A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم طريقة للتعليق التوضيحي القائم على قياس الطيف الكتلي السريع (MS) / قياس الطيف الكتلي (MS) وتصنيف قلويدات التروبان ، وهي مفيدة لكل من التكرار الأولي للعينات المحتوية على التروبان واكتشاف قلويدات جديدة للعزل.

Abstract

على الرغم من أن العديد من الأدوية المستخدمة اليوم اصطناعية في الأصل ، إلا أن المنتجات الطبيعية لا تزال توفر مصدرا غنيا للتنوع الكيميائي الجديد والنشاط البيولوجي ، ويمكن أن تسفر عن خيوط واعدة للأمراض المقاومة أو الناشئة. ومع ذلك، فإن التحدي ذو شقين: لا يجب على الباحثين العثور على المنتجات الطبيعية وتوضيح هياكلها فحسب، بل يجب عليهم أيضا تحديد ما يستحق العزل والفحص (وما هو معروف بالفعل - وهي عملية تعرف باسم إزالة التكرار). مع ظهور الأجهزة التحليلية الحديثة ، تسارعت وتيرة اكتشاف المنتجات الطبيعية وإلغاء تكرارها. أصبح قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS / MS) تقنية ذات قيمة خاصة لتحديد وتصنيف الهياكل الكيميائية. قلويدات التروبان (TAs) هي مركبات مشتقة من النباتات ذات أهمية طبية وسمية كبيرة. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير سير عمل فحص قائم على LC-MS / MS باستخدام تكوينات MS / MS المتعددة المتاحة على مطياف الكتلة الثلاثي الرباعي (QQQ) للتعليق على هياكل TA وتصنيفها بناء على أنماط التجزئة المميزة الخاصة بها. باستخدام مجموعة من عمليات المسح الأيوني للمنتج المعتمدة على البيانات (DD) ، ومسح أيون السلائف (PrIS) ، ومسح الخسارة المحايدة (NLS) ، قمنا بتطبيق هذه الطريقة على مقتطفات غنية ب TA من الباذنجان Datura stramonium و Datura metel. هذه الطريقة سريعة وحساسة ، وقد تم استخدامها بنجاح لكل من التكرار الأولي للعينات المعقدة المحتوية على TA ولاكتشاف مرشح جديد للعزل والتنقية (والمقايسة الحيوية في نهاية المطاف).

Introduction

على الرغم من أن الجزيئات الاصطناعية بالكامل أصبحت أكثر بروزا في اكتشاف الأدوية في العقود الأخيرة، إلا أن ما يقرب من ثلثي جميع الأدوية المعتمدة من السنوات ال 39 الماضية هي منتجات طبيعية أو مستوحاة من المنتجات الطبيعية،1،2 مما يؤكد الأهمية المستمرة لأبحاث المنتجات الطبيعية. قلويدات ، بعض المنتجات الطبيعية المحتوية على النيتروجين ، تحظى بتقدير خاص لخصائصها الطبية. قلويدات التروبان (TAs) التي تحتوي على [3.2.1.]- نظام يحتوي على النيتروجين ثنائي الحلقات ، يتم إنتاجه في الغالب بواسطة النباتات في عائلات الباذنجانيات (الباذنجان) ، و Erythroxylaceae ، و Convolvulaceae. ومن ال....

Protocol

تنبيه: يرجى الرجوع إلى جميع أوراق بيانات سلامة المواد ذات الصلة (MSDS) قبل استخدام المواد الكيميائية المدرجة.

1. إعداد العينة

تنبيه: يمكن أن يسبب النيتروجين السائل حروقا بالتبريد . استخدم قفازات التبريد وحماية العين في منطقة جيدة التهوية. يمكن أن تكون عينات النباتات المحتوية على قلويد مزعجة للجلد. تعامل معهم دائما بالقفازات. الميثانول سام وقابل للاشتعال ويجب التعامل معه في غطاء دخان بعيدا عن مصادر الاشتعال المحتملة.

