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Resumo

Apresentamos um método para anotação e classificação rápida baseada em espectrometria de massa (MS) / espectrometria de massa (MS) de alcalóides tropanos, útil tanto para a desreplicação preliminar de amostras contendo tropano quanto para a descoberta de novos alcalóides para isolamento.

Resumo

Embora muitos medicamentos utilizados hoje sejam de origem sintética, os produtos naturais ainda fornecem uma rica fonte de nova diversidade química e bioatividade e podem produzir pistas promissoras para doenças resistentes ou emergentes. O desafio, no entanto, é duplo: não apenas os pesquisadores devem encontrar produtos naturais e elucidar suas estruturas, mas também identificar o que vale a pena isolar e testar (e o que já é conhecido - um processo conhecido como desreplicação). Com o advento da instrumentação analítica moderna, o ritmo de descoberta e desreplicação de produtos naturais acelerou. A cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) tornou-se uma técnica especialmente valiosa para identificar e classificar estruturas químicas. Os alcalóides do tropano (TAs) são compostos derivados de plantas de grande importância medicinal e toxicológica. Neste estudo, desenvolvemos um fluxo de trabalho de triagem baseado em LC-MS/MS utilizando as múltiplas configurações de MS/MS disponíveis em um espectrômetro de massa triplo-quadrupolo (QQQ) para anotar e classificar estruturas de TA com base em seus padrões de fragmentação distintos. Usando uma combinação de varreduras de íons de produto dependentes de dados (DD), varreduras de íons precursores (PrIS) e varreduras de perda neutra (NLS), aplicamos esse método a extratos ricos em TA das solanáceas Datura stramonium e Datura metel. Este método é rápido, sensível e foi empregado com sucesso tanto para a desreplicação preliminar de amostras complexas contendo TA quanto para a descoberta de um novo candidato para isolamento, purificação (e eventual bioensaio).

Introdução

Embora as moléculas totalmente sintéticas tenham se tornado mais proeminentes na descoberta de medicamentos nas últimas décadas, quase dois terços de todos os medicamentos aprovados nos últimos 39 anos são produtos naturais ou inspirados em produtos naturais,1,2  ressaltando a importância contínua da pesquisa de produtos naturais. Os alcalóides, certos produtos naturais que contêm nitrogênio, são especialmente valorizados por suas propriedades medicinais. Os alcaloides do tropano (TA) que contêm o [3.2.1.]-sistema bicíclico contendo nitrogênio, são produzidos principalmente por plantas das famílias Solanaceae (beladona), Erythroxylaceae e Convolvulaceae. Exemplos incluem atropina, escopolamina e cocaína; Múltiplos tropanos semi-sintéticos ou sintéticos também são usados clinicamente3. Os ATs e seus derivados são usados para tratar muitas condições 3,4 e vários desses medicamentos aparecem na Lista de Medicamentos Essenciais de 2023 da OMS5. Devido às suas atividades potentes, os ATs também são usados para fins recreativos (como estimulantes ou delirantes) e podem causar intoxicação ao ingerir plantas (ou preparações) que os contenham 6,7. Os ATs são indesejáveis na alimentação humana e animal8 e podem contaminar chás, especiarias, grãos, mel e suplementos de ervas 9,10. Por causa de sua promessa medicinal e capacidade de envenenar, métodos analíticos que podem ajudar na descoberta de novos ATs (e identificação de ATs conhecidos) são úteis.

Na espectrometria de massa em tandem (MS/MS), "filtros de massa" (por exemplo, quadrupolos, tubos de tempo de voo) são acoplados fisicamente ("no espaço"), ou um instrumento emprega etapas adicionais de reação/separação "no tempo". O MS/MS no espaço usa modos diferentes para selecionar e fragmentar diferentes íons nos diferentes filtros de massa (por exemplo, os quadrupolos de um instrumento triplo-quadrupolo ou QQQ). Esses diferentes modos podem ser usados para determinar quais fragmentos específicos são feitos por um determinado íon (varredura de íons de produto), quais íons em uma amostra produzem certos fragmentos (varredura de íons precursores ou PrIS) ou sofrem perdas de uma massa característica (varredura de perda neutra ou NLS), ou quais compostos específicos possuem quais fragmentos específicos (monitoramento de reações múltiplas). MS/MS, portanto, fornece fragmentos que são úteis para propor estruturas para novos compostos ou confirmar a presença de um composto existente. MS / MS é cada vez mais usado nos campos de descoberta de medicamentos, química de produtos naturais e metabolômica11 , 12 , e tem sido usado para traçar perfis de espécies contendo alcalóides (para caracterização fitoquímica ou análise quimiotaxonômica) e para detectar e quantificar alcalóides específicos em alimentos ou plantas medicinais10 , 13 , 14 , 15 , 16 .

