Applications de la spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide dans la recherche sur les produits naturels : les alcaloïdes tropanes comme étude de cas

Résumé

Nous présentons une méthode d’annotation et de classification des alcaloïdes tropanes basée sur la spectrométrie de masse rapide (MS)/spectrométrie de masse (MS), utile à la fois pour la déréplication préliminaire d’échantillons contenant des tropanes et la découverte de nouveaux alcaloïdes pour l’isolement.

Résumé

Bien que de nombreux médicaments utilisés aujourd’hui soient d’origine synthétique, les produits naturels fournissent toujours une riche source de diversité chimique et de bioactivité nouvelles, et peuvent donner des pistes prometteuses pour des maladies résistantes ou émergentes. Le défi, cependant, est double : non seulement les chercheurs doivent trouver des produits naturels et élucider leurs structures, mais ils doivent également identifier ce qui vaut la peine d’être isolé et analysé (et ce qui est déjà connu - un processus connu sous le nom de déréplication). Avec l’avènement de l’instrumentation analytique moderne, le rythme de la découverte et de la déréplication des produits naturels s’est accéléré. La chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) est devenue une technique particulièrement précieuse pour identifier et classer les structures chimiques. Les alcaloïdes tropanes (AT) sont des composés d’origine végétale d’une grande importance médicinale et toxicologique. Dans cette étude, nous avons développé un flux de travail de dépistage basé sur LC-MS/MS en utilisant les multiples configurations MS/MS disponibles sur un spectromètre de masse à triple quadripôle (QQQ) pour annoter et classer les structures TA en fonction de leurs modèles de fragmentation distincts. En utilisant une combinaison de balayages d’ions de produits dépendants des données (DD), de balayages d’ions précurseurs (PrIS) et de balayages de perte neutre (NLS), nous avons appliqué cette méthode à des extraits riches en TA des solanacées Datura stramonium et Datura metel. Cette méthode est rapide, sensible et a été utilisée avec succès à la fois pour la déréplication préliminaire d’échantillons complexes contenant de l’AT et pour la découverte d’un nouveau candidat pour l’isolement, la purification (et éventuellement l’essai biologique).

Introduction

Bien que les molécules entièrement synthétiques aient pris de l’importance dans la découverte de médicaments au cours des dernières décennies, près des deux tiers de tous les médicaments approuvés au cours des 39 dernières années sont des produits naturels ou inspirés de produits ^naturels1,2 , ce qui souligne l’importance continue de la recherche sur les produits naturels. Les alcaloïdes, certains produits naturels contenant de l’azote, sont particulièrement prisés pour leurs propriétés médicinales. Les alcaloïdes tropanes (TA) contenant le [3.2.1.]-système bicyclique contenant de l’azote, sont produits principalement par les plantes des familles des Solanacées (morelles), des Erythroxylaceae et des Convolvulaceae. Les exemples incluent l’atropine, la scopolamine et la cocaïne ; Plusieurs tropanes semi-synthétiques ou synthétiques sont également utilisés cliniquement³. Les TA et leurs dérivés sont utilisés pour traiter de nombreuses affections ^3,4 et plusieurs de ces médicaments figurent sur la liste 2023 des médicaments essentiels de l’OMS⁵. En raison de leurs activités puissantes, les TA sont également utilisés à des fins récréatives (comme stimulants ou délirants) et peuvent provoquer une intoxication lors de l’ingestion de plantes (ou de préparations) qui en contiennent ^6,7. Les TA sont indésirables dans l’alimentation humaine et animale⁸ et peuvent altérer les thés, les épices, les céréales, le miel et les suppléments à base de plantes ^9,10. En raison de leur promesse médicinale et de leur capacité à empoisonner, les méthodes analytiques qui peuvent aider à la découverte de nouveaux TA (et à l’identification des TA connus) sont utiles.

En spectrométrie de masse en tandem (MS/MS), des « filtres de masse » (p. ex., quadripôles, tubes à temps de vol) sont couplés physiquement (« dans l’espace »), ou un instrument utilise des étapes de réaction ou de séparation supplémentaires « dans le temps ». La spectrométrie MS/MS dans l’espace utilise différents modes pour sélectionner et fragmenter différents ions au niveau des différents filtres de masse (par exemple, les quadripôles d’un instrument triple quadripôle ou QQQ). Ces différents modes peuvent être utilisés pour déterminer quels fragments spécifiques sont fabriqués par un ion donné (balayage ionique produit), quels ions d’un échantillon produisent certains fragments (balayage d’ions précurseurs ou PrIS) ou subissent des pertes d’une masse caractéristique (balayage de perte neutre ou NLS), ou quels composés spécifiques possèdent quels fragments spécifiques (surveillance des réactions multiples). La MS/MS fournit donc des fragments utiles pour proposer des structures pour de nouveaux composés ou confirmer la présence d’un composé existant. La spectrométrie de masse est de plus en plus utilisée dans les domaines de la découverte de médicaments, de la chimie des produits naturels et de la métabolomique^11,12, et a été utilisée pour établir le profil d’espèces contenant des alcaloïdes (pour la caractérisation phytochimique ou l’analyse chimiotaxonomique) et pour détecter et quantifier des alcaloïdes spécifiques dans les aliments ou les plantes médicinales 10,13,14,15,16.

Malgré les nombreuses techniques de spectrométrie de masse disponibles, il est difficile de trouver de nouveaux alcaloïdes. En plus de trouver un organisme candidat au dépistage, une confirmation structurale complète d’un alcaloïde est un processus ardu qui peut inclure de nombreuses techniques d’analyse différentes. De plus, les chercheurs pourraient isoler un composé déjà connu, ce qui fait perdre du travail, du temps et des ressources. Cela est particulièrement difficile pour les AT, où des centaines, voire des milliers d’AT, dont beaucoup sont isomères les uns avec les autres, sont signalés. Le processus d'« identifier les connus et de les distinguer des inconnus » est connu sous le nom de déréplication. Des bases de données sur les temps de rétention (r.t.s) et les fragments de masse de différents TA et autres composés sont publiées pour faciliter ce processus^17,18. Néanmoins, la déréplication est laborieuse ; le simple fait d’annoter (c’est-à-dire d’attribuer des structures putatives à) les alcaloïdes dans l’ensemble du chromatogramme LC-MS/MS d’un échantillon prend du temps. Récemment, le réseau moléculaire^{1 9,20} et la déréplication manuelle 18,21,22 ont été utilisés pour les alcaloïdes de benzylisoquinoléine, d’indole monoterpénique et de tropane, et les PrISs ont été utilisés pour le « filtrage structurel » des spectres afin d’identifier les alcaloïdes de type pyrrolizidine et solanine ^23,24. Cependant, il n’existe pas de méthodes ou de flux de travail spécifiques pour la déréplication rapide basée sur LC-MS/MS d’échantillons contenant des TA, même si les TA possèdent des fragments communs et facilement identifiables (Figure 1). La méthode décrite ici utilise une combinaison de balayages d’ions produits dépendants des données (DD), de PrIS et de NLS pour annoter et classer les structures TA dans les plantes en fonction des modèles de fragmentation distincts pour les tropanes mono-, di- et trisubstitués (Figure 1A) et des pertes de groupes esters communs trouvés dans ces alcaloïdes (Figure 1B). Les organismes étudiés sont plusieurs espèces du genre Datura. Une riche source de TA divers, Datura a été utilisé tout au long de l’histoire du monde à des fins médicinales et culturelles¹⁷- et est une matrice difficile à dérépliquer en raison de ses nombreux TA structurellement similaires, nous fournissant des échantillons attrayants sur lesquels tester notre méthode.

Protocole

ATTENTION : Veuillez consulter toutes les fiches de données de sécurité (FDS) pertinentes avant d’utiliser les produits chimiques répertoriés.

1. Préparation de l’échantillon

ATTENTION : L’azote liquide peut provoquer des brûlures cryogéniques. Utilisez des gants cryogéniques et des lunettes de protection dans un endroit bien ventilé. Les échantillons de plantes contenant des alcaloïdes peuvent être irritants pour la peau ; manipulez-les toujours avec des gants. Le méthanol est toxique et inflammable et doit être manipulé dans une hotte à l’abri des sources d’inflammation potentielles.

REMARQUE : En théorie, on peut utiliser des tissus végétaux cultivés ou sauvages (séchés ou fraîchement moulus) ; La procédure ci-dessous n’est que celle utilisée lors du développement de la méthode.

1. Si le tissu végétal d’intérêt est frais, congelez-le en le plaçant dans un tube conique en polypropylène et en l’immergeant dans de l’azote liquide pendant 2-3 min.
2. Placez le tissu végétal congelé dans un mortier pré-refroidi (dans un refroidisseur en polystyrène avec de l’azote liquide) et, à l’aide d’un pilon pré-refroidi, broyez le tissu en une poudre uniforme.
3. Pesez rapidement la quantité souhaitée de tissu dans un tube de microcentrifugation en polypropylène taré à l’aide d’une spatule pré-refroidie, et ajoutez immédiatement 20 % de méthanol (à température ambiante [RT]) à une concentration de 1 mL pour 100 mg de tissu.
   REMARQUE : Le méthanol (20 %) est couramment utilisé pour extraire les TA²⁵. À l’occasion, on ajoute de l’acide formique à 0,1 %, bien qu’aucune différence dans l’efficacité de l’extraction n’ait été observée lors de la mise au point de cette méthode et d’autres.
4. Placez les tubes bouchés sur un agitateur à bascule (vitesse moyenne) pendant au moins 3 h à RT.
5. Centrifuger les tubes à 9464 x g pendant 10 min. Pipeter le surnageant dans un flacon d’échantillonneur automatique LC-MS ou, si le temps est encore trouble, filtrer d’abord à travers un filtre de seringue de 0,45 μm.
   REMARQUE : Le protocole peut être interrompu ici, bien que les échantillons et extraits de plantes fraîches traités doivent être conservés dans un congélateur à -80 °C avant l’analyse afin d’éviter toute dégradation potentielle des alcaloïdes.

2. Configuration de l’instrument LC-MS et collecte de données

ATTENTION : L’acétonitrile est toxique et inflammable ; tenir à l’écart des sources d’inflammation et contrôler les vapeurs à l’aide d’une hotte. L’acide formique est corrosif ; Évitez tout contact avec la peau et les yeux et portez un équipement de protection individuelle approprié.

1. Utilisez un instrument LC-MS avec une source d’ionisation par électronébulisation (ESI) et une colonne HPLC en phase inverse (C18, 4,6 x 100 mm).
2. Pour la HPLC, utiliser de l’acide formique à 0,1 % dans_H2O comme solvant A et de l’acide formique à 0,1 % dans l’acétonitrile comme solvant B ; équilibrer la colonne avec 99 % A et 1 % B. Configurez une pente de 30 min de 1 % à 50 % B sur 26 min, revenant à 1 % B à 26,01 min et maintenant à 1 % B pendant 4 min. Utilisez une température de four à colonne de 45 °C et un débit de 0,5 mL/min.
3. Dans la méthode LC-MS, utilisez les paramètres de fonctionnement suivants pour le spectromètre de masse : tension d’interface : 4,0 kV, débit de gaz de nébulisation : 3 L/min, débit de gaz de chauffage : 10 L/min, température DL : 250 °C, température du bloc thermique : 400 °C, température d’interface : 300 °C, débit de gaz de séchage : 10 L/min et pression du gaz de dissociation induite par collision (CID) (argon) de 17 kPa.
4. Créez une méthode MS en mode ESI positif qui comprend à la fois un balayage Q3 et un balayage Q1 (100-1000 Da) qui fonctionne comme un événement d’enquête (réglé sur la longueur de la méthode LC), avec l’exclusion automatique des isotopes activée. Inclure un balayage d’ions produits en tant qu’événement dépendant du balayage Q1 (analyse DD), avec une fenêtre de masse de 50 à 1000 Da, une énergie de cellule de collision de -20 V et un temps d’événement de <0,2 s.
   REMARQUE : Le seuil de comptage pour déclencher le balayage ionique du produit DD de Q1 peut être variable, mais en règle générale, un niveau de 7 000 à 10 000 comptages est utilisé. Sur certains instruments, comme celui utilisé pour développer la méthode, le balayage Q3 offre une plus grande précision de masse et une sensibilité que le Q1 et est inclus pour confirmer les ions observés dans le balayage Q1, bien qu’il puisse être omis de l’étape 2.4 sans problème.
5. À la méthode MS ci-dessus, ajoutez des PrISs en mode positif égaux à la longueur de la méthode LC avec des énergies de cellule de collision de -20 V et des temps d’événement de 0,75 s. Assurez-vous que dans tous les cas, les fonctions d’exclusion automatique des isotopes ou de désisotopation sont activées. Assurez-vous que les valeurs m/z d’intérêt pour les fragments d’AT (en Da, voir la figure 1A) sont 124.1 (pour les AT monosubstitués, fenêtre de masse de 125-1000 Da), 122.1 et 140.1 (pour les AT disubstitués, fenêtres de masse commençant à 123 et 141 Da, respectivement), et 156.1 et 138.1 (pour les AT trisubstitués, fenêtres de masse commençant à 157 et 139 Da, respectivement).
   REMARQUE : Au cours de l’élaboration de la méthode, les PrIS ont été divisés en deux méthodes différentes, l’une pour les AT mono- et disubstitués et l’autre pour les TA trisubstitués, bien qu’elles puissent être divisées ou combinées de n’importe quelle façon.
6. Construisez une deuxième méthode MS qui inclut les paramètres de l’étape 2.4.
   1. À cette méthode MS/MS, ajoutez un NLS en mode positif égal à la longueur de la méthode LC, avec des énergies de cellule de collision de -20 V et des temps d’événement de 0,75 s. Assurez-vous que dans tous les cas, les fonctions d’exclusion ou de désisotopation automatiques des isotopes sont activées.
   2. S’assurer que les masses de perte neutre d’intérêt pour les esters sur les AT (en Da, voir Figure 1B) sont 100,05 (pour les esters dérivés de l’acide tiglique, fenêtre de masse de 110-1000 Da), 60,03 (pour les groupes acétyle, fenêtre de masse de 100-1000 Da) et 166,06 (esters d’acide phényllactique ou d’acide tropique, fenêtre de masse de 170-1000 Da).
7. Téléchargez la méthode LC-MS et créez des fichiers de données pour les échantillons d’intérêt. Une fois que la colonne HPLC est équilibrée à 45 °C, analysez les échantillons d’intérêt dans un lot ou un fichier de projet avec des blancs de solvant d’extraction appropriés entre différentes espèces ou types de tissus. Un volume d’injection typique est de 10 à 20 μL.
   REMARQUE : À des volumes particulièrement élevés, le détecteur de spectromètre de masse peut être saturé. Si vous analysez des échantillons très concentrés, assurez-vous que la source ESI est nettoyée et que l’instrument est accordé régulièrement. Le protocole peut être mis en pause ici une fois que toutes les données ont été collectées.

3. Analyse des données

1. Examinez le chromatogramme ionique total des balayages Q1 et Q3 (et le balayage d’ions produit DD), et notez la masse parente de tous les ions abondants qui ont des caractéristiques similaires à celles de l’AT : a) masse <500 Da pour l’ion [M+H]⁺ , généralement une masse paire, b) r.t.s typique entre 2 et 22 min en utilisant la méthode LC ci-dessus, et c) fragments de la liste suivante : m/z 93, 124, 142, 140, 122, 138, 156, 174, 110 ou 128 Da.
2. Examinez le chromatogramme/canal PrIS pour m/z 124, et notez quels pics/ions sont à quels r.t.s (enregistrés à l’étape 3.1) produisent ce fragment. Cliquez balayage par balayage sur le chromatogramme et examinez l’ensemble des spectres MS/MS obtenus dans le balayage ionique du produit DD, en particulier pour les espèces moins abondantes.
   REMARQUE : Une véritable espèce contenant ce fragment existera pour plusieurs balayages et apparaîtra à la fois dans les balayages Q1 et Q3 (si ce dernier est utilisé). Une feuille de calcul est jointe aux renseignements à l’appui (fichier supplémentaire 1) pour faciliter les annotations.
3. Répétez l’étape 3.2 avec les autres chromatogrammes PrIS. Comme m/z 122 et 140 sont tous deux indicatifs d’AT disstitués et que m/z 138 et 156 sont indicatifs d’AT trisubstitués, examinez ces chromatogrammes/canaux ensemble.
4. Examinez le chromatogramme/les canaux NLS pour m/z 100, 60 et 166, et notez quels pics/ions auxquels les r.t. (enregistrés à l’étape 3.1) produisent ces pertes neutres. Comme pour le PrIS, cliquez balayage par balayage dans le chromatogramme et comparez avec la fragmentation obtenue dans le balayage ionique du produit DD, en particulier pour les espèces de faible abondance.
5. À l’aide de la combinaison des données PrIS et NLS, étayées par les résultats de balayage ionique du produit DD, faites des annotations présumées des alcaloïdes observés en ajoutant la plus petite masse tropane (par exemple, 124, 122 ou 138) et la perte neutre, puis en tenant compte de la masse restante.
   REMARQUE : Les groupes typiques substituant les TA (et leurs masses en Da) sont l’hydroxyle (18), l’acétyle (60), le propionyle (74), l’isobutyryle (88), le tigloyle (100), le tigloyl/2-méthylbutyryle saturé (102) ou le phényllactate/acide tropique (166).
6. Comparer les annotations pour les alcaloïdes à celles rapportées dans la littérature¹⁷ et les bases de données (par exemple, MoNA)²⁶ pour déterminer quels modèles de substitution d’AT sont rapportés (et lesquels sont potentiellement nouveaux). De plus, utilisez des étalons de certains alcaloïdes tropanes courants (par exemple, atropine, littorine, scopolamine) qui sont disponibles dans le commerce pour confirmation.
7. Pour obtenir des informations structurales supplémentaires sur les échantillons de faible abondance (le PrIS et le NLS peuvent détecter des ions inférieurs aux seuils d’événements dépendants), prélever un balayage d’ions de produit spécifique (en utilisant la masse d’intérêt comme ion précurseur) sur un échantillon plus concentré.
   REMARQUE : Cette méthode a été développée sur un instrument QQQ à basse résolution. Pour tous les nouveaux composés présumés, un instrument MS à haute résolution doit être utilisé pour obtenir des spectres de masse précis.

Résultats

Pour démontrer l’efficacité de la méthode, un mélange standard d’AT (10 μg/mL chacun d’un mélange d’acétyltropine/acétylpseudotropine [monosubstitué], 10 μg/mL chacun d’un mélange de deux isomères d’anisodamine [disubstitué], ainsi que d’hyoscyamine [monosubstitué], de littorine [monosubstitué] et de scopolamine [trisubstitué]) a été analysé en tant que témoin positif (figure 2). Un chromatogramme de balayage Q1 complet (aff...

Discussion

Bien que les paramètres de l’instrument fournis dans le protocole permettent des performances satisfaisantes, l’utilisation réussie de cette méthode peut nécessiter une attention particulière ou une optimisation de plusieurs étapes critiques. Bien que le gradient de solvant HPLC fourni à l’étape 2.2 soit généralement approprié pour les alcaloïdes tropanes, il peut être nécessaire de le modifier en fonction du profil alcaloïde tropane de l’échantillon ou de l’esp...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile, For UHPLC, suitable for mass spectometry	Sigma-Aldrich	900667	HPLC solvent
Argon gas	AirGas	AR UHP300	CID gas
Formic acid, 99% for analysis	Thermo Scientific	AC270480010	HPLC additive
Guard column holder	Restek	25812
HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D Plus	Shimadzu	228-65802-58	HPLC column
LCMS, Shimdazu LCMS-8045	Shimadzu	225-31800-44	Mass spectrometer; we ran LabSolutions software, which is standard for Shimadzu instruments
Liquid nitrogen	AirGas	NI 180LT22
Methanol, for HPLC/UHPLC/LCMS	VWR	BDH 85800.400	For making extraction solvent
Microcentrifuge	VWR	2400-37
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Mortar	Fisher Scientific	FB961C	For grinding plant tissues
Pestle	Fisher Scientific	FB961M	For grinding plant tissues
Pipette 1000 mL	Gilson	F144059M
Pipette tip 1000 mL	Fisher scientific	02-707-404
Plant tissues	Various sources	N/A	Can be anything wild or cultivated
Polypropylene conical tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-4
Polystyrene cooler	ULINE	S-18312	The type of coolers that reagents for molecular biology are shipped in would be appropriate
Roc C18 3 µm, 100 mm x 4.6 mm	Restek	9534315	HPLC column
Roc C18, 10 mm x 4 mm	Restek	953450210	Guard column
Rocking shaker	Themo Scientific	11-676-680
Screw thread vial convenience kit (9 mm)	Fisher scientific	13-622-190	LCMS autosampler vials
Syringe, 3 mL	Fisher Scientific	03-377-27
Syringe filter 0.45 µm	Avantor/VWR	76479-008
Water, for use in liquid chromatography and mass spectrometry	JT Baker	9831-03	For making extraction solvent
Water solution, contains 0.1% v/v formic acid, For UHPLC, suitable for mass spectometry	Sigma-Aldrich	900687-1L	HPLC solvent