 dans le support de tube et fixez le biocapteur. Faites glisser le support de tube sous le biocapteur et appuyez sur Exécuter pour obtenir la ligne de base initiale.
  8. Ajoutez 4 μL de substrat de 12,5 nM dans le support de goutte et glissez-le sous le biocapteur. Fermez le couvercle. Cela chargera le substrat sur le biocapteur. Remplacez A1 par D1 dans le support de tube et glissez-le sous le biocapteur. Cela donnera la courbe de base.
  9. Nettoyez le support de goutte avec une lingette non pelucheuse et chargez 4 μL de tampon BLI. Glissez-le sous le biocapteur et fermez le couvercle. Il s’agira de la concentration en protéines de 0 nM et servira de courbe de référence.
  10. Une fois l’étape d’association terminée, glissez le tube D2 sous le biocapteur. Procédez à l’étape de dissociation. Permettre à la dissociation de se compléter.
  11. Détachez le biocapteur, retirez le D2 du support de tube et nettoyez le support de goutte avec une lingette non pelucheuse.
  12. Entrez les détails (concentration : 5 nM, poids moléculaire : 116 kDa) pour le prochain cycle et appuyez sur Calc.
  13. Fixez le deuxième biocapteur au système BLItz, placez le tube A2 dans le support de tube et glissez-le sous le biocapteur.
  14. Après avoir établi la ligne de base initiale, ajoutez 4 μL de substrat de 12,5 nM dans le support de goutte. Glissez-le sous le biocapteur et fermez le couvercle. Remplacez le tube A2 par le tube D3 et glissez-le sous le biocapteur. Ensuite, ajoutez 4 μL de 10 nM de RPA dans le support de tube et glissez-le sous le biocapteur.
  15. Après l’association, glisser D4 sous le biocapteur pour la dissociation.
  16. Répéter les étapes 3.1.12 à 3.1.15 pour les trois concentrations suivantes d’APR (10 nM, 20 nM, 40 nM). Les courbes de liaison pour ces concentrations sont illustrées à la figure 5.
  17. L’analyse des données et la valeur KD peuvent être ajustées dans la même procédure que la cinétique de base du BLI (étape 2.5, tableau 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Dans le BLI, la lumière blanche est réfléchie par l’interface de la biocouche/tampon et l’interface de référence interne vers le spectromètre. Le motif d’interférence qui en résulte est enregistré, et le décalage spectral est mesuré sur une période de temps et représenté sous forme de courbes de liaison en nm. La figure 1 montre une figure représentative montrant l’extrémité du biocapteur avec et sans liaison à l’analyte et le dé...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

La capacité d’analyser la cinétique de liaison de n’importe quelle protéine à son substrat à l’aide de BLI permet d’isoler et de caractériser les facteurs spécifiques (tels que la séquence, la structure ou la longueur d’un ADN) régissant les interactions protéine-ADN au sein de la cellule19. Le système Octet N1, qui s’appuie sur les principes de l’interférométrie des biocouches, permet de mesurer quantitativement les interactions protéi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Ce travail a été financé par des subventions de la National Science Foundation (1929346) et de l’American Cancer Society (RSG-21-028-01). Nous tenons également à remercier les membres du laboratoire Balakrishnan pour les discussions utiles.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 mL Micro Centrifuge TubesGlobe Scientific111554A
96 Well Standard Black MicroplateDot Scientific4ti-0223
Biotinylated poly dT OligonucleotideIDT
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153-10G
Dithiothreitol (DTT)Dot ScientificDSD11000-10
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Dot ScientificDSE57020-500
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-500
Kimtec Science Kimwipes Kimtech34120
Octet N1 SoftwareSartorius 1.4.0.13
Octet SA Biosensor Sartorius 18-5019
PBS pH 7.2 (10x)Gibco1666711
Personal Assay Octet N1 SystemSartorius 
Phosphoric Acid Ward's Science470302-024
Sodium Chloride (NaCl)Dot ScientificDSS23020-5000
Tris BaseDot ScientificDST60040-5000
Tween20 Bio-Rad170-6531

Références

  1. Kalodimos, C. G., et al. Structure and flexibility adaptation in non-specific and specific protein-DNA complexes. Science. 305 (5682), 386-389 (2004).
  2. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9 (23), 6505-6525 (1981).
  3. Lane, D., Prentki, P., Chandler, M. Use of gel retardation to analyze protein-nucleic acid interactions. Microbiol Rev. 56 (4), 509-528 (1992).
  4. Dyer, R. B., Herzog, N. K. Immunodepletion EMSA: A novel method to identify proteins in a protein-DNA complex. Nucleic Acids Res. 23 (16), 3345-3346 (1995).
  5. Dudley, R. K. A laboratory guide to in vitro studies of protein-DNA interactions. FEBS Lett. 306, 2-3 (1991).
  6. Tsai, C., Smider, V., Hwang, B. J., Chu, G. Electrophoretic mobility shift assays for protein-DNA complexes involved in DNA repair. Methods Mol Biol. 920, 53-78 (2012).
  7. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).
  8. Heffler, M. A., Walters, R. D., Kugel, J. F. Using electrophoretic mobility shift assays to measure equilibrium dissociation constants: GAL4-p53 binding DNA as a model system. Biochem Mol Biol Educ. 40 (6), 383-387 (2012).
  9. Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. J Vis Exp. (84), e51383(2014).
  10. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J Pharm Biomed Anal. 72, 150-154 (2013).
  11. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
  12. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).
  13. Schasfoort, R. B. M., Tudos, A. J. Handbook of surface plasmon resonance. , RSC Pub. (2008).
  14. Douzi, B. Surface plasmon resonance: A sensitive tool to study protein-protein interactions. Methods Mol Biol. 2715, 363-382 (2024).
  15. Douzi, B. Protein-protein interactions: Surface plasmon resonance. Methods Mol Biol. 1615, 257-275 (2017).
  16. Drescher, D. G., Selvakumar, D., Drescher, M. J. Analysis of protein interactions by surface plasmon resonance. Adv Protein Chem Struct Biol. 110, 1-30 (2018).
  17. Martin, S. R., Ramos, A., Masino, L. Biolayer interferometry: Protein-RNA interactions. Methods Mol Biol. 2263, 351-368 (2021).
  18. Apiyo, D. Biomolecular binding kinetics assays on the Octet BLI platform. , https://www.sartorius.com/resource/blob/742330/05671fe2de45d16bd72b8078ac28980d/octet-biomolecular-binding-kinetics-application-note-4014-en-1--data.pdf (2022).
  19. Barrows, J. K., Van Dyke, M. W. Biolayer interferometry for DNA-protein interactions. PLoS One. 17 (2), e0263322(2022).
  20. Desai, M., Di, R., Fan, H. Application of biolayer interferometry (BLI) for studying protein-protein interactions in transcription. J Vis Exp. (149), e59687(2019).
  21. Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic acid interactions by biolayer interferometry. Curr Protoc Protein Sci. 79, 19.25.1-19.25.26 (2015).
  22. Petersen, R. L. Strategies using bio-layer interferometry biosensor technology for vaccine research and development. Biosensors (Basel). 7 (4), 49(2017).
  23. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization. Comb Chem High Throughput Screen. 12 (8), 791-800 (2009).
  24. Wold, M. S. Replication protein A: A heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism. Annu Rev Biochem. 66, 61-92 (1997).
  25. Qureshi, M. H., Ray, S., Sewell, A. L., Basu, S., Balci, H. Replication protein A unfolds G-quadruplex structures with varying degrees of efficiency. J Phys Chem B. 116 (19), 5588-5594 (2012).
  26. Wold, M. S., Kelly, T. Purification and characterization of replication protein A, a cellular protein required for in vitro replication of simian virus 40 DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (8), 2523-2527 (1988).
  27. Bochkareva, E., Korolev, S., Lees-Miller, S. P., Bochkarev, A. Structure of the RPA trimerization core and its role in the multistep DNA-binding mechanism of RPA. EMBO J. 21 (7), 1855-1863 (2002).
  28. Brosey, C. A., et al. NMR analysis of the architecture and functional remodeling of a modular multidomain protein, RPA. J Am Chem Soc. 131 (18), 6346-6347 (2009).
  29. Fanning, E., Klimovich, V., Nager, A. R. A dynamic model for replication protein A (RPA) function in DNA processing pathways. Nucleic Acids Res. 34 (15), 4126-4137 (2006).
  30. Gibb, B., et al. Protein dynamics during presynaptic-complex assembly on individual single-stranded DNA molecules. Nat Struct Mol Biol. 21 (10), 893-900 (2014).
