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요약

이 논문에서는 스트렙타비딘 기반 생물층 간섭계(BLI) 시스템을 사용하여 DNA-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 상호 작용의 평형 결합 친화도(KD)를 결정하기 위해 기본 또는 고급 결합 역학을 활용하기 위한 필수 단계와 고려 사항을 간략하게 설명합니다.

초록

단백질과 DNA의 상호작용은 필수적인 세포 과정을 뒷받침합니다. 이러한 상호 작용을 이해하는 것은 다양한 경로의 분자 메커니즘을 설명하는 데 중요합니다. DNA 분자의 구조, 염기서열 및 길이와 같은 핵심 요인은 단백질 결합에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. BLI(Bio-layer interferometry)는 분자 간의 결합 역학을 측정하는 무표지 기법으로, 단백질-DNA 상호 작용을 정량적으로 연구하기 위한 간단하고 정밀한 접근 방식을 제공합니다. 기존 겔 기반 방법에 비해 BLI의 주요 장점은 결합 역학에 대한 실시간 데이터를 제공하여 동적 단백질-DNA 상호 작용에 대한 평형 해리 상수(KD)를 정확하게 측정할 수 있다는 것입니다. 이 논문은 DNA 복제 단백질, 복제 단백질 A(RPA) 및 단일 가닥 DNA(ssDNA) 기질 간의 상호 작용에 대한 KD 값을 결정하기 위한 기본 프로토콜을 제시합니다. RPA는 친화도가 높은 ssDNA와 결합하지만 생물학적 경로 내에서 후속 단백질 상호 작용을 촉진하기 위해 쉽게 치환되어야 합니다. 설명된 BLI 분석에서 비오틴화된 ssDNA는 스트렙타비딘으로 코팅된 바이오센서에 고정됩니다. 그런 다음 RPA와 바이오센서 결합 DNA의 결합 동역학(association and dissociation)을 측정합니다. 결과 데이터는 시스템 소프트웨어를 사용하여 연관 속도 상수(ka), 해리 속도 상수(kd) 및 평형 결합 상수(KD)에 대한 정확한 값을 도출하기 위해 분석됩니다.

서문

세포 단백질은 살아있는 유기체 내에서 발생하는 복잡한 생물학적 과정을 조율하는 데 중추적인 역할을 합니다. 이러한 경로의 최적 기능은 파트너 단백질 및 핵산과의 상호 작용을 포함하여 단백질과 세포 내부의 다른 생체 분자 간의 상호 작용에 따라 달라집니다1. 따라서 세포 과정의 복잡성을 이해하려면 단백질-핵산 상호 작용의 역학에 대한 깊은 이해가 필요합니다.

전통적으로 단백질-핵산 상호 작용은 전기영동 이동성 겔 이동 분석법(EMSA)2을 사용하여 연구되었습니다. 이 분석실험에서는, 단백질은 짧은 기간 동안 합성 oligonucleotides (특정 길이 또는 순서를 포함하는 DNA/RNA)로 배양되고, 그 후에 반응은 천연 polyacrylamide (PAGE) 젤 3,4,5에 전기이동동됩니다. 단백질-올리고뉴클레오티드 상호작용을 시각화할 수 있도록 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 32P로 방사성 표지되거나 형광 분자로 표지됩니다. 단백질이 올리고뉴클레오티드와 상호 작용하고 결합하는 경우, 단백질의 결합은 겔 6,7 내에서 핵산의 이동성을 늦춥니다. 따라서, 이 방법은 겔 시프트(gel shift) 또는 겔 지연 분석(gel retardation assay)이라고도 불린다. 이 방법은 광범위하게 사용되어 왔지만, 이 방법을 사용하여 KD 값을 얻는 동안 약하거나 동적 결합으로 인한 낮은 분리능, 상당히 높은 농도의 단백질에 대한 요구 사항 및 더 많은 노력을 포함하여 고려해야 할 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 또한 EMSA는 실시간 분석이 아니므로 결합 역학 7,8을 정확하게 측정할 수 없습니다.

이러한 한계를 극복하기 위해 SPR(Surface Plasmon Resonance) 및 BLI(Biolayer Interferometry)와 같은 혁신적인 기술이 등장했습니다 9,10,11,12. 두 방법 모두 label-free 방식으로 분자 간의 association/dissociation rate constants 및 affinity constants를 측정합니다. 단백질에 태그를 붙일 필요가 없기 때문에 이러한 기술은 단백질의 특성을 변경하거나 결합 부위를 차단할 위험을 제거합니다. SPR에서 편광은 센서(금속 전도 필름, 일반적으로 금)와 상호 작용하여 플라즈몬이라고 하는 전자 전하 밀도 파동을 생성합니다. 이 상호 작용은 반사된 빔의 강도를 감소시키고 검출기는 공명각13으로 알려진 특정 각도의 변화를 측정합니다. 리간드(핵산) - 분석물(단백질) 상호 작용을 연구하기 위해 리간드는 센서 칩의 하나의 플로우 셀에 고정되고 분석물은 고정된 리간드를 포함하는 플로우 셀에 주입됩니다. 분석물을 리간드에 결합할 때 센서 표면 근처의 굴절률에 감지 가능한 변화가 있어 분자 상호 작용 14,15,16을 측정할 수 있습니다.

BLI(Bio-Layer Interferometry)는 빛이 바이오센서 팁의 하단 표면에 리간드(미끼)와 결합 파트너(분석물)로 구성된 바이오층이 있는 광섬유를 통과할 때 빛 간섭 패턴을 측정합니다. 빛은 팁을 통해 투과되고 생물층의 특성으로 인해 생물층의 양쪽 끝에서 반사됩니다. 생물층 두께는 반사된 빛의 패턴에 영향을 미치는 결합 분자의 수에 비례합니다. 상대 강도 대 곡선의 변화를 비교하여. 파장은 기준 계면과 생물층/완충 계면에서 반사된 빛 사이의 간섭으로 인해 발생하며, 생물층의 두께 변화를 측정할 수 있습니다. 더 많은 분자가 결합하면 더 큰 변화가 발생하므로 BLI는 실시간으로 생체 분자 상호 작용을 연구하기 위한 강력한 도구가 됩니다. 간섭 패턴의 변화는 측정되고 센서그램에서 스펙트럼 이동17,18로 표시됩니다(그림 1A). 결합 상호 작용의 특성은 결합 파트너 19,20,21의 리간드 가변 농도가 결핍된 설정과 같은 적절한 대조군을 사용하여 정확하게 결정할 수 있습니다. SPR과 비교할 때 BLI는 비용 효율적이고 사용자 친화적이므로 광범위한 연구자가 액세스할 수 있습니다. 또한 BLI에 사용된 샘플은 성능 저하 또는 응집이 없는 경우 그대로 유지됩니다. 이를 통해 회수 및 재사용할 수 있으므로 낭비를 최소화할 수 있습니다. BLI 기기는 미세유체역학을 사용하지 않고 작동하므로 유지보수/관리, 막힘 또는 탈기 버퍼의 사용과 같은 유체 시스템의 단점을 제거합니다. 또한 여과되지 않은 단백질 또는 조단백질 샘플로 인한 기기 오염 위험을 최소화합니다.

BLI 실험에서 바이오 층은 바이오 센서에서 미끼 분자를 고정시켜 설정됩니다. 바이오센서의 바이오층은 다양한 태그와 상호 작용할 수 있어 분자(핵산, 단백질, 항체, 바이러스, 소분자 등 포함) 간의 상호 작용을 연구할 수 있습니다.22. 이러한 고정화를 확립하기 위해 비오틴/스트렙타비딘, 6X-His-tag/Ni-NTA, FLAG/anti-FLAG, GST/anti-GST 및 antibody/anti-Fc를 포함한 다양한 포획 전략을 사용할 수 있습니다. 고정된 리간드의 구조와 활성을 유지하는 것은 바이오센서를 선택할 때 매우 중요합니다. 간섭 패턴의 변화는 결합된 분자의 양과 매트릭스(23)의 영향을 받습니다. 단백질-핵산 상호 작용은 스트렙타비딘으로 코팅된 바이오센서에 고정할 수 있는 비오틴화 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 연구됩니다. 고정된 미끼(올리고뉴클레오티드)와 상호 작용할 것으로 예상되는 단백질 샘플은 연관성을 측정하기 위해 결합 완충액에서 특정 기간 동안 올리고뉴클레오티드와 접촉한 후 해리를 측정하기 위해 빈 결합 완충액으로 전환됩니다. 분석물 결합과 결합 곡선의 해당 변화에 대한 개략도는 그림 1B에 나와 있습니다. 또한, 단백질-핵 상호 작용은 단백질(미끼)이 바이오센서에 포착되고 핵산(분석물)과 상호 작용하는 역 고정 경로를 통해 연구할 수도 있습니다.

현재 생물층 간섭계의 원리에 따라 작동하는 여러 기기가 상업적으로 이용 가능합니다. 간단하고 비용 효율적인 기기는 데이터 처리량을 위한 단일 채널을 특징으로 하는 Octet N1 시스템으로 알려져 있습니다. 수동 작동이 필요하고 최소한의 시료량(4μL)을 소비하며 주변 온도 9,23에서 시료 분석을 수행합니다. 이 단일 채널 기기는 10kDa보다 큰 단백질의 결합 효율을 감지하고 마이크로몰(μM)에서 나노몰(nM) 범위11,12의 친화성을 측정할 수 있습니다. 자동 데이터 판독을 위한 2, 8, 16 및 96 채널이 있는 일부 기기도 사용할 수 있으며 96 또는 384 웰 형식19,20과 모두 호환됩니다. 이러한 기기 중 일부는 4 ° C에서 40 ° C 사이에서 작동하고, 분자량이 150 Da만큼 낮은 생체 분자를 감지하고, 밀리 몰에서 피코 몰 범위19,21 이내의 친화력을 측정 할 수 있습니다. 설명된 시스템은 비용 효율적이지만 여러 채널이 있는 더 비싼 기기는 고처리량 자동 처리를 제공합니다. 이러한 첨단 시스템은 일반적으로 생물학적 약물 분자를 특성화하고 개발하는 데 사용됩니다 9,23.

