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요약

트로판 알칼로이드의 고속 질량 분석법(MS)/질량 분석법(MS) 기반 주석 및 분류를 위한 방법을 제시하며, 이는 트로판 함유 샘플의 예비 복제 및 분리를 위한 새로운 알칼로이드의 발견 모두에 유용합니다.

초록

오늘날 사용되는 많은 약물이 합성 원료이지만, 천연 제품은 여전히 새로운 화학적 다양성과 생체 활성의 풍부한 원천을 제공하며 내성 또는 신종 질병에 대한 유망한 단서를 제공할 수 있습니다. 그러나 도전 과제는 두 가지입니다: 연구자들은 천연 제품을 찾고 그 구조를 밝혀야 할 뿐만 아니라 분리하고 분석할 가치가 있는 것(그리고 이미 알려진 것 - 역복제라고 알려진 프로세스)을 식별해야 합니다. 최신 분석 기기의 출현으로 천연물 발견 및 복제 해제의 속도가 가속화되었습니다. 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법(LC-MS/MS)은 화학 구조를 식별하고 분류하는 데 특히 유용한 기술이 되었습니다. 트로판 알칼로이드(TA)는 의학 및 독성학적으로 중요한 식물 유래 화합물입니다. 이 연구에서는 QQQ(Triple-Quadrupole) 질량분석기에서 사용할 수 있는 여러 MS/MS 구성을 활용하여 고유한 단편화 패턴을 기반으로 TA 구조에 주석을 달고 분류하는 LC-MS/MS 기반 스크리닝 워크플로우를 개발했습니다. 데이터 의존형(DD) 제품 이온 스캔, 전구체 이온 스캔(PrIS) 및 중성 손실 스캔(NLS)의 조합을 사용하여 이 방법을 밤나무 Datura stramonium 및 Datura metel 의 TA가 풍부한 추출물에 적용했습니다.이 방법은 빠르고 민감하며, 복잡한 TA 함유 샘플의 예비 복제 제거와 분리, 정제(및 최종 생물학적 분석)를 위한 새로운 후보 물질의 발견에 성공적으로 사용되었습니다.

서문

최근 수십 년 동안 완전 합성 분자가 신약 개발에서 더욱 두드러지게 되었지만, 지난 39년 동안 승인된 모든 약물의 거의 3분의 2가 천연 제품 또는 천연 제품에서 영감을 받은 약물입니다.1,2  이는 천연 제품 연구의 지속적인 중요성을 강조합니다. 특정 질소 함유 천연 제품인 알칼로이드는 특히 의약 특성으로 인해 높이 평가됩니다. [3.2.1.]을 포함하는 트로판 알칼로이드(TA)-이환 질소 함유 시스템은 주로 Solanaceae (nightshade), Erythroxylaceae 및 Convolvulaceae 계통의 식물에 의해 생산됩니다. 예로는 아트로핀, 스코폴라민 및 코카인이 있습니다. 여러 반합성 또는 합성 트로판도 임상적으로 사용됩니다3. TA와 그 유도체는많은 질환을 치료하는 데 사용되며3,4 이러한 약물 중 일부는 WHO의 2023년 필수 의약품 목록(List of Essential Medicines)에 등재되어 있습니다5. 그들의 유력한 활동 때문에, TAs는 또한 레크리에이션 (자극제 또는 정신 착란제로) 사용되며 그들을 포함하는 식물 (또는 제제)의 섭취시 중독을 일으킬 수 있습니다 6,7. TA는 인간과 동물의 식품에서 바람직하지 않으며8 차, 향신료, 곡물, 꿀 및 허브 보충제를 오염시킬 수 있습니다 9,10. 의학적 가능성과 독 중독 능력으로 인해 새로운 TA의 발견(및 알려진 TA의 식별)에 도움이 될 수 있는 분석 방법이 유용합니다.

