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要約

トロパンアルカロイドの迅速な質量分析(MS)/質量分析(MS)ベースのアノテーションと分類の方法を提示し、トロパン含有サンプルの予備的な再現性の除去と単離のための新規アルカロイドの発見の両方に役立ちます。

要約

今日利用されている多くの薬品は合成由来ですが、天然物は依然として新しい化学的多様性と生物活性の豊富な供給源を提供し、耐性のある病気や新興の病気の有望な手がかりを生み出すことができます。しかし、研究者は天然物を見つけてその構造を解明するだけでなく、分離して分析する価値のあるもの(およびすでに知られているもの、つまり複製除去として知られるプロセス)を特定する必要があります。最新の分析機器の出現により、天然物の発見とデレプリケーションのペースは加速しています。液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)は、化学構造の同定と分類に特に有用な手法となっています。トロパンアルカロイド(TA)は、薬効上および毒物学的に重要な植物由来の化合物です。この研究では、トリプル四重極(QQQ)質量分析計で利用可能な複数のMS/MS構成を利用して、TA構造の明確なフラグメンテーションパターンに基づいてアノテーションおよび分類するLC-MS/MSベースのスクリーニングワークフローを開発しました。データ依存性(DD)プロダクトイオンスキャン、プリカーサーイオンスキャン(PrIS)、およびニュートラルロススキャン(NLS)を組み合わせて使用することにより、この方法をナイトシェードである チョウセンアサガオストラモニウム およびチョウセンアサガオ メテル のTAリッチ抽出物に適用しました。この方法は迅速で感度が高く、複雑なTA含有サンプルの予備的な再現性の除去と、単離、精製(および最終的にはバイオアッセイ)の新規候補の発見の両方に採用されました。

概要

ここ数十年で創薬において完全合成分子が目立つようになりましたが、過去39年間に承認された医薬品の3分の2近くが天然物または天然物に触発されたものであり1,2 、天然物研究の継続的な重要性を強調しています。アルカロイドは、特定の窒素含有天然物であり、その薬効成分で特に高く評価されています。[3.2.1.]-二環式窒素含有システムは、主にナス科(ナイトシェード)、エリスロキシラ科、およびコンボルブラ科の植物によって生産されます。例としては、アトロピン、スコポラミン、コカインなどがあります。複数の半合成または合成トロパンも臨床的に使用されています3。TAとその誘導体は、多くの疾患の治療に使用されており3,4、これらの薬剤のいくつかは、WHOの2023年必須医薬品リスト5に掲載されています。TAはその強力な活性のために、娯楽としても(覚醒剤またはせん妄剤として)使用され、それらを含む植物(または調剤)を摂取すると中毒を引き起こす可能性があります6,7。TAは、人間および動物の食品8には好ましくなく、お茶、香辛料、穀物、蜂蜜、およびハーブサプリメント9,10を汚染する可能性があります。その薬効と毒殺能力の両方から、新しいTAの発見(および既知のTAの同定)に役立つ分析法が有用です。

タンデム質量分析(MS/MS)では、「質量フィルター」(四重極、飛行時間型チューブなど)を物理的に結合するか(「空間内」)、または装置が追加の「インタイム」反応/分離ステップを使用します。インスペースMS/MSは、さまざまなモードを使用して、異なる質量フィルター(トリプル四重極やQQQ装置の四重極など)でさまざまなイオンを選択し、フラグメンテーションします。これらの異なるモードを使用して、特定のイオンによってどの特定のフラグメントが作られるか(プロダクトイオンスキャン)、サンプル中のどのイオンが特定のフラグメントを生成するか(プリカーサーイオンスキャンまたはPrIS)、または特性質量の損失を受けるか(ニュートラルロススキャンまたはNLS)、またはどの特定の化合物がどの特定のフラグメントを持っているか(マルチプルリアクションモニタリング)を決定できます。したがって、MS/MSは、新しい化合物の構造を提案したり、既存の化合物の存在を確認したりするのに役立つフラグメントを提供します。MS/MSは、創薬、天然物化学、およびメタボロミクスの分野でますます使用されており11,12、アルカロイド含有種のプロファイリング(植物化学的特性評価または化学分類学的分析用)や、食品または薬用植物の特定のアルカロイドの検出および定量10,13,14,15,16に使用されています。