현재 프로토콜은 단일 채널, 수동 생물층 간섭계 시스템을 사용하여 복제 단백질 A(RPA)와 단일 가닥 DNA(ss-DNA)의 결합 매개변수를 측정하는 단계를 설명합니다. RPA는 DNA 복제, 복구 및 재조합을 포함하여 DNA 대사의 거의 모든 측면에서 중요한 역할을 하는 이질삼합체 ssDNA 결합 단백질 복합체입니다24. ssDNA에 대한 높은 친화력(sub-nanomolar 범위로 측정됨)으로 인해 다양한 DNA 거래 중에 생성된 ssDNA에 빠르게 결합하고 핵분해로부터 보호하며 다른 다운스트림 단백질의 즉석 결합을 방지할 수 있습니다. RPA는 또한 G-quadruplexes25와 같은 비표준 2차 및 3차 구조의 형성을 방지하는 데 중요한 역할을 합니다. 인간 RPA는 RPA70(70kDa), RPA32(32kDa) 및 RPA14(14kDa)의 세 가지 하위 단위로 구성되며 각각 RPA 1, RPA 2 및 RPA 3이라고도 합니다 24,26,27. 이 소단위체에는 A에서 F로 표시된 6개의 올리고뉴클레오티드/올리고당 결합 주름(OB-folds)이 있습니다. 이 중 DNA 결합 도메인(DBD)은 RPA1(DBD-A, DBD-B, DBD-C) 및 RPA2(DBD-D) 서브유닛(28)에 있습니다. 처음에는 DNA의 길이에 따라 RPA가 특정 DNA 길이에 서로 다른 DBD가 결합되는 다른 결합 모드를 나타낸다고 생각했다29. 최근의 구조 및 단일 분자 연구의 데이터는 RPA의 서로 다른 DBD의 결합이 처음에 제안된 것보다 더 동적임을 시사하기 위해 이러한 모델을 개선하는 데 도움이 되었습니다 30,31,32,33,34,35,36. RPA는 특정 DNA 거래 중에 DNA 기질에 단단히 결합할 수 있어야 하기 때문에 동적 결합 속성의 이러한 기능은 RPA의 기능에 필수적입니다. 그러나, 생물학적 과정 중에 기질을 다음 단백질로 넘겨주기 위해 기질에서 변위할 수도 있어야 합니다. 다양한 생화학 기술을 사용하여 RPA에 대한 KD는 형광 편광 이방성(FPA)37,38에 의해 측정된 바와 같이 ss-(polydT)30 기판의 경우 약 0.4nM, ss-(polydA)257 및 dG-(polydG)602 기판의 경우 각각 80nM 및 200nM으로 결정되었습니다. RPA는 또한 퓨린에 비해 피리미딘이 풍부한 염기서열에 결합하는 선호도가 약 50배 더 높은 것으로 나타났습니다. 서로 다른 생화학적 기술에 따라 RPA에 대한 KD 측정치가 달라졌지만 모든 측정은 나노몰 범위였으며 이는 ssDNA에 대한 RPA의 높은 결합 친화도를 시사합니다. 전반사 형광 현미경(TIRFM)을 사용하여 DNA의 길이를 기반으로 RPA가 적어도 두 가지 결합 모드와 관련이 있음이 발견되었습니다: 하나는 빠른 해리(Kd, 680 pM)와 느린 해리(Kd, 60 pM) 복합체33,39. 거의 모든 DNA 대사 경로에 중추적인 역할을 한다는 점을 감안할 때 RPA와 단일 가닥 DNA(ssDNA) 간의 상호 작용을 방해할 수 있는 억제제를 만드는 데 관심이 높아졌습니다. 이러한 화학 억제제는 DNA 손상 반응을 방해하는 데 필수적이며, 암세포를 임상 치료에 사용되는 DNA 손상 물질에 더 취약하게 만듭니다. BLI 분석을 활용하면 RPA의 결합 기능을 조절하는 억제제 효능에 대한 정확한 정량적 평가가 가능합니다40,41.