탠덤 질량 분석법(MS/MS)에서 "질량 필터"(예: 사중극자, ToF(Time-of-Flight) 튜브)는 물리적으로 함께 결합되거나("공간 내") 기기가 추가적인 "시간 내" 반응/분리 단계를 사용합니다. 공간 내 MS/MS는 서로 다른 모드를 사용하여 서로 다른 질량 필터(예: 삼중 사중극자 또는 QQQ 기기의 사중극자)에서 서로 다른 이온을 선택하고 단편화합니다. 이러한 다양한 모드를 사용하여 주어진 이온에 의해 어떤 특정 단편이 만들어지는지(생성물 이온 스캔), 시료의 어떤 이온이 특정 단편을 생성하거나(전구체 이온 스캔 또는 PrIS) 특성 질량의 손실을 겪는지(중성 손실 스캔 또는 NLS) 또는 어떤 특정 화합물이 어떤 특정 단편을 가지고 있는지(다중 반응 모니터링)를 확인할 수 있습니다. 따라서 MS/MS는 새로운 화합물에 대한 구조를 제안하거나 기존 화합물의 존재를 확인하는 데 유용한 단편을 제공합니다. MS/MS는 약물 발견, 천연물 화학 및 대사체학 분야에서 점점 더 많이 사용되고 있으며,11,12 알칼로이드 함유 종을 프로파일링하고(식물화학적 특성 분석 또는 화학분류학 분석을 위해) 식품 또는 약용 식물에서 특정 알칼로이드를 검출 및 정량화하는 데 사용되었습니다 10,13,14,15,16.

사용할 수 있는 많은 질량 분석 기술에도 불구하고 새로운 알칼로이드를 찾는 데 어려움이 있습니다. 스크리닝할 후보 유기체를 찾는 것 외에도 알칼로이드의 완전한 구조적 확인은 다양한 분석 기술을 포함할 수 있는 힘든 과정입니다. 또한 연구원들은 노동력, 시간 및 자원을 낭비하는 이미 알려진 화합물을 분리할 수 있습니다. 이는 수천 개는 아니더라도 수백 개의 TA가 보고되는 TA의 경우 특히 어려우며, 그 중 다수는 서로 이성질체입니다. "알려진 것을 식별하고 알려지지 않은 것과 구별"하는 과정을 복제 (dereplication)라고 합니다. 이 과정을 돕기 위해 다양한 TA 및 기타 화합물의 머무름 시간(r.t.s) 및 질량 단편에 대한 데이터베이스가 게시됩니다17,18. 그럼에도 불구하고 복제 해제는 힘들다. 시료의 전체 LC-MS/MS 크로마토그램에서 알칼로이드에 주석을 달는(즉, 추정 구조를 할당하는 것)하는 것만으로도 시간이 많이 걸립니다. 최근에는 벤질이소퀴놀린, 모노테르펜 인돌 및 트로판 알칼로이드에 대해 분자 네트워킹1 9,20 및 수동 복제 18,21,22가 사용되었으며, PrIS는 피롤리지딘 및 솔라닌 유형 알칼로이드를 식별하기 위한 스펙트럼의 "구조적 필터링"에 사용되었습니다 23,24. 그러나 TA가 쉽게 식별할 수 있는 공통 단편을 가지고 있더라도 TA 함유 샘플의 신속한 LC-MS/MS 기반 복제에 사용할 수 있는 특정 분석법이나 워크플로우는 없습니다(그림 1). 여기에 설명된 분석법은 데이터 의존적(DD) 생성물 이온 스캔, PrIS 및 NLS의 조합을 사용하여 단일, 이산 및 삼치환 트로판에 대한 고유한 단편화 패턴(그림 1A)과 이러한 알칼로이드에서 발견되는 공통 에스테르 그룹의 손실(그림 1B)을 기반으로 식물의 TA 구조에 주석을 달고 분류합니다. 연구 유기체는 밤나무 속 Datura의 여러 종입니다. 다양한 TA의 풍부한 공급원인 Datura는 세계 역사 전반에 걸쳐 의학 및 문화 목적으로 사용되어 왔으며17- 구조적으로 유사한 수많은 TA로 인해 복제를 제거하기 어려운 매트릭스로, 당사의 방법을 테스트할 수 있는 매력적인 샘플을 제공합니다.

프로토콜

주의: 나열된 화학 물질을 사용하기 전에 모든 관련 물질안전보건자료(MSDS)를 참조하십시오.

1. 시료 전처리

주의: 액체 질소는 극저온 화상을 유발할 수 있습니다. 환기가 잘 되는 곳에서 극저온 장갑과 보안경을 사용하십시오. 알칼로이드 함유 식물 샘플은 피부에 자극을 줄 수 있습니다. 항상 장갑으로 다루십시오. 메탄올은 독성이 있고 가연성이므로 잠재적인 발화원에서 멀리 떨어진 흄 후드에서 취급해야 합니다.

참고: 이론적으로 재배 또는 야생 식물 조직을 사용할 수 있습니다(건조 또는 신선하게 분쇄). 아래 절차는 분석법 개발 중에 사용되는 절차입니다.

  1. 관심 있는 식물 조직이 신선하면 폴리프로필렌 원추형 튜브에 넣고 액체 질소에 2-3분 동안 담가 얼립니다.
  2. 얼어 붙은 식물 조직을 미리 냉각 된 모르타르 (액체 질소가 들어간 폴리스티렌 쿨러에)에 넣고 미리 냉각 된 유봉을 사용하여 조직을 균일 한 분말로 갈아줍니다.
  3. 미리 냉각된 주걱을 사용하여 원하는 양의 조직을 중량이 측정된 폴리프로필렌 미세 원심분리기 튜브에 빠르게 계량하고 조직 100mg당 1mL 농도로 20% 메탄올(실온[RT]에서)을 즉시 추가합니다.
    참고 : 메탄올 (20 %)은 일반적으로 TA25를 추출하는 데 사용됩니다. 때때로 0.1% 포름산이 첨가되지만 이 방법과 다른 방법의 개발 중에 추출 효율의 차이는 관찰되지 않았습니다.
  4. 뚜껑이 있는 튜브를 RT에서 최소 3시간 동안 흔들리는 셰이커(중간 속도)에 놓습니다.
  5. 튜브를 9464 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 LC-MS 자동시료주입기 바이알에 피펫팅하여 넣거나, 그래도 흐리면 먼저 0.45μm 주사기 필터를 통해 여과합니다.
    참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있지만, 가공된 신선한 식물 샘플 및 추출물은 잠재적인 알칼로이드 분해를 방지하기 위해 분석 전에 -80°C 냉동고에 보관해야 합니다.

2. LC-MS 기기 구성 및 데이터 수집

주의: 아세토니트릴은 독성이 있고 가연성입니다. 발화원에서 멀리 유지하고 흄 후드를 사용하여 증기를 제어하십시오. 포름산은 부식성입니다. 피부와 눈의 접촉을 피하고 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.