多くの質量分析技術が利用可能であるにもかかわらず、新しいアルカロイドの探索には課題があります。スクリーニングする候補生物を見つけることに加えて、アルカロイドの完全な構造確認は、多くの異なる分析技術を含む困難なプロセスです。さらに、研究者はすでに知られている化合物を分離し、労力、時間、リソースを浪費する可能性があります。これは、数千とは言わないまでも数百のTAが報告されており、その多くが互いに異性体であるTAにとっては特に困難です。「既知のものを特定し、未知のものと区別する」プロセスは、レプリケーション解除として知られています。このプロセスを支援するために、さまざまなTAや他の化合物の保持時間(r.t.s)と質量断片のデータベースが公開されています17,18。それにもかかわらず、レプリケーション解除は面倒です。サンプル全体のLC-MS/MSクロマトグラム中のアルカロイドにアノテーションを付ける(つまり、推定構造を割り当てる)だけでは時間がかかります。最近、分子ネットワーク1 9,20および手動脱複製18,21,22の両方がベンジルイソキノリン、モノテルペンインドール、およびトロパンアルカロイドに使用され、PrISはピロリジジンおよびソラニン型アルカロイド23,24を同定するためのスペクトルの「構造フィルタリング」に使用されている.しかし、TAは共通の、容易に識別できるフラグメントを持っているにもかかわらず、TA含有サンプルの迅速なLC-MS/MSベースの重複除去に利用できる特定の方法やワークフローはありません(図1)。ここで説明する方法では、データ依存性(DD)プロダクトイオンスキャン、PrIS、NLSを組み合わせて、モノ置換、ジ置換、および三置換トロパンの明確なフラグメンテーションパターン(図1A)と、これらのアルカロイドに見られる一般的なエステル基の損失(図1B)の両方に基づいて、植物のTA構造をアノテーションおよび分類します。研究生物は、ナイトシェード属のチョウセンアサガオのいくつかの種です。多様なTAの豊富な供給源であるチョウセンアサガオは、世界の歴史を通じて医療および文化的な目的で使用されており17、構造的に類似したTAが多数あるため、複製解除が困難なマトリックスであり、私たちの方法をテストするための魅力的なサンプルを提供してくれます。

プロトコル

注意: 記載されている化学物質を使用する前に、関連するすべての製品安全データシート(MSDS)を参照してください。

1. サンプル調製

注意: 液体窒素は、極低温火傷を引き起こす可能性があります。クライオジェングローブと目の保護具は、換気の良い場所で使用してください。アルカロイド含有植物サンプルは、皮膚に刺激を与える可能性があります。常に手袋をはめて取り扱ってください。メタノールは有毒で可燃性であり、潜在的な発火源から離れたドラフト内で取り扱う必要があります。

注:理論的には、栽培または野生植物組織を使用できます(乾燥または挽きたての植物)。以下の手順は、メソッド開発中に利用される手順です。

  1. 目的の植物組織が新鮮な場合は、ポリプロピレン製の円錐形のチューブに入れ、液体窒素に2〜3分間浸して凍結します。
  2. 凍結した植物組織を事前に冷却した乳鉢(液体窒素を入れたポリスチレンクーラー)に入れ、事前に冷却した乳棒を使用して、組織を均一な粉末に粉砕します。
  3. 予め冷却したスパチュラを使用して、風袋引きポリプロピレンマイクロ遠心チューブに所望の量の組織を迅速に秤量し、直ちに組織100 mgあたり1 mLの濃度で20%メタノール(室温[RT])を加えます。
    注:メタノール(20%)は、TAの抽出に一般的に使用されます25。時折、0.1%ギ酸が添加されますが、この方法や他の方法の開発中に抽出効率に違いは観察されませんでした。
  4. キャップ付きチューブをロッキングシェーカー(中速)にRTで最低3時間置きます。
  5. チューブを9464 x g で10分間遠心分離します。上清をピペットで取り除き、LC-MSオートサンプラーバイアルに入れるか、まだ曇っている場合は、まず0.45 μmシリンジフィルターでろ過します。
    注:プロトコールはここで一時停止できますが、処理された新鮮な植物サンプルと抽出物は、潜在的なアルカロイド分解を避けるために、分析前に-80°Cの冷凍庫に保存する必要があります。

2. LC-MS装置の設定とデータ収集

注意:アセトニトリルは有毒で可燃性です。発火源から遠ざけ、ヒュームフードを使用して蒸気を制御します。ギ酸は腐食性です。皮膚や目に入ったものを避け、適切な個人用保護具を着用してください。

  1. エレクトロスプレーイオン化(ESI)ソースと逆相HPLCカラム(C18、4.6 × 100 mm)を備えたLC-MS装置を使用してください。
  2. HPLCの場合、溶媒AとしてH2O中の0.1%ギ酸を使用し、溶媒Bとしてアセトニトリル中の0.1%ギ酸を使用します。カラムを 99% A と 1% B で平衡化し、1% から 50% B のグラジエントを 26 分間で 30 分間設定し、26.01 分で 1% B に戻り、1% B で 4 分間保持します。温度45°C、流速0.5mL/minのカラムオーブンを使用してください。
  3. LC-MS 分析法では、界面電圧:4.0 kV、ネブライジングガス流量:3 L/min、加熱ガス流量:10 L/min、DL 温度:250 °C、ヒートブロック温度:400 °C、界面温度:300 °C、乾燥ガス流量:10 L/min、衝突誘起解離(CID)ガス(アルゴン)圧力 17 kPa の質量分析計の操作パラメータを使用します。
  4. Q3 スキャンと Q1 スキャン(100-1000 Da)の両方を含む ESI ポジティブモードで MS メソッドを作製し、サーベイイベント(LC メソッドの長さに設定)として機能し、自動同位体排除を有効にします。Q1スキャン(DD分析)の従属イベントとして、質量ウィンドウが50〜1000 Da、コリジョンセルエネルギーが-20 V、イベント時間が<0.2秒のプロダクトイオンスキャンを含めます。
    注:Q1 の DD プロダクトイオンスキャンをトリガーするためのカウントしきい値は可変ですが、通常は 7,000 〜 10,000 カウントのレベルが使用されます。この分析法の開発に使用された装置など、一部の装置では、Q3 スキャンは Q1 よりも高い質量精度と感度を提供し、Q1 スキャンで観察されたイオンを確認するために含まれていますが、ステップ 2.4 からは問題なく省略できます。
  5. 上記のMS法に、LC法の長さに等しいポジティブモードPrISを、コリジョンセルエネルギーが-20 V、イベント時間が0.75秒の場合に追加します。いずれの場合も、自動同位体除外または脱同位体機能が有効になっていることを確認してください。TA フラグメント (Da、図 1A を参照) の対象となる m/z 値が 124.1 (モノリサム TA の場合、マスウィンドウ 125-1000 Da)、122.1 および 140.1 (二置換 TA の場合、それぞれ 123 および 141 Da から始まるマスウィンドウ)、156.1 および 138.1 (三置換 TA の場合、157 および 139 Da から始まるマスウィンドウ) であることを確認してください。 それぞれ)。
    注:分析法開発中、PrISは、単置換TAと二置換TA用、および三置換TA用の2つの異なる分析法に分割されましたが、これらは任意の方法で分割または組み合わせることができます。
  6. ステップ 2.4 のパラメーターを含む 2 つ目の MS メソッドを作成します。
    1. この MS/MS メソッドに、LC メソッドの長さに等しいポジティブモード NLS を追加し、コリジョンセルエネルギーを -20 V で、イベント時間を 0.75 秒にします。いずれの場合も、 自動同位体除外 または 脱同位機能 が有効になっていることを確認してください。
    2. TA上のエステル(Da、 図1Bを参照)の関心中性損失質量が100.05(チグリ酸由来のエステルの場合、質量ウィンドウが110-1000 Da)、60.03(アセチル基の場合、質量ウィンドウが100-1000 Da)、および166.06(フェニル乳酸または熱帯酸エステル、質量ウィンドウが170-1000 Da)であることを確認してください。
  7. LC-MS メソッドをダウンロードし、目的のサンプルのデータファイルを作成します。HPLCカラムを45°Cで平衡化したら、異なる種または組織タイプ間で適切な抽出溶媒ブランクを使用して、目的のサンプルをバッチファイルまたはプロジェクトファイルで分析します。一般的な注入量は10〜20μLです。
    注:特に大量の質量では、質量分析計検出器が飽和状態になる場合があります。非常に高濃度のサンプルを分析する場合は、ESIソースが洗浄され、装置が定期的にチューニングされていることを確認してください。ここでプロトコルは、すべてのデータが収集された後に一時停止できます。

3. データ分析

  1. Q1 スキャンと Q3 スキャン(および DD プロダクトイオンスキャン)の全イオンクロマトグラムを調べ、TA のような特徴を持つ存在量豊富なイオンの親質量(a)質量<[M+H]+ イオンの場合は 500 Da、通常は偶数質量、b)上記の LC 分析法を使用した 2 〜 22 分間の典型的な r.t.s、c)次のリストのフラグメントを確認します。 m/z 93、124、142、140、122、138、156、174、110、または128 Da。
  2. m/z 124 の PrIS クロマトグラム/チャンネルを調べ、r.t.s(ステップ 3.1 で記録)がこのフラグメントを生成するピーク/イオンを確認します。クロマトグラムをスキャンごとにクリックし、DDプロダクトイオンスキャンで得られたMS/MSスペクトル全体(特に存在量の少ない分子種)を調べます。
    注:このフラグメントを含む真の種は、複数のスキャンに存在し、Q1 スキャンと Q3 スキャンの両方に表示されます (後者が使用されている場合)。補足情報(補足ファイル1)には、注釈を補助するスプレッドシートが添付されています。
  3. 他のPrISクロマトグラムについても、ステップ3.2を繰り返します。 m/z 122 と 140 はどちらも二置換 TA を示し、 m/z 138 と 156 はどちらも三置換 TA を示しているため、これらのクロマトグラム/チャンネルを一緒に調べてください。
  4. m/z 100、60、および 166 の NLS クロマトグラム/チャンネルを調べ、r.t.s(ステップ 3.1 で記録)がこれらの中性損失を生成するピーク/イオンを確認します。PrISと同様に、クロマトグラムをスキャンごとにクリックし、特に存在量の少ない分子種について、DDプロダクトイオンスキャンで得られたフラグメンテーションと比較します。
  5. DDプロダクトイオンスキャン結果によって裏付けられたPrISデータとNLSデータの組み合わせを使用して、最小のトロパン質量(124、122、138など)と中性損失を加算し、残りの残りの質量を考慮することにより、観察されたアルカロイドの推定アノテーションを作成します。
    注:TAを置換する典型的な基(およびDa中のそれらの質量)は、ヒドロキシル(18)、アセチル(60)、プロピオニル(74)、イソブチリル(88)、チグロイル(100)、飽和チグロイル/2-メチルブチリル(102)、またはフェニル乳酸/熱帯酸(166)です。
  6. アルカロイドのアノテーションを文献17 およびデータベース(MoNAなど)26 で報告されているものと比較し、報告されているTA置換パターン(および新規性がある可能性のあるパターン)を決定します。さらに、確認のために市販されているいくつかの一般的なトロパンアルカロイド(アトロピン、リトリン、スコポラミンなど)の標準物質を使用してください。
  7. 低存在量のサンプル(PrISおよびNLSは従属イベント閾値を下回るイオンを拾う可能性があります)の追加の構造情報については、より濃縮されたサンプルで特定のプロダクトイオンスキャン(対象質量をプリカーサーイオンとして利用)を収集します。
    注:この方法は、低分解能のQQQ機器で開発されました。すべての推定される新しい化合物について、高分解能MS装置を使用して正確な質量スペクトルを取得する必要があります。

結果

この分析法の有効性を実証するために、TAの標準混合物(アセチルトロピン/アセチルシュードトロピン混合物[一置換]各10 μg/mL、2つのアニソダミン異性体[二置換]の混合物各10 μg/mL、ヒヨスチアミン[一置換]、リトリン[一置換]、スコポラミン[三代替])をポジティブコントロールとして分析しました(図2)。図2AにフルQ1スキャ?...

ディスカッション

プロトコールで提供される機器パラメータは満足のいく性能を可能にしますが、このメソッドをうまく使用するには、いくつかの重要なステップに細心の注意を払ったり、最適化したりする必要があります。ステップ 2.2 で示した HPLC 溶媒グラジエントは、一般的にトロパンアルカロイドに適していますが、検査対象のサンプルまたは植物種のトロパンアルカロイド?...

開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は、Faculty Research Grant(ノーザンミシガン大学、M.A.C.に授与)、学部研究フェローシップ(ノーザンミシガン大学、J.C.に授与)、および化学科によって資金提供されました。著者らは、植物組織調製の支援を提供してくださった John Berger 氏 (NMU)、LC-MS のメンテナンスとトラブルシューティングの支援を提供してくださった Hannah Hawkins 氏 (NMU)、アセチルトロピン混合物の調製についていただいた Dr. Ryan Fornwald 氏と彼の CH 495 (Natural Products Synthesis) の学生に感謝します。また、高分解能 MS/MS スペクトルを取得してくださった Daniel Jones 博士 (ミシガン州立大学) にも感謝いたします。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetonitrile, For UHPLC, suitable for mass spectometrySigma-Aldrich900667HPLC solvent
Argon gasAirGasAR UHP300CID gas
Formic acid, 99% for analysisThermo ScientificAC270480010HPLC additive
Guard column holderRestek25812
HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D PlusShimadzu228-65802-58HPLC column
LCMS, Shimdazu LCMS-8045Shimadzu225-31800-44Mass spectrometer; we ran LabSolutions software, which is standard for Shimadzu instruments
Liquid nitrogenAirGasNI 180LT22
Methanol, for HPLC/UHPLC/LCMSVWRBDH 85800.400For making extraction solvent
Microcentrifuge VWR2400-37
Microcentrifuge tubes, 1.5 mLFisher Scientific05-408-129
Mortar Fisher ScientificFB961CFor grinding plant tissues
PestleFisher ScientificFB961MFor grinding plant tissues
Pipette 1000 mLGilson F144059M
Pipette tip 1000 mLFisher scientific02-707-404
Plant tissuesVarious sourcesN/ACan be anything wild or cultivated
Polypropylene conical tubes, 15 mLFisher Scientific05-539-4
Polystyrene coolerULINES-18312The type of coolers that reagents for molecular biology are shipped in would be appropriate
Roc C18 3 µm, 100 mm x 4.6 mmRestek9534315HPLC column
Roc C18, 10 mm x 4 mmRestek953450210Guard column
Rocking shakerThemo Scientific11-676-680
Screw thread vial convenience kit (9 mm)Fisher scientific13-622-190LCMS autosampler vials
Syringe, 3 mLFisher Scientific03-377-27
Syringe filter 0.45 µm Avantor/VWR76479-008
Water, for use in liquid chromatography and mass spectrometryJT Baker9831-03For making extraction solvent
Water solution, contains 0.1% v/v formic acid, For UHPLC, suitable for mass spectometrySigma-Aldrich900687-1LHPLC solvent

参考文献

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