BLI 설정은 기본 및 고급 운동학과 같은 고유한 설정을 허용합니다. basic kinetics 모드에서 분석은 baseline establishment, association 및 dissociation의 세 가지 기본 단계로 구성됩니다. 그러나 이 분석을 수행하기 전에 기기를 사용하거나 실험실 벤치에서 수동으로 바이오센서를 별도로 코팅해야 합니다. 반대로, 고급 키네틱스 모드는 기본 3단계를 넘어 확장되어 추가 단계를 통합할 수 있습니다. 이러한 보조 단계는 완충액 변경에 대한 바이오센서의 컨디셔닝 또는 후속 단백질 상호 작용의 검출을 용이하게 하는 것과 같은 다양한 목적으로 사용될 수 있습니다. Advanced kinetics는 또한 미끼와 바이오센서가 손상되지 않은 상태로 유지되는 경우 잠재적인 재사용을 위한 우수한 재생 방법으로 분석물의 바이오센서를 벗겨낼 수 있습니다. 일반적으로 고급 동역학은 분석에 여러 단계가 포함되거나 분석이 더 복잡한 형식으로 수행되어야 하는 경우 기본 역학보다 사용됩니다.

이 프로토콜은 동일한 미끼[3'Bio-ss-poly(dT)32]와 분석물(RPA)을 사용하는 두 가지 방법을 모두 간략하게 설명합니다. 스트렙타비딘으로 코팅된 바이오센서를 사용하여 미끼를 고정하고 분석물에 대한 KD 측정값을 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 단일 채널 기기 바이오층 간섭계를 사용하여 BLI 분석을 수행하는 완전한 접근 방식을 설명하며, 바이오센서 미끼 준비, 완충액 고려 사항 및 절차의 단계별 개요를 다룹니다.

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프로토콜

연구에 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 미끼, 분석물, 완충액 및 드롭 홀더 세척 준비

  1. 기기 설정: 실험을 시작하기 최소 1시간 전에 기기를 켜십시오. 이것은 l을 허용합니다amp 예열됩니다.
  2. 스트리핑 및 세척 버퍼의 준비
    1. 스트리핑 버퍼: 0.15m 인산[pH 2.0]) 50mL를 준비합니다.
    2. 세척 버퍼: 0.5N HCl 10mL를 준비합니다.
  3. BLI 버퍼의 준비
    1. 50mL의 1x BLI 완충액(50mM Tris pH 7.5, 1mM EDTA, 100mM NaCl, 0.1mg/mL BSA, 1mM DTT, 0.05% Tween 20)을 준비합니다. 이 버퍼는 4°C에서 보관하십시오. 이 분석을 설정하기 전에 버퍼를 실온으로 가져옵니다.
      참고: 노화된 완충액은 pH 변경 또는 응집체 형성을 겪을 수 있고 미생물 오염이 있을 수 있으므로 결과의 재현성과 정확성을 손상시킬 수 있으므로 분석을 위해 새로운 완충액을 준비하는 것이 좋습니다. 2주 이상 저장된 버퍼는 사용하지 않는 것이 좋습니다.
  4. 미끼/기질의 준비
    1. BLI 버퍼를 사용하여 12.5 nM의 3'Bio-ss-poly (dT)32 기질(5', TTT TTT TTT 3'Bio)을 준비합니다.
  5. 단백질 농축 원료의 준비
    1. BLI 버퍼를 사용하여 4가지 농도의 RPA(5nM, 10nM, 20nM, 40nM)를 준비합니다. 단백질의 최고 농도(40nM)는 BLI 완충액에서 스톡 단백질을 희석하여 얻습니다. 후속 희석은 40nM 작업 용액의 연속 희석에 의해 준비됩니다. 안정성을 유지하기 위해 실험 내내 모든 단백질 스톡을 얼음 위에 보관하십시오.
  6. 드롭 홀더 청소
    1. 증류수 4μL를 넣고 보풀이 없는 천으로 드롭 홀더를 청소합니다(3회 반복). 그런 다음 4μL의 70% 에탄올로 이 단계를 반복하고 보푸라기가 없는 천으로 닦습니다. 이 단계는 표면 오염 물질과 먼지 입자를 제거합니다.
    2. 4μL의 0.5N HCl을 넣고 드롭 홀더에 1분 동안 그대로 둡니다. 보푸라기가 없는 천으로 닦고 이 단계를 한 번 더 반복하십시오. 이렇게 하면 드롭 홀더를 철저히 청소할 수 있습니다. 딥 클리닝은 이전 사용으로 건조된 방울의 드롭 홀더를 청소하는 데 특히 유용합니다.
    3. 11단계를 반복하여 드롭 홀더를 증류수와 70% 에탄올로 세척하고 보푸라기가 없는 물티슈로 물기를 닦아냅니다. 이제 드롭 홀더를 사용할 준비가 되었습니다.

