Aplicaciones de la espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida en la investigación de productos naturales: alcaloides tropanos como estudio de caso

Resumen

Presentamos un método para la anotación y clasificación de alcaloides tropanos basada en espectrometría de masas (MS) rápida/espectrometría de masas, útil tanto para la dereplicación preliminar de muestras que contienen tropano como para el descubrimiento de nuevos alcaloides para el aislamiento.

Resumen

Aunque muchos de los fármacos utilizados hoy en día son de origen sintético, los productos naturales siguen siendo una rica fuente de nueva diversidad química y bioactividad, y pueden dar pistas prometedoras para enfermedades resistentes o emergentes. El desafío, sin embargo, es doble: los investigadores no solo deben encontrar productos naturales y dilucidar sus estructuras, sino que también deben identificar lo que vale la pena aislar y analizar (y lo que ya se sabe, un proceso conocido como dereplicación). Con el advenimiento de la instrumentación analítica moderna, el ritmo del descubrimiento y la desreplicación de productos naturales se ha acelerado. La cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) se ha convertido en una técnica especialmente valiosa para identificar y clasificar estructuras químicas. Los alcaloides tropanos (AT) son compuestos derivados de plantas de gran importancia medicinal y toxicológica. En este estudio, desarrollamos un flujo de trabajo de cribado basado en LC-MS/MS utilizando las múltiples configuraciones de MS/MS disponibles en un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (QQQ) para anotar y clasificar las estructuras de TA en función de sus distintos patrones de fragmentación. Mediante el uso de una combinación de escaneos de iones de productos dependientes de datos (DD), escaneos de iones precursores (PrIS) y escaneos de pérdida neutra (NLS), aplicamos este método a extractos ricos en TA de las solanáceas Datura stramonium y Datura metel. Este método es rápido, sensible y se empleó con éxito tanto para la dereplicación preliminar de muestras complejas que contienen TA como para el descubrimiento de un nuevo candidato para el aislamiento, la purificación (y el eventual bioensayo).

Introducción

Aunque las moléculas totalmente sintéticas se han vuelto más prominentes en el descubrimiento de fármacos en las últimas décadas, casi dos tercios de todos los medicamentos aprobados en los últimos 39 años son productos naturales o inspirados en productos ^{naturales,1,2}  lo que subraya la importancia continua de la investigación de productos naturales. Los alcaloides, ciertos productos naturales que contienen nitrógeno, son especialmente apreciados por sus propiedades medicinales. Alcaloides tropanos (AT) que contienen el [3.2.1.]-sistema bicíclico que contiene nitrógeno, son producidos principalmente por plantas de las familias Solanaceae (solanáceas), Erythroxylaceae y Convolvulaceae. Algunos ejemplos son la atropina, la escopolamina y la cocaína; Múltiples tropanos semisintéticos o sintéticos también se utilizan clínicamente³. Los TA y sus derivados se utilizan para tratar muchas afecciones ^3,4 y varios de estos fármacos aparecen en la Lista de Medicamentos Esenciales 2023 de la OMS⁵. Debido a sus potentes actividades, los TA también se utilizan con fines recreativos (como estimulantes o delirantes) y pueden causar envenenamiento por ingestión de plantas (o preparados) que los contienen ^6,7. Los TA son indeseables en la alimentación humana y animal⁸ y pueden contaminar tés, especias, granos, miel y suplementos herbales ^9,10. Debido tanto a su promesa medicinal como a su capacidad para envenenar, los métodos analíticos que pueden ayudar en el descubrimiento de nuevos ATs (y la identificación de los AT conocidos) son útiles.

En la espectrometría de masas en tándem (MS/MS), los "filtros de masas" (por ejemplo, cuadrupolos, tubos de tiempo de vuelo) se acoplan físicamente ("en el espacio"), o un instrumento emplea pasos adicionales de reacción/separación "en el tiempo". La MS/MS en el espacio utiliza diferentes modos para seleccionar y fragmentar diferentes iones en los diferentes filtros de masa (por ejemplo, los cuadrupolos de un instrumento de triple cuadrupolo o QQQ). Estos diferentes modos se pueden utilizar para determinar qué fragmentos específicos son formados por un ion dado (escaneo de iones de producto), qué iones en una muestra producen ciertos fragmentos (escaneo de iones precursores o PrIS) o sufren pérdidas de una masa característica (escaneo de pérdida neutra o NLS), o qué compuestos específicos poseen qué fragmentos específicos (monitoreo de reacciones múltiples). MS/MS, por lo tanto, proporciona fragmentos que son útiles para proponer estructuras para nuevos compuestos o confirmar la presencia de un compuesto existente. La MS/MS se utiliza cada vez más en los campos del descubrimiento de fármacos, la química de productos naturales y la metabolómica^11,12, y se ha utilizado para perfilar especies que contienen alcaloides (para la caracterización fitoquímica o el análisis quimiotaxonómico) y para detectar y cuantificar alcaloides específicos en alimentos o plantas medicinales 10,13,14,15,16.

A pesar de las muchas técnicas de espectrometría de masas disponibles, existen desafíos para encontrar nuevos alcaloides. Además de encontrar un organismo candidato para el cribado, la confirmación estructural completa de un alcaloide es un proceso arduo que puede incluir muchas técnicas analíticas diferentes. Además, los investigadores pudieron aislar un compuesto que ya se conoce, desperdiciando trabajo, tiempo y recursos. Esto es especialmente difícil para las AT, donde se reportan cientos, si no miles de TA, muchas de las cuales son isoméricas entre sí. El proceso de "identificar lo conocido y distinguirlo de lo desconocido" se conoce como dereplicación. Se publican bases de datos de los tiempos de retención (r.t.s) y fragmentos de masa de diferentes ATs y otros compuestos para ayudar en este proceso ^17,18. No obstante, la dereplicación es laboriosa; El mero hecho de anotar (es decir, asignar estructuras putativas a) los alcaloides en todo el cromatograma LC-MS/MS de una muestra lleva mucho tiempo. Recientemente, tanto la red molecular^{1 9,20} como la dereplicación manual 18,21,22 se han utilizado para la bencilisoquinolina, el indol monoterpénico y los alcaloides tropanos, y los PrISs se han utilizado para el "filtrado estructural" de espectros para identificar pirrolizidina y alcaloides de tipo solanina ^23,24. Sin embargo, no hay métodos o flujos de trabajo específicos disponibles para la dereplicación rápida basada en LC-MS/MS de muestras que contienen TA, a pesar de que los TA poseen fragmentos comunes y fácilmente identificables (Figura 1). El método descrito aquí utiliza una combinación de escaneos de iones de productos dependientes de datos (DD), PrISs y NLSs para anotar y clasificar las estructuras de TA en plantas en función de los distintos patrones de fragmentación para tropanos mono-, di- y trisustituidos (Figura 1A) y las pérdidas de grupos de ésteres comunes encontrados en estos alcaloides (Figura 1B). Los organismos de estudio son varias especies del género de solanáceas Datura. Una rica fuente de diversos ATs, la Datura se ha utilizado a lo largo de la historia del mundo con fines medicinales y culturales¹⁷- y es una matriz difícil de replicar debido a sus numerosos TA estructuralmente similares, lo que nos proporciona muestras atractivas sobre las que probar nuestro método.

Protocolo

PRECAUCIÓN: Consulte todas las hojas de datos de seguridad de materiales (MSDS) relevantes antes de utilizar los productos químicos enumerados.

1. Preparación de la muestra

PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido puede causar quemaduras criogénicas. Use guantes criogénicos y protección para los ojos en un área bien ventilada. Las muestras de plantas que contienen alcaloides pueden ser irritantes para la piel; Manéptelos siempre con guantes. El metanol es tóxico e inflamable y debe manipularse en una campana extractora lejos de posibles fuentes de ignición.

NOTA: En teoría, se puede utilizar tejido vegetal cultivado o silvestre (seco o molido fresco); El siguiente procedimiento es precisamente el que se utiliza durante el desarrollo del método.

