天然物研究における液体クロマトグラフィータンデム質量分析の応用:ケーススタディとしてのトロパンアルカロイド

要約

トロパンアルカロイドの迅速な質量分析(MS)/質量分析(MS)ベースのアノテーションと分類の方法を提示し、トロパン含有サンプルの予備的な再現性の除去と単離のための新規アルカロイドの発見の両方に役立ちます。

要約

今日利用されている多くの薬品は合成由来ですが、天然物は依然として新しい化学的多様性と生物活性の豊富な供給源を提供し、耐性のある病気や新興の病気の有望な手がかりを生み出すことができます。しかし、研究者は天然物を見つけてその構造を解明するだけでなく、分離して分析する価値のあるもの(およびすでに知られているもの、つまり複製除去として知られるプロセス)を特定する必要があります。最新の分析機器の出現により、天然物の発見とデレプリケーションのペースは加速しています。液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)は、化学構造の同定と分類に特に有用な手法となっています。トロパンアルカロイド(TA)は、薬効上および毒物学的に重要な植物由来の化合物です。この研究では、トリプル四重極(QQQ)質量分析計で利用可能な複数のMS/MS構成を利用して、TA構造の明確なフラグメンテーションパターンに基づいてアノテーションおよび分類するLC-MS/MSベースのスクリーニングワークフローを開発しました。データ依存性(DD)プロダクトイオンスキャン、プリカーサーイオンスキャン(PrIS)、およびニュートラルロススキャン(NLS)を組み合わせて使用することにより、この方法をナイトシェードである チョウセンアサガオストラモニウム およびチョウセンアサガオ メテル のTAリッチ抽出物に適用しました。この方法は迅速で感度が高く、複雑なTA含有サンプルの予備的な再現性の除去と、単離、精製(および最終的にはバイオアッセイ)の新規候補の発見の両方に採用されました。

概要

ここ数十年で創薬において完全合成分子が目立つようになりましたが、過去39年間に承認された医薬品の3分の2近くが天然物または天然物に触発されたものであり^1,2 、天然物研究の継続的な重要性を強調しています。アルカロイドは、特定の窒素含有天然物であり、その薬効成分で特に高く評価されています。[3.2.1.]-二環式窒素含有システムは、主にナス科(ナイトシェード)、エリスロキシラ科、およびコンボルブラ科の植物によって生産されます。例としては、アトロピン、スコポラミン、コカインなどがあります。複数の半合成または合成トロパンも臨床的に使用されています³。TAとその誘導体は、多くの疾患の治療に使用されており^3,4、これらの薬剤のいくつかは、WHOの2023年必須医薬品リスト⁵に掲載されています。TAはその強力な活性のために、娯楽としても(覚醒剤またはせん妄剤として)使用され、それらを含む植物(または調剤)を摂取すると中毒を引き起こす可能性があります^6,7

プロトコル

注意: 記載されている化学物質を使用する前に、関連するすべての製品安全データシート(MSDS)を参照してください。

1. サンプル調製

注意: 液体窒素は、極低温火傷を引き起こす可能性があります。クライオジェングローブと目の保護具は、換気の良い場所で使用してください。アルカロイド含有植物サンプルは、皮膚に刺激を与える可能性があります。常に手袋をはめて取り扱ってください。メタノールは有毒で可燃性であり、潜在的な発火源から離れたドラフト内で取り扱う必要があります。

注:理論的には、栽培または野生植物組織を使用できます(乾燥または挽きたての植物)。以下の手順は、メソッド開発中に利用される手順です。

1. 目的の植物組織が新鮮な場合は、ポリプロピレン製の円錐形のチューブに入れ、液体窒素に2〜3分間浸して凍結します。
2. 凍結した植物組織を事前に冷却した乳鉢(液体窒素を入れたポリスチレンクーラー)に入れ、事前に冷却した乳棒を使用して、組織を均一な粉末に粉砕します。
3. 予め冷却したスパチュラを使用して、風袋引きポリプロピレンマイクロ遠心チューブに所望の量の組織を迅速に秤量し、直ちに組織100 mgあたり1 mLの濃度で20%メタノ....

ディスカッション

プロトコールで提供される機器パラメータは満足のいく性能を可能にしますが、このメソッドをうまく使用するには、いくつかの重要なステップに細心の注意を払ったり、最適化したりする必要があります。ステップ 2.2 で示した HPLC 溶媒グラジエントは、一般的にトロパンアルカロイドに適していますが、検査対象のサンプルまたは植物種のトロパンアルカロイド?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile, For UHPLC, suitable for mass spectometry	Sigma-Aldrich	900667	HPLC solvent
Argon gas	AirGas	AR UHP300	CID gas
Formic acid, 99% for analysis	Thermo Scientific	AC270480010	HPLC additive
Guard column holder	Restek	25812
HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D Plus	Shimadzu	228-65802-58	HPLC column
LCMS, Shimdazu LCMS-8045	Shimadzu	225-31800-44	Mass spectrometer; we ran LabSolutions software, which is standard for Shimadzu instruments
Liquid nitrogen	AirGas	NI 180LT22
Methanol, for HPLC/UHPLC/LCMS	VWR	BDH 85800.400	For making extraction solvent
Microcentrifuge	VWR	2400-37
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Mortar	Fisher Scientific	FB961C	For grinding plant tissues
Pestle	Fisher Scientific	FB961M	For grinding plant tissues
Pipette 1000 mL	Gilson	F144059M
Pipette tip 1000 mL	Fisher scientific	02-707-404
Plant tissues	Various sources	N/A	Can be anything wild or cultivated
Polypropylene conical tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-4
Polystyrene cooler	ULINE	S-18312	The type of coolers that reagents for molecular biology are shipped in would be appropriate
Roc C18 3 µm, 100 mm x 4.6 mm	Restek	9534315	HPLC column
Roc C18, 10 mm x 4 mm	Restek	953450210	Guard column
Rocking shaker	Themo Scientific	11-676-680
Screw thread vial convenience kit (9 mm)	Fisher scientific	13-622-190	LCMS autosampler vials
Syringe, 3 mL	Fisher Scientific	03-377-27
Syringe filter 0.45 µm	Avantor/VWR	76479-008
Water, for use in liquid chromatography and mass spectrometry	JT Baker	9831-03	For making extraction solvent
Water solution, contains 0.1% v/v formic acid, For UHPLC, suitable for mass spectometry	Sigma-Aldrich	900687-1L	HPLC solvent