  1. 전기분무 이온화(ESI) 소스 및 역상 HPLC 컬럼(C18, 4.6 x 100mm)과 함께 LC-MS 기기를 사용합니다.
  2. HPLC의 경우 H2O의 0.1 % 포름산을 용매 A로 사용하고 아세토 니트릴의 0.1 % 포름산을 용매 B로 사용합니다. 컬럼을 99% A 및 1% B로 평형화합니다. 26분 동안 1%-50% B의 30분 그래디언트를 구성하고 26.01분에 1% B로 돌아가고 4분 동안 1% B를 유지합니다. 45°C의 컬럼 오븐 온도와 0.5mL/분의 유속을 사용하십시오.
  3. LC-MS 분석법에서는 질량분석기에 대해 인터페이스 전압: 4.0kV, 분무 가스 유량: 3L/min, 가열 가스 유량: 10L/min, DL 온도: 250°C, 히트블럭 온도: 400°C, 인터페이스 온도: 300°C, 건조 가스 유량: 10L/min, 충돌 유도 해리(CID) 가스(아르곤) 압력 17kPa의 작동 매개변수를 사용합니다.
  4. 자동 동위원소 배제가 활성화된 상태에서 Q3 스캔과 Q1 스캔(100-1000 Da)을 모두 포함하는 ESI 포지티브 모드에서 MS 분석법을 구축하여 조사 이벤트(LC 분석법의 길이로 설정)로 작동합니다. 50-1000 Da의 질량 창, -20 V의 충돌 셀 에너지 및 <0.2 s의 이벤트 시간을 가진 Q1 스캔(DD 분석)의 종속 이벤트로 제품 이온 스캔을 포함합니다.
    참고: Q1의 DD 제품 이온 스캔을 트리거하기 위한 계수 임계값은 가변적일 수 있지만 일반적으로 7,000-10,000 카운트 수준이 사용됩니다. 이 방법을 개발하는 데 사용된 것과 같은 일부 기기에서 Q3 스캔은 Q1보다 더 큰 질량 정확도와 감도를 제공하며 Q1 스캔에서 관찰된 이온을 확인하기 위해 포함되지만 2.4단계에서 문제 없이 생략할 수 있습니다.
  5. 위의 MS 분석법에 충돌 셀 에너지가 -20V이고 이벤트 시간이 0.75초인 LC 분석법의 길이와 동일한 포지티브 모드 PrIS를 추가합니다. 모든 경우에 Automatic Isotope Exclude(자동 동위원소 제외) 또는 De-isotoping(탈동위원소) 기능이 활성화되어 있는지 확인하십시오. TA 단편(Da의 경우 그림 1A 참조)에 대한 관심 m/z 값이 124.1(단일치환 TA의 경우, 125-1000Da의 질량 윈도우), 122.1 및 140.1(이치환 TA의 경우, 각각 123 및 141Da에서 시작하는 질량 윈도우) 및 156.1 및 138.1(삼치환 TA의 경우, 157 및 139Da에서 시작하는 질량 윈도우)인지 확인합니다. 각기).
    참고: 분석법 개발 중에 PrIS는 두 가지 다른 분석법으로 분할되었는데, 하나는 mono- 및 disubstituted TAs에 대한 것이고 다른 하나는 trisubstituted TAs에 대한 것이지만, 어떤 방식으로든 분할하거나 결합할 수 있습니다.
  6. 2.4단계의 매개 변수를 포함하는 두 번째 MS 메서드를 빌드합니다.
    1. 이 MS/MS 분석법에 LC 분석법의 길이와 동일한 포지티브 모드 NLS를 추가하고 충돌 셀 에너지는 -20V, 이벤트 시간은 0.75초를 제공합니다. 모든 경우에 Automatic Isotope Exclude(자동 동위원소 제외) 또는 De-isotoping(탈동위원소) 기능이 활성화되어 있는지 확인하십시오.
    2. TA의 에스테르에 대한 관심 중성 손실 질량 (Da, 그림 1B 참조)이 100.05 (티글산에서 파생 된 에스테르의 경우, 110-1000 Da의 질량 창), 60.03 (아세틸 그룹의 경우, 100-1000 Da의 질량 창) 및 166.06 (페닐 락틱 또는 트로픽 산 에스테르, 170-1000 Da의 질량 창)인지 확인하십시오.
  7. LC-MS 분석법을 다운로드하고 관심 시료에 대한 데이터 파일을 생성합니다. HPLC 컬럼이 45°C에서 평형을 이루면 서로 다른 종 또는 조직 유형 간에 적절한 추출 용매 블랭크를 사용하여 배치 또는 프로젝트 파일에서 관심 샘플을 실행합니다. 일반적인 주입 부피는 10-20 μL입니다.
    알림: 특히 높은 볼륨에서는 질량 분석기 검출기가 포화 상태일 수 있습니다. 매우 농축된 샘플을 실행하는 경우 ESI 소스를 청소하고 기기를 정기적으로 조정해야 합니다. 모든 데이터가 수집된 후 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

3. 데이터 분석

  1. Q1 및 Q3 스캔의 총 이온 크로마토그램(및 DD 제품 이온 스캔)을 검사하고 TA와 유사한 기능을 가진 풍부한 이온의 모체 질량을 확인합니다: a) 질량 <[M+H]+ 이온의 경우 500Da, 일반적으로 균일한 질량, b) 위의 LC 방법을 사용하여 2-22분 사이의 일반적인 r.t.s 및 c) 다음 목록의 단편. m/z 93, 124, 142, 140, 122, 138, 156, 174, 110 또는 128Da.
  2. m/z 124에 대한 PrIS 크로마토그램/채널을 검사하고 어떤 피크/이온이 어떤 r.t.s(3.1단계에서 기록됨)가 이 단편을 생성하는지 확인합니다. 클릭으로 크로마토그램을 스캔별로 스캔할 수 있을 뿐만 아니라 DD 제품 이온 스캔에서 얻은 전체 MS/MS 스펙트럼을 검사할 수 있으며, 특히 저농도 종의 경우 더욱 그렇습니다.
    참고: 이 단편을 포함하는 실제 종은 여러 스캔에 대해 존재하며 Q1 및 Q3 스캔 모두에 나타납니다(후자가 사용되는 경우). 스프레드시트는 주석을 지원하기 위해 지원 정보(보충 파일 1)에 첨부됩니다.
  3. 다른 PrIS 크로마토그램에 대해 3.2단계를 반복합니다. m/z 122 및 140은 모두 이치환된 TA를 나타내고 m/z (138 및 156)는 모두 삼치환된 TA를 나타내므로 이러한 크로마토그램/채널을 함께 검사하십시오.
  4. m/z 100, 60 및 166에 대한 NLS 크로마토그램/채널을 검사하고 r.t.s(3.1단계에서 기록됨)가 이러한 중성 손실을 생성하는 피크/이온을 확인합니다. PrIS와 마찬가지로 크로마토그램을 스캔별로 클릭하고 DD 산물 이온 스캔에서 얻은 단편화와 비교하며, 특히 저농도 종의 경우 더욱 그렇습니다.
  5. DD 제품 이온 스캔 결과에 의해 지원되는 PrIS 및 NLS 데이터의 조합을 사용하여 가장 작은 트로판 질량(예: 124, 122 또는 138)과 중성 손실을 추가한 다음 나머지 남은 질량을 고려하여 관찰된 알칼로이드에 대한 추정 주석을 만듭니다.
    참고: TA(및 Da의 질량)를 치환하는 일반적인 그룹은 하이드록실(18), 아세틸(60), 프로피오닐(74), 이소부티릴(88), 티글로일(100), 포화 티글로일/2-메틸부티릴(102) 또는 페닐락테이트/트로픽산(166)입니다.
  6. 알칼로이드에 대한 주석을 문헌17 및 데이터베이스(예: MoNA)26 에 보고된 것과 비교하여 어떤 TA 치환 패턴이 보고되는지(그리고 잠재적으로 새로운 패턴인지)를 결정합니다. 또한 상업적으로 확인할 수 있는 일부 일반적인 트로판 알칼로이드(예: 아트로핀, 리토린, 스코폴라민)의 표준물질을 사용하십시오.
  7. 저농도 시료에 대한 추가 구조 정보(PrIS 및 NLS는 종속 이벤트 임계값 이하로 이온을 포착할 수 있음)를 위해 더 농축된 시료에서 특정 생성물 이온 스캔(관심 질량을 전구체 이온으로 활용)을 수집하십시오.
    참고: 이 방법은 저해상도 QQQ 기기에서 개발되었습니다. 모든 추정 가능한 새로운 화합물의 경우 정확한 질량 스펙트럼을 얻기 위해 고분해능 MS 기기를 사용해야 합니다.

결과

이 방법의 효과를 입증하기 위해 TA의 표준 혼합물(아세틸트로핀/아세틸슈도트로핀 혼합물[단일치환] 각각 10μg/mL, 히오시아민[단일치환], 리토린[단일치환] 및 스코폴라민[삼치환]과 함께 2개의 아니소다민 이성질체[이치환]의 혼합물 각각 10μg/mL)을 양성 대조군으로 분석했습니다(그림 2). 전체 Q1 스캔 크로마토그램(기본 피크 크로마토그램 보기에 ?...

토론

프로토콜에 제공된 계측기 매개변수는 만족스러운 성능을 허용하지만 이 방법을 성공적으로 사용하려면 몇 가지 중요한 단계에 세심한 주의를 기울이거나 최적화해야 할 수 있습니다. 2.2단계에서 제공된 HPLC 용매 그래디언트는 일반적으로 트로판 알칼로이드에 적합하지만, 시료 또는 검사 중인 식물 종의 트로판 알칼로이드 프로파일에 따라 수정해야 할 수도 있습니다....

공개

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 교수 연구 보조금(Northern Michigan University, M.A.C.에 수여), 학부 연구 펠로우십(Northern Michigan University, J.C.에 수여) 및 화학과에서 자금을 지원받았습니다. 저자들은 식물 조직 준비를 도와준 John Berger(NMU), LC-MS 유지 관리 및 문제 해결 지원을 제공한 Hannah Hawkins(NMU), 아세틸트로핀 혼합물을 준비해 준 Ryan Fornwald 박사와 그의 CH 495(Natural Products Synthesis) 학생들에게 감사를 표하고자 합니다. 저자들은 또한 고분해능 MS/MS 스펙트럼을 획득한 Daniel Jones 박사(Michigan State University)에게 감사의 뜻을 전합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetonitrile, For UHPLC, suitable for mass spectometrySigma-Aldrich900667HPLC solvent
Argon gasAirGasAR UHP300CID gas
Formic acid, 99% for analysisThermo ScientificAC270480010HPLC additive
Guard column holderRestek25812
HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D PlusShimadzu228-65802-58HPLC column
LCMS, Shimdazu LCMS-8045Shimadzu225-31800-44Mass spectrometer; we ran LabSolutions software, which is standard for Shimadzu instruments
Liquid nitrogenAirGasNI 180LT22
Methanol, for HPLC/UHPLC/LCMSVWRBDH 85800.400For making extraction solvent
Microcentrifuge VWR2400-37
Microcentrifuge tubes, 1.5 mLFisher Scientific05-408-129
Mortar Fisher ScientificFB961CFor grinding plant tissues
PestleFisher ScientificFB961MFor grinding plant tissues
Pipette 1000 mLGilson F144059M
Pipette tip 1000 mLFisher scientific02-707-404
Plant tissuesVarious sourcesN/ACan be anything wild or cultivated
Polypropylene conical tubes, 15 mLFisher Scientific05-539-4
Polystyrene coolerULINES-18312The type of coolers that reagents for molecular biology are shipped in would be appropriate
Roc C18 3 µm, 100 mm x 4.6 mmRestek9534315HPLC column
Roc C18, 10 mm x 4 mmRestek953450210Guard column
Rocking shakerThemo Scientific11-676-680
Screw thread vial convenience kit (9 mm)Fisher scientific13-622-190LCMS autosampler vials
Syringe, 3 mLFisher Scientific03-377-27
Syringe filter 0.45 µm Avantor/VWR76479-008
Water, for use in liquid chromatography and mass spectrometryJT Baker9831-03For making extraction solvent
Water solution, contains 0.1% v/v formic acid, For UHPLC, suitable for mass spectometrySigma-Aldrich900687-1LHPLC solvent

참고문헌

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