Apesar das muitas técnicas de espectrometria de massa disponíveis, existem desafios para encontrar novos alcalóides. Além de encontrar um organismo candidato para triagem, uma confirmação estrutural completa de um alcalóide é um processo árduo que pode incluir muitas técnicas analíticas diferentes. Além disso, os pesquisadores poderiam isolar um composto que já é conhecido, desperdiçando trabalho, tempo e recursos. Isso é especialmente difícil para os ATs, onde centenas, senão milhares de ATs, muitos dos quais são isoméricos entre si, são relatados. O processo de "identificar os conhecidos e distingui-los dos desconhecidos" é conhecido como desreplicação. Bancos de dados dos tempos de retenção (r.t.s) e fragmentos de massa de diferentes ATs e outros compostos são publicados para auxiliar nesse processo 17,18. No entanto, a desreplicação é trabalhosa; apenas anotar (ou seja, atribuir estruturas putativas) aos alcalóides em todo o cromatograma LC-MS/MS de uma amostra é demorado. Recentemente, tanto a rede molecular1 9,20 quanto a replicação manual18,21,22 foram usadas para alcalóides benzilisoquinolina, monoterpeno indol e tropano, e PrISs foram usados para "filtragem estrutural" de espectros para identificar alcalóides do tipo pirrolizidina e solanina23,24. No entanto, não há métodos ou fluxos de trabalho específicos disponíveis para a desreplicação rápida baseada em LC-MS/MS de amostras contendo TA, embora os TAs possuam fragmentos comuns e facilmente identificáveis (Figura 1). O método descrito aqui usa uma combinação de varreduras de íons de produto dependentes de dados (DD), PrISs e NLSs para anotar e classificar estruturas de TA em plantas com base nos padrões de fragmentação distintos para tropanos mono, di e trissubstituídos (Figura 1A) e nas perdas de grupos de ésteres comuns encontrados nesses alcalóides (Figura 1B). Os organismos de estudo são várias espécies do gênero Datura. Uma rica fonte de diversos ATs, Datura tem sido usado ao longo da história do mundo para fins medicinais e culturais17- e é uma matriz desafiadora para se replicar por causa de seus numerosos ATs estruturalmente semelhantes, fornecendo-nos amostras atraentes para testar nosso método.

Protocolo

CUIDADO: Consulte todas as fichas de dados de segurança do material (MSDS) relevantes antes de usar os produtos químicos listados.

1. Preparação da amostra

CUIDADO: O nitrogênio líquido pode causar queimaduras criogênicas. Use luvas criogênicas e proteção para os olhos em uma área bem ventilada. Amostras de plantas contendo alcalóides podem ser irritantes para a pele; Sempre manuseie-os com luvas. O metanol é tóxico e inflamável e deve ser manuseado em uma capela de exaustão longe de possíveis fontes de ignição.

NOTA: Em teoria, podem ser utilizados tecidos vegetais cultivados ou silvestres (secos ou moídos frescos); O procedimento abaixo é exatamente aquele utilizado durante o desenvolvimento do método.

  1. Se o tecido vegetal de interesse for fresco, congele-o colocando-o em um tubo cônico de polipropileno e imergindo-o em nitrogênio líquido por 2-3 min.
  2. Coloque o tecido vegetal congelado em um almofariz pré-resfriado (em um refrigerador de poliestireno com nitrogênio líquido) e, usando um pilão pré-resfriado, triture o tecido até obter um pó uniforme.
  3. Pese rapidamente a quantidade desejada de tecido em um tubo de microcentrífuga de polipropileno usando uma espátula pré-resfriada e adicione imediatamente 20% de metanol (à temperatura ambiente [RT]) a uma concentração de 1 mL por cada 100 mg de tecido.
    NOTA: O metanol (20%) é comumente usado para extrair TAs25. Ocasionalmente, é adicionado ácido fórmico a 0,1%, embora nenhuma diferença na eficiência de extração tenha sido observada durante o desenvolvimento deste método e de outros.
  4. Coloque os tubos tampados em um agitador de balanço (velocidade média) por um mínimo de 3 h em RT.
  5. Centrifugue os tubos a 9464 x g por 10 min. Pipetar o sobrenadante para um frasco para injetáveis de amostrador automático LC-MS ou, se ainda estiver turvo, filtrar primeiro através de um filtro de seringa de 0,45 μm.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui, embora amostras e extratos de plantas frescas processadas devam ser armazenados em um freezer a -80 ° C antes da análise para evitar qualquer degradação potencial de alcalóides.

2. Configuração do instrumento LC-MS e coleta de dados

CUIDADO: A acetonitrila é tóxica e inflamável; Mantenha-se afastado de fontes de ignição e controle os vapores usando uma hotte. O ácido fórmico é corrosivo; Evite o contato com a pele e os olhos e use equipamento de proteção individual adequado.

  1. Use um instrumento LC-MS com uma fonte de ionização por eletrospray (ESI) e uma coluna de HPLC de fase reversa (C18, 4,6 x 100 mm).
  2. Para HPLC, use ácido fórmico a 0,1% em H2O como solvente A e ácido fórmico a 0,1% em acetonitrila como solvente B; equilibre a coluna com 99% A e 1% B. Configure um gradiente de 30 min de 1%-50% B ao longo de 26 min, retornando a 1% B em 26,01 min e mantendo em 1% B por 4 min. Use uma temperatura de forno de coluna de 45 °C e uma vazão de 0.5 mL/min.
  3. No método LC-MS, use os seguintes parâmetros operacionais para o espectrômetro de massa: tensão de interface: 4,0 kV, fluxo de gás de nebulização: 3 L/min, fluxo de gás de aquecimento: 10 L/min, temperatura DL: 250 °C, temperatura do bloco de calor: 400 °C, temperatura de interface: 300 °C, fluxo de gás de secagem: 10 L/min e pressão de gás (argônio) de dissociação induzida por colisão (CID) de 17 kPa.
  4. Crie um método MS no modo positivo ESI que inclua uma varredura Q3 e uma varredura Q1 (100-1000 Da) que funcione como um evento de pesquisa (definido para o comprimento do método LC), com exclusão automática de isótopos habilitada. Inclua uma varredura de íons de produto como um evento dependente da varredura Q1 (análise DD), com uma janela de massa de 50-1000 Da, uma energia de célula de colisão de -20 V e um tempo de evento de <0,2 s.
    NOTA: O limite de contagem para acionar a varredura de íons do produto DD do Q1 pode ser variável, mas normalmente, um nível de 7.000 a 10.000 contagens é usado. Em alguns instrumentos, como o usado para desenvolver o método, a varredura Q3 fornece maior precisão e sensibilidade de massa do que Q1 e é incluída para confirmar os íons observados na varredura Q1, embora possa ser omitida da etapa 2.4 sem problemas.
  5. Ao método MS acima, adicione PrISs de modo positivo igual ao comprimento do método LC com energias de célula de colisão de -20 V e tempos de evento de 0,75 s. Certifique-se de que, em todos os casos, as funções de exclusão automática de isótopos ou desisótopos estejam ativadas. Assegurar que os valores m/z de interesse para os fragmentos de AT (em Da, ver figura 1A) são 124,1 (para os AT monossubstituídos, janela de massa de 125-1000 Da), 122,1 e 140,1 (para os AT dissubstituídos, janelas de massa com início em 123 e 141 Da, respectivamente) e 156,1 e 138,1 (para os ATs trissubstituídos, janelas de massa com início em 157 e 139 Da, respectivamente).
    NOTA: Durante o desenvolvimento do método, os PrIS foram divididos em dois métodos diferentes, um para ATs mono e dissubstituídos e outro para ATs trisubstituídos, embora possam ser divididos ou combinados de qualquer maneira.
  6. Crie um segundo método MS que inclua os parâmetros na etapa 2.4.
    1. A esse método MS / MS, adicione NLS de modo positivo igual ao comprimento do método LC, com energias de célula de colisão de -20 V e tempos de evento de 0,75 s. Certifique-se de que, em todos os casos, as funções de exclusão ou desisótopo automático de isótopos estejam ativadas.
    2. Certifique-se de que as massas de perda neutra de interesse para ésteres em TAs (em Da, ver Figura 1B) são 100,05 (para ésteres derivados de ácido tiglic, janela de massa de 110-1000 Da), 60,03 (para grupos acetil, janela de massa de 100-1000 Da) e 166,06 (ésteres fenillácticos ou de ácido trópico, janela de massa de 170-1000 Da).
  7. Baixe o método LC-MS e crie arquivos de dados para as amostras de interesse. Uma vez que a coluna de HPLC esteja equilibrada a 45 °C, executar as amostras de interesse num lote ou ficheiro de projecto com os brancos de solvente de extracção adequados entre diferentes espécies ou tipos de tecidos. Um volume de injeção típico é de 10-20 μL.
    NOTA: Em volumes especialmente altos, o detector do espectrômetro de massa pode estar saturado. Se estiver executando amostras muito concentradas, certifique-se de que a fonte ESI esteja limpa e o instrumento esteja afinado regularmente. O protocolo pode ser pausado aqui depois que todos os dados forem coletados.

3. Análise dos dados

  1. Examine o cromatograma de íons total das varreduras Q1 e Q3 (e a varredura de íons do produto DD) e observe a massa original de quaisquer íons abundantes que tenham características semelhantes a TA: a) massa <500 Da para o íon [M + H] + , geralmente uma massa par, b) rts típicos entre 2-22 min usando o método LC acima e c) fragmentos da seguinte lista: m / z 93, 124, 142, 140, 122, 138, 156, 174, 110 ou 128 Da.
  2. Examine o cromatograma / canal PrIS para m / z 124 e observe quais picos / íons estão em que rts (registrados na etapa 3.1) produzem esse fragmento. Clique em varredura por varredura através do cromatograma, bem como examine os espectros completos de MS / MS obtidos na varredura de íons do produto DD, especialmente para espécies de menor abundância.
    NOTA: Uma espécie verdadeira contendo este fragmento existirá para várias varreduras e aparecerá nas varreduras Q1 e Q3 (se a última for usada). Uma planilha é anexada nas Informações de Suporte (Arquivo Suplementar 1) para auxiliar nas anotações.
  3. Repita a etapa 3.2 com os outros cromatogramas PrIS. Como m / z 122 e 140 são indicativos de TAs dissubstituídos e m / z 138 e 156 são indicativos de TAs trissubstituídos, examine esses cromatogramas / canais juntos.
  4. Examine o cromatograma / canais NLS para m / z 100, 60 e 166 e observe quais picos / íons nos quais rts (registrados na etapa 3.1) produzem essas perdas neutras. Tal como acontece com o PrIS, clique em varredura por varredura através do cromatograma e compare com a fragmentação obtida na varredura de íons do produto DD, especialmente para espécies de menor abundância.
  5. Usando a combinação de dados PrIS e NLS, apoiados pelos resultados da varredura de íons do produto DD, faça anotações putativas dos alcalóides observados adicionando a menor massa de tropano (por exemplo, 124, 122 ou 138) e a perda neutra e, em seguida, contabilizando a massa restante restante.
    NOTA: Os grupos típicos que substituem os ATs (e suas massas em Da) são hidroxila (18), acetil (60), propionil (74), isobutilil (88), tigloil (100), tigloil saturado / 2-metilbutiril (102) ou fenillactato / ácido trópico (166).
  6. Compare as anotações de alcalóides com as relatadas na literatura17 e bancos de dados (por exemplo, MoNA) 26 para determinar quais padrões de substituição de TA são relatados (e quais são potencialmente novos). Além disso, use padrões de alguns alcalóides tropanos comuns (por exemplo, atropina, littorina, escopolamina) que estão disponíveis comercialmente para confirmação.
  7. Para obter informações estruturais adicionais para amostras de baixa abundância (o PrIS e o NLS podem captar íons abaixo dos limites de eventos dependentes), colete uma varredura de íons de produto específico (utilizando a massa de interesse como o íon precursor) em uma amostra mais concentrada.
    NOTA: Este método foi desenvolvido em um instrumento QQQ de baixa resolução. Para todos os novos compostos putativos, um instrumento MS de alta resolução deve ser usado para obter espectros de massa precisos.

Resultados

Para demonstrar a eficácia do método, uma mistura padrão de ATs (10 μg / mL cada de uma mistura de acetiltropina / acetilpseudotropina [monossubstituída], 10 μg / mL cada de uma mistura de dois isômeros de anisodamina [dissubstituído], juntamente com hiosciamina [monossubstituída], littorina [monosubstituída] e escopolamina [trisubstituída]) foi analisada como controle positivo (Figura 2). Um cromatograma de varredura Q1 completo (exibido na visua...

Discussão

Embora os parâmetros do instrumento fornecidos no protocolo permitam um desempenho satisfatório, o uso bem-sucedido desse método pode exigir atenção cuidadosa ou otimização de várias etapas críticas. Embora o gradiente de solvente por HPLC fornecido na etapa 2.2 seja geralmente apropriado para alcaloides tropanos, pode ser necessário modificá-lo dependendo do perfil alcalóide tropano da amostra ou da espécie vegetal examinada. O volume de injeção da amostra também pode se...

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado por uma bolsa de pesquisa do corpo docente (Northern Michigan University, concedida ao MAC), uma bolsa de pesquisa de graduação (Northern Michigan University, concedida a JC) e o Departamento de Química. Os autores gostariam de agradecer a John Berger (NMU) pela assistência na preparação do tecido vegetal, Hannah Hawkins (NMU) pela manutenção de LC-MS e assistência na solução de problemas, e ao Dr. Ryan Fornwald e seus alunos do CH 495 (Síntese de Produtos Naturais) pela preparação da mistura de acetiltropina. Os autores também gostariam de agradecer ao Dr. Daniel Jones (Michigan State University) por adquirir espectros MS/MS de alta resolução.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetonitrile, For UHPLC, suitable for mass spectometrySigma-Aldrich900667HPLC solvent
Argon gasAirGasAR UHP300CID gas
Formic acid, 99% for analysisThermo ScientificAC270480010HPLC additive
Guard column holderRestek25812
HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D PlusShimadzu228-65802-58HPLC column
LCMS, Shimdazu LCMS-8045Shimadzu225-31800-44Mass spectrometer; we ran LabSolutions software, which is standard for Shimadzu instruments
Liquid nitrogenAirGasNI 180LT22
Methanol, for HPLC/UHPLC/LCMSVWRBDH 85800.400For making extraction solvent
Microcentrifuge VWR2400-37
Microcentrifuge tubes, 1.5 mLFisher Scientific05-408-129
Mortar Fisher ScientificFB961CFor grinding plant tissues
PestleFisher ScientificFB961MFor grinding plant tissues
Pipette 1000 mLGilson F144059M
Pipette tip 1000 mLFisher scientific02-707-404
Plant tissuesVarious sourcesN/ACan be anything wild or cultivated
Polypropylene conical tubes, 15 mLFisher Scientific05-539-4
Polystyrene coolerULINES-18312The type of coolers that reagents for molecular biology are shipped in would be appropriate
Roc C18 3 µm, 100 mm x 4.6 mmRestek9534315HPLC column
Roc C18, 10 mm x 4 mmRestek953450210Guard column
Rocking shakerThemo Scientific11-676-680
Screw thread vial convenience kit (9 mm)Fisher scientific13-622-190LCMS autosampler vials
Syringe, 3 mLFisher Scientific03-377-27
Syringe filter 0.45 µm Avantor/VWR76479-008
Water, for use in liquid chromatography and mass spectrometryJT Baker9831-03For making extraction solvent
Water solution, contains 0.1% v/v formic acid, For UHPLC, suitable for mass spectometrySigma-Aldrich900687-1LHPLC solvent

Referências

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Reimpressões e Permissões

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