A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
نقدم طريقة للتعليق التوضيحي القائم على قياس الطيف الكتلي السريع (MS) / قياس الطيف الكتلي (MS) وتصنيف قلويدات التروبان ، وهي مفيدة لكل من التكرار الأولي للعينات المحتوية على التروبان واكتشاف قلويدات جديدة للعزل.
على الرغم من أن العديد من الأدوية المستخدمة اليوم اصطناعية في الأصل ، إلا أن المنتجات الطبيعية لا تزال توفر مصدرا غنيا للتنوع الكيميائي الجديد والنشاط البيولوجي ، ويمكن أن تسفر عن خيوط واعدة للأمراض المقاومة أو الناشئة. ومع ذلك، فإن التحدي ذو شقين: لا يجب على الباحثين العثور على المنتجات الطبيعية وتوضيح هياكلها فحسب، بل يجب عليهم أيضا تحديد ما يستحق العزل والفحص (وما هو معروف بالفعل - وهي عملية تعرف باسم إزالة التكرار). مع ظهور الأجهزة التحليلية الحديثة ، تسارعت وتيرة اكتشاف المنتجات الطبيعية وإلغاء تكرارها. أصبح قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS / MS) تقنية ذات قيمة خاصة لتحديد وتصنيف الهياكل الكيميائية. قلويدات التروبان (TAs) هي مركبات مشتقة من النباتات ذات أهمية طبية وسمية كبيرة. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير سير عمل فحص قائم على LC-MS / MS باستخدام تكوينات MS / MS المتعددة المتاحة على مطياف الكتلة الثلاثي الرباعي (QQQ) للتعليق على هياكل TA وتصنيفها بناء على أنماط التجزئة المميزة الخاصة بها. باستخدام مجموعة من عمليات المسح الأيوني للمنتج المعتمدة على البيانات (DD) ، ومسح أيون السلائف (PrIS) ، ومسح الخسارة المحايدة (NLS) ، قمنا بتطبيق هذه الطريقة على مقتطفات غنية ب TA من الباذنجان Datura stramonium و Datura metel. هذه الطريقة سريعة وحساسة ، وقد تم استخدامها بنجاح لكل من التكرار الأولي للعينات المعقدة المحتوية على TA ولاكتشاف مرشح جديد للعزل والتنقية (والمقايسة الحيوية في نهاية المطاف).
على الرغم من أن الجزيئات الاصطناعية بالكامل أصبحت أكثر بروزا في اكتشاف الأدوية في العقود الأخيرة، إلا أن ما يقرب من ثلثي جميع الأدوية المعتمدة من السنوات ال 39 الماضية هي منتجات طبيعية أو مستوحاة من المنتجات الطبيعية،1،2 مما يؤكد الأهمية المستمرة لأبحاث المنتجات الطبيعية. قلويدات ، بعض المنتجات الطبيعية المحتوية على النيتروجين ، تحظى بتقدير خاص لخصائصها الطبية. قلويدات التروبان (TAs) التي تحتوي على [3.2.1.]- نظام يحتوي على النيتروجين ثنائي الحلقات ، يتم إنتاجه في الغالب بواسطة النباتات في عائلات الباذنجانيات (الباذنجان) ، و Erythroxylaceae ، و Convolvulaceae. ومن ال....
تنبيه: يرجى الرجوع إلى جميع أوراق بيانات سلامة المواد ذات الصلة (MSDS) قبل استخدام المواد الكيميائية المدرجة.
1. إعداد العينة
تنبيه: يمكن أن يسبب النيتروجين السائل حروقا بالتبريد . استخدم قفازات التبريد وحماية العين في منطقة جيدة التهوية. يمكن أن تكون عينات النباتات المحتوية على قلويد مزعجة للجلد. تعامل معهم دائما بالقفازات. الميثانول سام وقابل للاشتعال ويجب التعامل معه في غطاء دخان بعيدا عن مصادر الاشتعال المحتملة.
ملاحظة: من الناحية النظرية ، يمكن استخدام الأنسجة النباتية المزروعة أو البرية (المجففة أو المطحونة طازجة) ؛ الإجراء أدناه ه....