  31. Nguyen, B., et al. Diffusion of human replication protein A along single-stranded DNA. J Mol Biol. 426 (19), 3246-3261 (2014).
  32. Brosey, C. A., et al. Functional dynamics in replication protein A DNA binding and protein recruitment domains. Structure. 23 (6), 1028-1038 (2015).
  33. Chen, R., Subramanyam, S., Elcock, A. H., Spies, M., Wold, M. S. Dynamic binding of replication protein a is required for DNA repair. Nucleic Acids Res. 44 (12), 5758-5772 (2016).
  34. Kemmerich, F. E., et al. Force regulated dynamics of RPA on a DNA fork. Nucleic Acids Res. 44 (12), 5837-5848 (2016).
  35. Pokhrel, N., et al. Dynamics and selective remodeling of the DNA-binding domains of RPA. Nat Struct Mol Biol. 26 (2), 129-136 (2019).
  36. Wang, Q. M., et al. Human replication protein A induces dynamic changes in single-stranded DNA and RNA structures. J Biol Chem. 294 (38), 13915-13927 (2019).
  37. Wyka, I. M., Dhar, K., Binz, S. K., Wold, M. S. Replication protein A interactions with DNA: Differential binding of the core domains and analysis of the DNA interaction surface. Biochemistry. 42 (44), 12909-12918 (2003).
  38. Kim, C., Snyder, R. O., Wold, M. S. Binding properties of replication protein A from human and yeast cells. Mol Cell Biol. 12 (7), 3050-3059 (1992).
  39. Caldwell, C. C., Spies, M. Dynamic elements of replication protein A at the crossroads of DNA replication, recombination, and repair. Crit Rev Biochem Mol Biol. 55 (5), 482-507 (2020).
  40. Mishra, A. K., Dormi, S. S., Turchi, A. M., Woods, D. S., Turchi, J. J. Chemical inhibitor targeting the replication protein A-DNA interaction increases the efficacy of Pt-based chemotherapy in lung and ovarian cancer. Biochem Pharmacol. 93 (1), 25-33 (2015).
  41. Gavande, N. S., et al. Structure-guided optimization of replication Protein A (RPA)-DNA interaction inhibitors. ACS Med Chem Lett. 11 (6), 1118-1124 (2020).
  42. Ana Jug, T. B., Janez Ilaš, Biolayer interferometry and its applications in drug discovery and development. TrAC Trends Anal Chem. 176, 117741(2024).
  43. Gator Bio, I. Using BLI for viral and lipid-based vector analytics. , News Medical. https://www.news-medical.net/whitepaper/20230322/Using-BLI-for-viral-and-lipid-based-vector-analytics.aspx (2023).
  44. Noy-Porat, T., et al. Characterization of antibody-antigen interactions using biolayer interferometry. STAR Protoc. 2 (4), 100836(2021).
  45. Onyekachi Ononye, S. S., et al. Biochemical impact of p300-mediated acetylation of replication protein A: Implications for DNA metabolic pathway choice. bioRxiv. , (2024).
  46. Weeramange, C. J., Fairlamb, M. S., Singh, D., Fenton, A. W., Swint-Kruse, L. The strengths and limitations of using biolayer interferometry to monitor equilibrium titrations of biomolecules. Protein Sci. 29 (4), 1018-1034 (2020).
  47. Artem Stetsenko, A. G. An Overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization. Crystals. 7 (7), 197(2017).
  48. Hubbe, M. A., Szlek, D. B., Vera, R. E. Detergency mechanisms and cellulosic surfaces: A review. BioResources. 17 (4), 7167-7249 (2022).
  49. Renee Tobias, S. K., Apiyo, A. Research the Industry Standard for Label-Free of Biomolecular Interactions Analysis (BIA). , https://www.sartorius.com/en/products/biolayer-interferometry/bli-resources (2021).
  50. Octet NTA Biosensor Kinetic Assays. , Sartorius. https://www.sartorius.com/resource/blob/552398/b27ccc2fdfde7a9320909572ced3f6a1/ni-nta-biosensor-kinetic-assays-technical-note-en-sartorius-data.pdf (2024).
  51. Application Guides: Kinetics and affinity measurements with Biacore systems. , Cytiva. Available from: https://cdn.cytivalifesciences.com/api/public/content/digi-33042-pdf (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Réimpressions et Autorisations

Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demande d’autorisation

Explorer plus d’articles

Biochimienum ro 215cin tique BLIinterf rom trie des biocouchesinteractions prot ine ADNconstante de dissociationassociationcin tique de basecin tique avanc e

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Contactez-nous

RECOMMANDER À LA BIBLIOTHÈQUE

NEWSLETTERS JoVE

Recherche

Enseignement

Auteurs

Bibliothécaires

À PROPOS DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.