천연 제품 연구에서 액체 크로마토그래피 탠덤 질량분석법의 응용 분야: 사례 연구로서의 트로판 알칼로이드

요약

트로판 알칼로이드의 고속 질량 분석법(MS)/질량 분석법(MS) 기반 주석 및 분류를 위한 방법을 제시하며, 이는 트로판 함유 샘플의 예비 복제 및 분리를 위한 새로운 알칼로이드의 발견 모두에 유용합니다.

초록

오늘날 사용되는 많은 약물이 합성 원료이지만, 천연 제품은 여전히 새로운 화학적 다양성과 생체 활성의 풍부한 원천을 제공하며 내성 또는 신종 질병에 대한 유망한 단서를 제공할 수 있습니다. 그러나 도전 과제는 두 가지입니다: 연구자들은 천연 제품을 찾고 그 구조를 밝혀야 할 뿐만 아니라 분리하고 분석할 가치가 있는 것(그리고 이미 알려진 것 - 역복제라고 알려진 프로세스)을 식별해야 합니다. 최신 분석 기기의 출현으로 천연물 발견 및 복제 해제의 속도가 가속화되었습니다. 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법(LC-MS/MS)은 화학 구조를 식별하고 분류하는 데 특히 유용한 기술이 되었습니다. 트로판 알칼로이드(TA)는 의학 및 독성학적으로 중요한 식물 유래 화합물입니다. 이 연구에서는 QQQ(Triple-Quadrupole) 질량분석기에서 사용할 수 있는 여러 MS/MS 구성을 활용하여 고유한 단편화 패턴을 기반으로 TA 구조에 주석을 달고 분류하는 LC-MS/MS 기반 스크리닝 워크플로우를 개발했습니다. 데이터 의존형(DD) 제품 이온 스캔, 전구체 이온 스캔(PrIS) 및 중성 손실 스캔(NLS)의 조합을 사용하여 이 방법을 밤나무 Datura stramonium 및 Datura metel 의 TA가 풍부한 추출물에 적용했습니다.이 방법은 빠르고 민감하며, 복잡한 TA 함유 샘플의 예비 복제 제거와 분리, 정제(및 최종 생물학적 분석)를 위한 새로운 후보 물질의 발견에 성공적으로 사용되었습니다.

서문

최근 수십 년 동안 완전 합성 분자가 신약 개발에서 더욱 두드러지게 되었지만, 지난 39년 동안 승인된 모든 약물의 거의 3분의 2가 천연 제품 또는 천연 제품에서 영감을 받은 약물입니다.^1,2  이는 천연 제품 연구의 지속적인 중요성을 강조합니다. 특정 질소 함유 천연 제품인 알칼로이드는 특히 의약 특성으로 인해 높이 평가됩니다. [3.2.1.]을 포함하는 트로판 알칼로이드(TA)-이환 질소 함유 시스템은 주로 Solanaceae (nightshade), Erythroxylaceae 및 Convolvulaceae 계통의 식물에 의해 생산됩니다. 예로는 아트로핀, 스코폴라민 및 코카인이 있습니다. 여러 반합성 또는 합성 트로판도 임상적으로 사용됩니다³. TA와 그 유도체는^{많은 질환을} 치료하는 데 사용되며^3,4 이러한 약물 중 일부는 WHO의 2023년 필수 의약품 목록(List of Essential Medicines)에 등재되어 있습니다

프로토콜

주의: 나열된 화학 물질을 사용하기 전에 모든 관련 물질안전보건자료(MSDS)를 참조하십시오.

1. 시료 전처리

주의: 액체 질소는 극저온 화상을 유발할 수 있습니다. 환기가 잘 되는 곳에서 극저온 장갑과 보안경을 사용하십시오. 알칼로이드 함유 식물 샘플은 피부에 자극을 줄 수 있습니다. 항상 장갑으로 다루십시오. 메탄올은 독성이 있고 가연성이므로 잠재적인 발화원에서 멀리 떨어진 흄 후드에서 취급해야 합니다.

참고: 이론적으로 재배 또는 야생 식물 조직을 사용할 수 있습니다(건조 또는 신선하게 분쇄). 아래 절차는 분석법 개발 중에 사용되는 절차입니다.

1. 관심 있는 식물 조직이 신선하면 폴리프로필렌 원추형 튜브에 넣고 액체 질소에 2-3분 동안 담가 얼립니다.
2. 얼어 붙은 식물 조직을 미리 냉각 된 모르타르 (액체 질소가 들어간 폴리스티렌 쿨러에)에 넣고 미리 냉각 된 유봉을 사용하여 조직을 균일 한 분말로 갈아줍니다.
3. 미리 냉각된 주걱을 사용하여 원하는 양의 조직을 중량이 측정된 폴리프로필렌 미세 원심분....

토론

프로토콜에 제공된 계측기 매개변수는 만족스러운 성능을 허용하지만 이 방법을 성공적으로 사용하려면 몇 가지 중요한 단계에 세심한 주의를 기울이거나 최적화해야 할 수 있습니다. 2.2단계에서 제공된 HPLC 용매 그래디언트는 일반적으로 트로판 알칼로이드에 적합하지만, 시료 또는 검사 중인 식물 종의 트로판 알칼로이드 프로파일에 따라 수정해야 할 수도 있습니다........

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile, For UHPLC, suitable for mass spectometry	Sigma-Aldrich	900667	HPLC solvent
Argon gas	AirGas	AR UHP300	CID gas
Formic acid, 99% for analysis	Thermo Scientific	AC270480010	HPLC additive
Guard column holder	Restek	25812
HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D Plus	Shimadzu	228-65802-58	HPLC column
LCMS, Shimdazu LCMS-8045	Shimadzu	225-31800-44	Mass spectrometer; we ran LabSolutions software, which is standard for Shimadzu instruments
Liquid nitrogen	AirGas	NI 180LT22
Methanol, for HPLC/UHPLC/LCMS	VWR	BDH 85800.400	For making extraction solvent
Microcentrifuge	VWR	2400-37
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Mortar	Fisher Scientific	FB961C	For grinding plant tissues
Pestle	Fisher Scientific	FB961M	For grinding plant tissues
Pipette 1000 mL	Gilson	F144059M
Pipette tip 1000 mL	Fisher scientific	02-707-404
Plant tissues	Various sources	N/A	Can be anything wild or cultivated
Polypropylene conical tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-4
Polystyrene cooler	ULINE	S-18312	The type of coolers that reagents for molecular biology are shipped in would be appropriate
Roc C18 3 µm, 100 mm x 4.6 mm	Restek	9534315	HPLC column
Roc C18, 10 mm x 4 mm	Restek	953450210	Guard column
Rocking shaker	Themo Scientific	11-676-680
Screw thread vial convenience kit (9 mm)	Fisher scientific	13-622-190	LCMS autosampler vials
Syringe, 3 mL	Fisher Scientific	03-377-27
Syringe filter 0.45 µm	Avantor/VWR	76479-008
Water, for use in liquid chromatography and mass spectrometry	JT Baker	9831-03	For making extraction solvent
Water solution, contains 0.1% v/v formic acid, For UHPLC, suitable for mass spectometry	Sigma-Aldrich	900687-1L	HPLC solvent