2. 기본 동역학

  1. 기기 및 소프트웨어 설정
    1. 소프트웨어를 열고 왼쪽 패널에서 Basic Kinetics 를 선택합니다(보충 그림 1).
    2. 트레이에서 바이오센서 랙을 제거하고(상용 소스에서 입수) 트레이에 96웰 플레이트를 놓습니다. 첫 번째 웰에 200μL의 BLI 버퍼를 추가합니다. 다음으로, 바이오센서 트레이를 96웰 플레이트 위에 다시 배치하여 각 바이오센서가 해당 웰에 삽입되도록 합니다. 이제 첫 번째 바이오센서는 첫 번째 웰의 BLI 완충액에 잠겨야 합니다.
    3. 소프트웨어에서 Hydrate(수화) 를 클릭하고 타이머를 10분 동안 켜서 단일 바이오센서가 최소 10분 동안 수분을 공급하도록 합니다. 이 단계는 바이오센서를 수화하여 BLI 분석을 준비합니다.
    4. 바이오센서가 수화되는 동안 250μL의 BLI 버퍼를 두 개의 0.5mL 튜브에 피펫팅합니다. 하나는 "A"(연관)로, 다른 하나는 "D"(해리)로 레이블을 지정합니다.
    5. 소프트웨어에 대한 세부 정보를 입력합니다(이름: 기판 코팅 및 분석 설명: RPA- 3'Bio-ss-poly (dT)32: Basic Kinetics).
    6. 각 단계에 대한 실행 설정을 조정합니다: 기준선(30초), 연결(120초), 해리(120초)(표 1). 튜브와 드롭 홀더를 위해 셰이커를 켜두십시오. 셰이커 속도는 2200rpm(범위, 1000–2600rpm)으로 설정되어 바이오센서 표면 근처의 제한된 확산으로 인한 질량 수송 효과를 방지합니다.
      참고: 결합 역학 분석을 설정할 때 각 단계(기준선, 로딩, 연관, 해리)의 지속 시간을 최적화하여 데이터 수집을 개선하는 것이 좋습니다.
  2. 기준선 곡선 설정
    1. 튜브 홀더에 튜브 A를 놓고 수화 바이오센서를 BLI 시스템에 부착합니다. 튜브 홀더를 바이오센서 아래로 밉니다(위치 A, 그림 2).
      알림: 바이오센서는 실험 중 어느 때에도 완전히 건조되어서는 안 됩니다. 건조된 상태로 두면 실험 판독값이 크게 왜곡될 수 있습니다.
    2. 실행을 누르고 프롬프트 메시지의 지침을 따릅니다.
    3. 초기 기준선을 완료한 후 뚜껑을 열고 드롭 홀더에 4μL의 BLI 버퍼를 추가합니다. 동일한 바이오센서 아래의 오른쪽으로 밉니다(위치 B, 그림 2). 덮개를 닫고 소프트웨어에서 BLI 곡선을 모니터링합니다(그림 3, 파란색 곡선).
    4. 완료 후 뚜껑을 열어 튜브 'A'를 'D'로 교체하고 바이오센서 아래로 밀어 넣습니다(위치 A, 그림 2). 뚜껑을 닫고 해리 단계를 진행합니다. 완료 후 뚜껑을 열고 바이오센서를 분리한 후 트레이에 다시 넣고 바이오센서가 BLI 버퍼에 담갔는지 확인합니다.
    5. 샘플/버퍼를 제거하고, 보푸라기가 없는 물티슈로 건조하기 전에 버퍼로 드롭 홀더를 청소하고 튜브 홀더에서 튜브 'D'를 제거합니다.
  3. 기판 코팅
    1. 튜브 홀더에 튜브 A를 놓고 수화 바이오센서를 BLI 시스템에 부착합니다. 튜브 홀더를 바이오센서 아래로 밀어 넣고 실행을 누릅니다 .
    2. 초기 기준선 단계 후 4μL의 12.5nM 기판[3'Bio-ss-poly(dT)32]을 드롭 홀더에 추가하고 바이오센서 아래로 밀어 넣습니다. 덮개를 닫고 소프트웨어에서 BLI 곡선을 모니터링합니다. 이 응답이 기준선보다 높은지 확인합니다(그림 3).
      참고: 기질 농도는 다양한 농도(바이오센서당 하나의 농도만)로 바이오센서를 코팅하고 결합 곡선을 관찰하여 최적화할 수 있습니다. 기준선에 비해 신호가 눈에 띄게 높은 결합 곡선은 기판 코팅을 확인하기에 충분합니다. 바이오센서에 과부하가 걸리면 표면에 입체적 방해 또는 밀집이 발생할 수 있습니다. 그림 3은 5가지 농도의 biotinylated 3'Bio-ss-poly (dT)32 기질에 대한 곡선을 보여줍니다. 또한 미끼 로딩 단계가 완료된 후 바이오센서를 스트렙타비딘 차단 완충액(바이오사이틴)에 30초 동안 담근 다음 BLI 완충액에서 세척할 수 있습니다. 이렇게 하면 결합되지 않은 스트렙타비딘 표면이 차단되고 비특이적 결합이 방지됩니다.
    3. 연결 단계를 완료한 후 뚜껑을 열고 튜브 'A'를 튜브 'D'로 교체합니다. 바이오센서 아래로 밀어 넣고 뚜껑을 닫습니다.
    4. 해리 단계가 완료된 후 뚜껑을 열고 바이오센서를 분리한 다음 BLI 버퍼가 들어 있는 바이오센서 트레이에 넣습니다. 바이오센서가 완충액에 완전히 담근 상태에서 다음 단계를 위해 적절하게 수화되었는지 확인합니다. 분석 버퍼로 드롭 홀더를 청소하고 보푸라기가 없는 물티슈로 건조시킨 다음 튜브 홀더에서 튜브 'D'를 제거합니다. 바이오센서는 이제 3'Bio-ss-poly(dT)32 기판으로 코팅되었습니다.
  4. 단백질 결합
    1. 250μL의 BLI 버퍼를 0.5mL 검은색 마이크로분리 튜브 10개에 피펫팅합니다. A1에서 A5까지, D1에서 D5까지 레이블을 지정합니다.
    2. 다른 96웰 플레이트에서 수화된 바이오센서의 위치에 따라 200μL의 스트리핑 버퍼를 웰에 추가합니다.
    3. 분석을 시작하기 전에 BLI 버퍼로 드롭 홀더를 3번 청소합니다.
    4. 소프트웨어에서 새 파일을 열고 왼쪽 패널에서 Basic Kinetics 를 선택합니다. 분석의 이름을 지정하고 필요에 따라 설명을 추가합니다(보충 그림 2). 필요에 따라 실행 설정을 조정합니다(표 1).
    5. A1이라고 표시된 튜브를 튜브 홀더에 넣고 3'Bio-ss-poly(dT)32 코팅 바이오센서를 BLI 시스템에 부착합니다. 튜브를 바이오센서 아래로 밀어 넣고 실행을 누르십시오 .
    6. 초기 기준선 단계를 완료한 후 뚜껑을 열고 BLI 버퍼의 4μL를 드롭 홀더에 추가한 다음 바이오센서 아래로 밀어 넣습니다. 이것은 0nM 단백질 농도가 되며 기준 곡선으로 사용됩니다.
    7. 연결 단계를 완료한 후 튜브 A1을 D1으로 교체하고 바이오센서 아래로 밀어 넣습니다.
    8. 해리 단계가 완료되면 바이오센서를 제거하고 트레이에 다시 넣습니다. 바이오센서가 완충액에 완전히 담기고 다음 단계를 위해 적절하게 수화되었는지 확인합니다. 튜브 D1을 제거하고 분석 버퍼로 드롭 홀더를 청소한 다음 보푸라기가 없는 천으로 건조시킵니다.
    9. 다음으로, 5 nM RPA 스톡에 대한 바인딩 곡선을 얻습니다. 샘플 세부 정보(농도: 5nM, 분자량: 116KDa)를 입력하고 Calc를 누릅니다. 이것은 단백질 농도를 μg/μL 단위로 계산합니다.
    10. 3'Bio-ss-poly (dT)32 코팅 바이오센서를 부착하고 튜브 홀더에 튜브 A2를 넣습니다. 바이오센서 아래로 밀어 넣고 실행을 누르십시오.
    11. 기준선 후 드롭 홀더에 4μL의 5nM RPA를 추가하고 바이오센서 아래로 밀어 넣습니다. 뚜껑을 닫고 결합 곡선을 모니터링합니다. 미끼에 대한 단백질 결합은 기준선 곡선보다 높은 곡선으로 시각화할 수 있습니다. 연관 단계가 끝나면 A2를 D2로 교체하고 바이오센서 아래로 밀어 넣고 해리 단계를 완료합니다.
    12. 바이오센서를 제거하고 스트리핑 버퍼에 30초 동안 담근 다음 BLI 버퍼에 3분 동안 담궈냅니다.
      참고: 재생 효율은 고정화된 미끼와 파괴된 분석물에 따라 달라집니다. 일부 고정 바이오센서는 10회 이상의 재생 주기를 견딜 수 있습니다. biotinylated 3'Bio-ss-poly (dT)32 기질을 3회 이상 벗겨낼 수 있었는데(보충 그림 3) 반응에서 눈에 띄는 변화를 관찰하지 못했습니다.
    13. RPA 10nM, 20nM 및 40nM의 다른 세 가지 농도에 대해 2.4.9–2.4.12단계를 반복합니다. 각 농도에 대해 바이오센서를 벗겨내십시오.
      참고: BLI 분석의 경우 전문가들은 정확한 역학측정을 위해 예상 KD의 약 0.1배에서 10배에 이르는 4가지(참조 곡선 제외) 농도를 사용할 것을 권장합니다. 여기서, 4가지 농도는 연속 희석에 의해 얻어졌다.
  5. 데이터 분석 및 KD 값 계산
    1. KD 값을 계산하기 전에 3'Bio-ss-poly(dT)32 기판에 대한 각 RPA 결합 농도에 대한 센서그램을 육안으로 검사해야 합니다. 고정된 DNA가 포화될 때까지 RPA 농도가 증가함에 따라 BLI 신호가 증가하는지 확인합니다(그림 4).
      참고: 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 0nM 분석물 농도를 제외한 최소 4개의 단백질 농도가 기질에 성공적으로 결합되었는지 확인하십시오. 토론 섹션을 참조하여 잠재적인 오류를 해결합니다.
    2. 'Run List' 표에서 참조 곡선으로 사용할 0nM 분석물 농도에 대한 Ref 를 확인합니다. 분석물의 모든 농도에 대해 분석을 선택합니다.
    3. 다음으로, 단계 수정을 위해 연결 시작 과 분리 시작을 모두 선택합니다. 이렇게 하면 연결의 시작이 기준선의 끝과 정렬되고 해리의 시작이 연결의 끝과 정렬되며, 이는 일반적으로 버퍼가 잘 일치하는 경우 드롭 홀더와 튜브 사이의 다른 반사 패턴으로 인해 발생합니다.
    4. 이 분석에 대해 Global Fitting (1:1)을 선택합니다. 글로벌 분석은 전체 단백질 농도 세트에 대한 KD 값을 계산하는 반면, 로컬 분석은 단일 단백질 농도에 대한 것입니다.
      알림: 기기와 함께 제공되는 소프트웨어는 1:1 피팅만 허용합니다. 이는 미끼와 분석물이 다른 피팅 모델에 적합할 것으로 예상되는 경우 잠재적인 주의 사항이 될 수 있습니다. 이 소프트웨어의 데이터는 다른 플로팅 소프트웨어로 내보내어 필요한 피팅 모델에 맞출 수 있습니다.
    5. 다음으로, 분석을 선택합니다. 이것은 KD, ka/kd 값을 계산합니다(표 2). 값의 10% 이내의 ka 및 kd 오류는 일반적으로 허용되는 것으로 간주됩니다.
      알림: 이러한 값이 합리적인 한도 내에 있는지 확인하십시오. 오차가 10% 미만이면 생물학적 분자 간의 상호 작용을 연구하는 데 데이터 적합이 신뢰할 수 있음을 시사합니다. 또한, 이러한 ka 및 kd 값을 사용하여 계산된 KD (평형 해리 상수)는 대부분의 실제 응용 프로그램에 대해 충분히 정확해야 합니다18.
    6. 피팅된 데이터를 내보내려면 분석된 데이터를 사용하여 생성된 그래프를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하십시오. Export Data(데이터 내보내기)를 선택한 다음 Text/Data(텍스트/데이터)를 선택합니다. 파일 및 찾아보기 를 클릭하여 데이터를 '.dat' 형식으로 저장합니다. 이 파일은 Microsoft Excel에서 열 수 있으며 그래프 플로팅을 위해 다른 소프트웨어에서 사용할 수 있습니다.
      참고: 글로벌 피팅은 그룹 내의 모든 결합 곡선 데이터를 고려하는 반면, 로컬 피팅은 각 개별 분석물 농도에 대한 운동 매개변수에만 초점을 맞춥니다.

3. 고급 kinetics를 실행하도록 기기 설정

  1. 소프트웨어를 열고 왼쪽 패널에서 Advanced Kinetics 를 선택합니다(보충 그림 1).
  2. 바이오센서가 들어 있는 트레이에 96웰 플레이트를 놓습니다. 5개의 웰에 200μL의 BLI 버퍼를 추가합니다. 바이오센서 트레이를 96웰 플레이트에 올려 5개의 바이오센서가 완충액이 들어 있는 웰에 담가도록 합니다.
  3. 소프트웨어에서 Hydrate(수화) 를 클릭하고 타이머를 10분 동안 켜서 단일 바이오센서가 최소 10분 동안 수분을 공급하도록 합니다.
  4. 바이오센서가 수분을 공급하는 동안 250μL의 BLI 버퍼를 0.5mL 검은색 원심분리 튜브 10개에 피펫팅합니다. A1에서 A5 및 D1에서 D5로 레이블을 지정합니다.
  5. 소프트웨어에 대한 세부 정보를 입력합니다(이름: 기판 코팅 및 분석 설명: RPA-3'Bio-ss-poly (dT)32: Advanced Kinetics).
  6. 각 단계의 지속 시간을 입력합니다(보충 그림 4). 초기 기준선(30초), 로드(120초), 기준선(30초), 연결(120초), 해리(120초). 필요에 따라 실행 설정을 조정합니다(표 1).
    1. 소프트웨어에 대한 세부 정보(농도: 0nM, 분자량: 116kDa)를 입력하고 Calc를 누릅니다.
  7. 튜브 홀더에 튜브 A1을 놓고 바이오센서를 부착합니다. 튜브 홀더를 바이오센서 아래로 밀고 Run을 눌러 초기 기준선을 얻습니다.
  8. 4μL의 12.5nM 기판을 드롭 홀더에 추가하고 바이오센서 아래로 밀어 넣습니다. 뚜껑을 닫습니다. 이렇게 하면 기판이 바이오센서에 로드됩니다. 튜브 홀더에서 A1을 D1으로 교체하고 바이오센서 아래로 밀어 넣습니다. 이것은 기준선 곡선을 제공합니다.
  9. 보풀이 없는 천으로 드롭 홀더를 청소하고 BLI 버퍼를 4μL씩 로드합니다. 바이오센서 아래로 밀어 넣고 뚜껑을 닫습니다. 이것은 0nM 단백질 농도가 되며 참조 곡선 역할을 합니다.
  10. 연결 단계를 완료한 후 D2 튜브를 바이오센서 아래로 밉니다. 분리 단계를 진행합니다. 연관 해제가 완료될 때까지 허용합니다.
  11. 바이오센서를 분리하고 튜브 홀더에서 D2를 제거한 다음 보푸라기가 없는 물티슈로 드롭 홀더를 청소합니다.
  12. 다음 실행에 대한 세부 정보(농도: 5nM, 분자량: 116kDa)를 입력하고 Calc를 누릅니다.
  13. 두 번째 바이오센서를 BLItz 시스템에 부착하고 튜브 홀더에 튜브 A2를 놓고 바이오센서 아래로 밀어 넣습니다.
  14. 초기 기준선을 설정한 후 4μL의 12.5nM 기판을 드롭 홀더에 추가합니다. 바이오센서 아래로 밀어 넣고 뚜껑을 닫습니다. 튜브 A2를 D3로 교체하고 바이오센서 아래로 밀어 넣습니다. 다음으로, 10nM 양의 RPA 스톡 4μL를 튜브 홀더에 추가하고 바이오센서 아래로 밀어 넣습니다.
  15. 연결 후 해리를 위해 D4를 바이오센서 아래로 밉니다.
  16. RPA의 후속 세 가지 농도(10nM, 20nM, 40nM)에 대해 3.1.12–3.1.15단계를 반복합니다. 이러한 농도에 대한 결합 곡선은 그림 5에 나와 있습니다.
  17. 데이터 분석및 KD 값은 BLI 기본 역학과 동일한 절차로 맞출 수 있습니다(단계 2.5, 표 2).

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결과

BLI에서 백색광은 생물층/버퍼의 계면 및 분광계에 대한 내부 참조 계면에서 반사됩니다. 결과 간섭 패턴이 기록되고 스펙트럼 이동이 일정 기간 동안 측정되고 nm 단위의 결합 곡선 응답으로 표시됩니다. 분석물 결합이 있거나 없는 바이오센서 팁과 해당 스펙트럼 파장 이동(nm)을 보여주는 대표적인 그림이 그림 1에 나와 있습니다. 결합 곡선은

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토론

BLI를 사용하여 기질에 대한 단백질의 결합 동역학을 분석할 수 있는 능력은 세포 내에서 단백질-DNA 상호 작용을 제어하는 특정 요인(예: DNA의 서열, 구조 또는 길이)을 분리하고 특성화하는 수단을 제공합니다19. 생물층 간섭계의 원리에 의존하는 Octet N1 시스템은 단백질-단백질 및 단백질-핵산 상호 작용의 정량적 측정을 가능하게 합니다. 또한, 지질, 항...

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공개

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 미국 국립과학재단(National Science Foundation, 1929346)과 미국 암 학회(American Cancer Society, RSG-21-028-01)의 보조금으로 지원되었습니다. 또한 유용한 토론을 해주신 Balakrishnan 연구소 구성원들에게도 감사드립니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 mL Micro Centrifuge TubesGlobe Scientific111554A
96 Well Standard Black MicroplateDot Scientific4ti-0223
Biotinylated poly dT OligonucleotideIDT
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153-10G
Dithiothreitol (DTT)Dot ScientificDSD11000-10
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Dot ScientificDSE57020-500
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-500
Kimtec Science Kimwipes Kimtech34120
Octet N1 SoftwareSartorius 1.4.0.13
Octet SA Biosensor Sartorius 18-5019
PBS pH 7.2 (10x)Gibco1666711
Personal Assay Octet N1 SystemSartorius 
Phosphoric Acid Ward's Science470302-024
Sodium Chloride (NaCl)Dot ScientificDSS23020-5000
Tris BaseDot ScientificDST60040-5000
Tween20 Bio-Rad170-6531

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