لإثبات فعالية الطريقة ، تم تحليل مزيج قياسي من TAs (10 ميكروغرام / مل لكل من مزيج أسيتيل تروبين / أسيتيل سودوتروبين [أحادي الاستبدال] ، 10 ميكروغرام / مل لكل خليط من اثنين من أيزومرات أنيسودامين [ثنائي الاستبدال] ، جنبا إلى جنب مع هيوسيامين [أحادي الاستبدال] ، ليتورين [أحادي الا?.......
وعلى الرغم من أن بارامترات الأجهزة المنصوص عليها في البروتوكول تسمح بأداء مرض، فإن الاستخدام الناجح لهذه الطريقة قد يتطلب اهتماما دقيقا بعدة خطوات حاسمة أو تحسينها إلى المستوى الأمثل. في حين أن تدرج مذيب HPLC المقدم في الخطوة 2.2 مناسب بشكل عام لقلويدات التروبان ، فقد يحتا?.......
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
تم تمويل هذا العمل من خلال منحة أبحاث أعضاء هيئة التدريس (جامعة ميشيغان الشمالية ، الممنوحة ل MAC) ، وزمالة بحثية جامعية (جامعة شمال ميشيغان ، منحت ل JC) ، وقسم الكيمياء. يود المؤلفون أن يشكروا جون بيرغر (NMU) على المساعدة في تحضير الأنسجة النباتية ، وهانا هوكينز (NMU) على صيانة LC-MS والمساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها ، والدكتور ريان فورنوالد وطلابه CH 495 (تخليق المنتجات الطبيعية) على إعدادهم لمزيج الأسيتيل تروبين. ويود المؤلفون أيضا أن يشكروا الدكتور دانيال جونز (جامعة ولاية ميشيغان) على حصوله على أطياف MS/MS عالية الاستبانة.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acetonitrile, For UHPLC, suitable for mass spectometry | Sigma-Aldrich | 900667 | HPLC solvent |
Argon gas | AirGas | AR UHP300 | CID gas |
Formic acid, 99% for analysis | Thermo Scientific | AC270480010 | HPLC additive |
Guard column holder | Restek | 25812 | |
HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D Plus | Shimadzu | 228-65802-58 | HPLC column |
LCMS, Shimdazu LCMS-8045 | Shimadzu | 225-31800-44 | Mass spectrometer; we ran LabSolutions software, which is standard for Shimadzu instruments |
Liquid nitrogen | AirGas | NI 180LT22 | |
Methanol, for HPLC/UHPLC/LCMS | VWR | BDH 85800.400 | For making extraction solvent |
Microcentrifuge | VWR | 2400-37 | |
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Mortar | Fisher Scientific | FB961C | For grinding plant tissues |
Pestle | Fisher Scientific | FB961M | For grinding plant tissues |
Pipette 1000 mL | Gilson | F144059M | |
Pipette tip 1000 mL | Fisher scientific | 02-707-404 | |
Plant tissues | Various sources | N/A | Can be anything wild or cultivated |
Polypropylene conical tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-4 | |
Polystyrene cooler | ULINE | S-18312 | The type of coolers that reagents for molecular biology are shipped in would be appropriate |
Roc C18 3 µm, 100 mm x 4.6 mm | Restek | 9534315 | HPLC column |
Roc C18, 10 mm x 4 mm | Restek | 953450210 | Guard column |
Rocking shaker | Themo Scientific | 11-676-680 | |
Screw thread vial convenience kit (9 mm) | Fisher scientific | 13-622-190 | LCMS autosampler vials |
Syringe, 3 mL | Fisher Scientific | 03-377-27 | |
Syringe filter 0.45 µm | Avantor/VWR | 76479-008 | |
Water, for use in liquid chromatography and mass spectrometry | JT Baker | 9831-03 | For making extraction solvent |
Water solution, contains 0.1% v/v formic acid, For UHPLC, suitable for mass spectometry | Sigma-Aldrich | 900687-1L | HPLC solvent |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved