Doğal Ürün Araştırmalarında Sıvı Kromatografi Tandem Kütle Spektrometresinin Uygulamaları: Bir Vaka Çalışması Olarak Tropan Alkaloidleri

Özet

Hızlı kütle spektrometresi (MS)/kütle spektrometresi (MS) tabanlı tropan alkaloidlerinin açıklanması ve sınıflandırılması için hem tropan içeren numunelerin ön replikasyonu hem de izolasyon için yeni alkaloidlerin keşfi için yararlı bir yöntem sunuyoruz.

Özet

Günümüzde kullanılan birçok ilaç sentetik kökenli olmasına rağmen, doğal ürünler hala zengin bir yeni kimyasal çeşitlilik ve biyoaktivite kaynağı sağlamakta ve dirençli veya yeni ortaya çıkan hastalıklar için umut verici ipuçları verebilmektedir. Bununla birlikte, zorluk iki yönlüdür: araştırmacılar sadece doğal ürünler bulmak ve yapılarını aydınlatmak zorunda değil, aynı zamanda neyin izole edilmeye ve tahlil edilmeye değer olduğunu (ve zaten bilinenleri - çoğaltma olarak bilinen bir süreç) belirlemelidirler. Modern analitik enstrümantasyonun ortaya çıkmasıyla birlikte, doğal ürün keşfi ve çoğaltmanın hızı hızlandı. Sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS), kimyasal yapıların tanımlanması ve sınıflandırılması için özellikle değerli bir teknik haline gelmiştir. Tropan alkaloidleri (TA'lar), büyük tıbbi ve toksikolojik öneme sahip bitki türevli bileşiklerdir. Bu çalışmada, TA yapılarını farklı parçalanma modellerine göre açıklamak ve sınıflandırmak için üçlü dört kutuplu (QQQ) kütle spektrometresinde bulunan çoklu MS/MS konfigürasyonlarını kullanarak LC-MS/MS tabanlı bir tarama iş akışı geliştirdik. Veriye bağlı (DD) ürün iyon taramaları, öncü iyon taramaları (PrIS) ve nötr kayıp taramalarının (NLS) bir kombinasyonunu kullanarak, bu yöntemi patlıcangiller Datura stramonium ve Datura metel'in TA açısından zengin özlerine uyguladık.Bu yöntem hızlı, hassastır ve hem karmaşık TA içeren numunelerin ön replikasyonu hem de izolasyon, saflaştırma (ve nihai biyo-tahlil) için yeni bir adayın keşfi için başarıyla kullanılmıştır.

Giriş

Her ne kadar tam sentetik moleküller son yıllarda ilaç keşfinde daha belirgin hale gelmiş olsa da, son 39 yılda onaylanan tüm ilaçların yaklaşık üçte ikisi doğal ürünler veya doğal ürünlerden ilham alan ^{ilaçlardır.1,2}  bu da doğal ürün araştırmalarının devam eden öneminin altını çizmektedir. Bazı azot içeren doğal ürünler olan alkaloidler, tıbbi özellikleri nedeniyle özellikle değerlidir. [3.2.1.] içeren tropan alkaloidleri (TA'lar)-bisiklik azot içeren sistem, çoğunlukla Solanaceae (patlıcangilgiller), Erythroxylaceae ve Convolvulaceae familyalarındaki bitkiler tar....

Protokol

DİKKAT: Listelenen kimyasalları kullanmadan önce lütfen ilgili tüm malzeme güvenlik bilgi formlarına (MSDS) bakın.

1. Numune hazırlama

DİKKAT: Sıvı nitrojen kriyojen yanıklarına neden olabilir. İyi havalandırılan bir alanda kriyojen eldivenleri ve göz koruması kullanın. Alkaloid içeren bitki örnekleri cildi tahriş edebilir; Onları her zaman eldivenlerle tutun. Metanol toksik ve yanıcıdır ve potansiyel tutuşturucu kaynaklardan uzakta bir çeker ocakta kullanılmalıdır.

NOT: Teorik olarak, ekili veya yabani bitki dokusu kullanılabilir (kurut....

Tartışmalar

Protokolde sağlanan cihaz parametreleri tatmin edici bir performansa izin verse de, bu yöntemin başarılı bir şekilde kullanılması, birkaç kritik adımın dikkatli bir şekilde ele alınmasını veya optimize edilmesini gerektirebilir. Adım 2.2'de sağlanan HPLC çözücü gradyanı genellikle tropan alkaloidleri için uygun olsa da, incelenen numunenin veya bitki türünün tropan alkaloid profiline bağlı olarak modifiye edilmesi gerekebilir. Numune enjeksiyon hacmi, cihazın.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile, For UHPLC, suitable for mass spectometry	Sigma-Aldrich	900667	HPLC solvent
Argon gas	AirGas	AR UHP300	CID gas
Formic acid, 99% for analysis	Thermo Scientific	AC270480010	HPLC additive
Guard column holder	Restek	25812
HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D Plus	Shimadzu	228-65802-58	HPLC column
LCMS, Shimdazu LCMS-8045	Shimadzu	225-31800-44	Mass spectrometer; we ran LabSolutions software, which is standard for Shimadzu instruments
Liquid nitrogen	AirGas	NI 180LT22
Methanol, for HPLC/UHPLC/LCMS	VWR	BDH 85800.400	For making extraction solvent
Microcentrifuge	VWR	2400-37
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Mortar	Fisher Scientific	FB961C	For grinding plant tissues
Pestle	Fisher Scientific	FB961M	For grinding plant tissues
Pipette 1000 mL	Gilson	F144059M
Pipette tip 1000 mL	Fisher scientific	02-707-404
Plant tissues	Various sources	N/A	Can be anything wild or cultivated
Polypropylene conical tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-4
Polystyrene cooler	ULINE	S-18312	The type of coolers that reagents for molecular biology are shipped in would be appropriate
Roc C18 3 µm, 100 mm x 4.6 mm	Restek	9534315	HPLC column
Roc C18, 10 mm x 4 mm	Restek	953450210	Guard column
Rocking shaker	Themo Scientific	11-676-680
Screw thread vial convenience kit (9 mm)	Fisher scientific	13-622-190	LCMS autosampler vials
Syringe, 3 mL	Fisher Scientific	03-377-27
Syringe filter 0.45 µm	Avantor/VWR	76479-008
Water, for use in liquid chromatography and mass spectrometry	JT Baker	9831-03	For making extraction solvent
Water solution, contains 0.1% v/v formic acid, For UHPLC, suitable for mass spectometry	Sigma-Aldrich	900687-1L	HPLC solvent