ملاحظة: من الناحية النظرية ، يمكن استخدام الأنسجة النباتية المزروعة أو البرية (المجففة أو المطحونة طازجة) ؛ الإجراء أدناه ه....

النتائج

لإثبات فعالية الطريقة ، تم تحليل مزيج قياسي من TAs (10 ميكروغرام / مل لكل من مزيج أسيتيل تروبين / أسيتيل سودوتروبين [أحادي الاستبدال] ، 10 ميكروغرام / مل لكل خليط من اثنين من أيزومرات أنيسودامين [ثنائي الاستبدال] ، جنبا إلى جنب مع هيوسيامين [أحادي الاستبدال] ، ليتورين [أحادي الا?.......

Discussion

وعلى الرغم من أن بارامترات الأجهزة المنصوص عليها في البروتوكول تسمح بأداء مرض، فإن الاستخدام الناجح لهذه الطريقة قد يتطلب اهتماما دقيقا بعدة خطوات حاسمة أو تحسينها إلى المستوى الأمثل. في حين أن تدرج مذيب HPLC المقدم في الخطوة 2.2 مناسب بشكل عام لقلويدات التروبان ، فقد يحتا?.......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من خلال منحة أبحاث أعضاء هيئة التدريس (جامعة ميشيغان الشمالية ، الممنوحة ل MAC) ، وزمالة بحثية جامعية (جامعة شمال ميشيغان ، منحت ل JC) ، وقسم الكيمياء. يود المؤلفون أن يشكروا جون بيرغر (NMU) على المساعدة في تحضير الأنسجة النباتية ، وهانا هوكينز (NMU) على صيانة LC-MS والمساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها ، والدكتور ريان فورنوالد وطلابه CH 495 (تخليق المنتجات الطبيعية) على إعدادهم لمزيج الأسيتيل تروبين. ويود المؤلفون أيضا أن يشكروا الدكتور دانيال جونز (جامعة ولاية ميشيغان) على حصوله على أطياف MS/MS عالية الاستبانة.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetonitrile, For UHPLC, suitable for mass spectometrySigma-Aldrich900667HPLC solvent
Argon gasAirGasAR UHP300CID gas
Formic acid, 99% for analysisThermo ScientificAC270480010HPLC additive
Guard column holderRestek25812
HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D PlusShimadzu228-65802-58HPLC column
LCMS, Shimdazu LCMS-8045Shimadzu225-31800-44Mass spectrometer; we ran LabSolutions software, which is standard for Shimadzu instruments
Liquid nitrogenAirGasNI 180LT22
Methanol, for HPLC/UHPLC/LCMSVWRBDH 85800.400For making extraction solvent
Microcentrifuge VWR2400-37
Microcentrifuge tubes, 1.5 mLFisher Scientific05-408-129
Mortar Fisher ScientificFB961CFor grinding plant tissues
PestleFisher ScientificFB961MFor grinding plant tissues
Pipette 1000 mLGilson F144059M
Pipette tip 1000 mLFisher scientific02-707-404
Plant tissuesVarious sourcesN/ACan be anything wild or cultivated
Polypropylene conical tubes, 15 mLFisher Scientific05-539-4
Polystyrene coolerULINES-18312The type of coolers that reagents for molecular biology are shipped in would be appropriate
Roc C18 3 µm, 100 mm x 4.6 mmRestek9534315HPLC column
Roc C18, 10 mm x 4 mmRestek953450210Guard column
Rocking shakerThemo Scientific11-676-680
Screw thread vial convenience kit (9 mm)Fisher scientific13-622-190LCMS autosampler vials
Syringe, 3 mLFisher Scientific03-377-27
Syringe filter 0.45 µm Avantor/VWR76479-008
Water, for use in liquid chromatography and mass spectrometryJT Baker9831-03For making extraction solvent
Water solution, contains 0.1% v/v formic acid, For UHPLC, suitable for mass spectometrySigma-Aldrich900687-1LHPLC solvent

References

  1. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010. J Nat Prod. 75, 311-335 (2012).
  2. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

LC MS MS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved