Aplicações da Espectrometria de Massa em Tandem por Cromatografia Líquida na Pesquisa de Produtos Naturais: Alcalóides Tropânicos como Estudo de Caso

Resumo

Apresentamos um método para anotação e classificação rápida baseada em espectrometria de massa (MS) / espectrometria de massa (MS) de alcalóides tropanos, útil tanto para a desreplicação preliminar de amostras contendo tropano quanto para a descoberta de novos alcalóides para isolamento.

Resumo

Embora muitos medicamentos utilizados hoje sejam de origem sintética, os produtos naturais ainda fornecem uma rica fonte de nova diversidade química e bioatividade e podem produzir pistas promissoras para doenças resistentes ou emergentes. O desafio, no entanto, é duplo: não apenas os pesquisadores devem encontrar produtos naturais e elucidar suas estruturas, mas também identificar o que vale a pena isolar e testar (e o que já é conhecido - um processo conhecido como desreplicação). Com o advento da instrumentação analítica moderna, o ritmo de descoberta e desreplicação de produtos naturais acelerou. A cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) tornou-se uma técnica especialmente valiosa para identificar e classificar estruturas químicas. Os alcalóides do tropano (TAs) são compostos derivados de plantas de grande importância medicinal e toxicológica. Neste estudo, desenvolvemos um fluxo de trabalho de triagem baseado em LC-MS/MS utilizando as múltiplas configurações de MS/MS disponíveis em um espectrômetro de massa triplo-quadrupolo (QQQ) para anotar e classificar estruturas de TA com base em seus padrões de fragmentação distintos. Usando uma combinação de varreduras de íons de produto dependentes de dados (DD), varreduras de íons precursores (PrIS) e varreduras de perda neutra (NLS), aplicamos esse método a extratos ricos em TA das solanáceas Datura stramonium e Datura metel. Este método é rápido, sensível e foi empregado com sucesso tanto para a desreplicação preliminar de amostras complexas contendo TA quanto para a descoberta de um novo candidato para isolamento, purificação (e eventual bioensaio).

Introdução

Embora as moléculas totalmente sintéticas tenham se tornado mais proeminentes na descoberta de medicamentos nas últimas décadas, quase dois terços de todos os medicamentos aprovados nos últimos 39 anos são produtos naturais ou inspirados em produtos ^naturais,1,2  ressaltando a importância contínua da pesquisa de produtos naturais. Os alcalóides, certos produtos naturais que contêm nitrogênio, são especialmente valorizados por suas propriedades medicinais. Os alcaloides do tropano (TA) que contêm o [3.2.1.]-sistema bicíclico contendo nitrogênio, são produzidos princi....

Protocolo

CUIDADO: Consulte todas as fichas de dados de segurança do material (MSDS) relevantes antes de usar os produtos químicos listados.

1. Preparação da amostra

CUIDADO: O nitrogênio líquido pode causar queimaduras criogênicas. Use luvas criogênicas e proteção para os olhos em uma área bem ventilada. Amostras de plantas contendo alcalóides podem ser irritantes para a pele; Sempre manuseie-os com luvas. O metanol é tóxico e inflamável e deve ser manuseado em uma capela de exaustão longe de possíveis fontes de ignição.

NOTA: Em teoria, podem se....

Discussão

Embora os parâmetros do instrumento fornecidos no protocolo permitam um desempenho satisfatório, o uso bem-sucedido desse método pode exigir atenção cuidadosa ou otimização de várias etapas críticas. Embora o gradiente de solvente por HPLC fornecido na etapa 2.2 seja geralmente apropriado para alcaloides tropanos, pode ser necessário modificá-lo dependendo do perfil alcalóide tropano da amostra ou da espécie vegetal examinada. O volume de injeção da amostra também pode se.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile, For UHPLC, suitable for mass spectometry	Sigma-Aldrich	900667	HPLC solvent
Argon gas	AirGas	AR UHP300	CID gas
Formic acid, 99% for analysis	Thermo Scientific	AC270480010	HPLC additive
Guard column holder	Restek	25812
HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D Plus	Shimadzu	228-65802-58	HPLC column
LCMS, Shimdazu LCMS-8045	Shimadzu	225-31800-44	Mass spectrometer; we ran LabSolutions software, which is standard for Shimadzu instruments
Liquid nitrogen	AirGas	NI 180LT22
Methanol, for HPLC/UHPLC/LCMS	VWR	BDH 85800.400	For making extraction solvent
Microcentrifuge	VWR	2400-37
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Mortar	Fisher Scientific	FB961C	For grinding plant tissues
Pestle	Fisher Scientific	FB961M	For grinding plant tissues
Pipette 1000 mL	Gilson	F144059M
Pipette tip 1000 mL	Fisher scientific	02-707-404
Plant tissues	Various sources	N/A	Can be anything wild or cultivated
Polypropylene conical tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-4
Polystyrene cooler	ULINE	S-18312	The type of coolers that reagents for molecular biology are shipped in would be appropriate
Roc C18 3 µm, 100 mm x 4.6 mm	Restek	9534315	HPLC column
Roc C18, 10 mm x 4 mm	Restek	953450210	Guard column
Rocking shaker	Themo Scientific	11-676-680
Screw thread vial convenience kit (9 mm)	Fisher scientific	13-622-190	LCMS autosampler vials
Syringe, 3 mL	Fisher Scientific	03-377-27
Syringe filter 0.45 µm	Avantor/VWR	76479-008
Water, for use in liquid chromatography and mass spectrometry	JT Baker	9831-03	For making extraction solvent
Water solution, contains 0.1% v/v formic acid, For UHPLC, suitable for mass spectometry	Sigma-Aldrich	900687-1L	HPLC solvent