1. Si el tejido vegetal de interés es fresco, congélalo colocándolo en un tubo cónico de polipropileno y sumergiéndolo en nitrógeno líquido durante 2-3 min.
2. Coloque el tejido vegetal congelado en un mortero preenfriado (en un enfriador de poliestireno con nitrógeno líquido) y, con un mortero preenfriado, muela el tejido hasta obtener un polvo uniforme.
3. Pese rápidamente la cantidad deseada de tejido en un tubo de microcentrífuga de polipropileno tarado utilizando una espátula preenfriada e inmediatamente agregue metanol al 20% (a temperatura ambiente [RT]) a una concentración de 1 ml por cada 100 mg de tejido.
   NOTA: El metanol (20%) se usa comúnmente para extraer TAs²⁵. Ocasionalmente, se añade ácido fórmico al 0,1%, aunque no se observaron diferencias en la eficiencia de extracción durante el desarrollo de este método y otros.
4. Coloque los tubos tapados en un agitador oscilante (velocidad media) durante un mínimo de 3 h a RT.
5. Centrifugar los tubos a 9464 x g durante 10 min. Pipetear el sobrenadante en un vial de muestreador automático LC-MS o, si aún está turbio, filtrar primero a través de un filtro de jeringa de 0,45 μm.
   NOTA: El protocolo puede ser pausado aquí, aunque las muestras y extractos de plantas frescas procesadas deben almacenarse en un congelador a -80 °C antes del análisis para evitar cualquier posible degradación de alcaloides.

2. Configuración del instrumento LC-MS y recopilación de datos

PRECAUCIÓN: El acetonitrilo es tóxico e inflamable; Manténgalo alejado de fuentes de ignición y controle los vapores con una campana extractora. El ácido fórmico es corrosivo; Evite el contacto con la piel y los ojos y use el equipo de protección personal adecuado.

1. Utilice un instrumento LC-MS con una fuente de ionización por electrospray (ESI) y una columna de HPLC de fase reversa (C18, 4,6 x 100 mm).
2. Para HPLC, use ácido fórmico al 0,1% en H₂O como solvente A y ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo como solvente B; equilibre la columna con 99% A y 1% B. Configure un gradiente de 30 min de 1%-50% B durante 26 min, volviendo a 1% B a 26.01 min y manteniéndose en 1% B durante 4 min. Utilice una temperatura de horno de columna de 45 °C y un caudal de 0,5 mL/min.
3. En el método LC-MS, utilice los siguientes parámetros de funcionamiento para el espectrómetro de masas: voltaje de la interfaz: 4,0 kV, flujo de gas de nebulización: 3 L/min, flujo de gas de calefacción: 10 L/min, temperatura DL: 250 °C, temperatura del bloque térmico: 400 °C, temperatura de la interfaz: 300 °C, flujo de gas de secado: 10 L/min y presión de gas (argón) de disociación inducida por colisión (CID) de 17 kPa.
4. Cree un método MS en modo ESI positivo que incluya un escaneo Q3 y un escaneo Q1 (100-1000 Da) que funcione como un evento topográfico (establecido en la longitud del método LC), con la exclusión automática de isótopos habilitada. Incluya un escaneo de iones de producto como un evento dependiente del escaneo Q1 (análisis DD), con una ventana de masa de 50-1000 Da, una energía de celda de colisión de -20 V y un tiempo de evento de <0,2 s.
   NOTA: El umbral de recuento para activar el escaneo de iones del producto DD de Q1 puede ser variable, pero normalmente se utiliza un nivel de 7.000-10.000 recuentos. En algunos instrumentos, como el utilizado para desarrollar el método, el escaneo Q3 proporciona una mayor precisión y sensibilidad de masa que el Q1 y se incluye para confirmar los iones observados en el escaneo Q1, aunque se puede omitir en el paso 2.4 sin problemas.
5. Al método MS anterior, añádase PrISs de modo positivo iguales a la longitud del método LC con energías de celda de colisión de -20 V y tiempos de evento de 0,75 s. Asegúrese de que, en todos los casos, las funciones de exclusión automática de isótopos o desisótopos estén habilitadas. Asegúrese de que los valores m/z de interés para los fragmentos de TA (en Da, véase la Figura 1A) sean 124,1 (para los TA monosustituidos, ventana de masa de 125-1000 Da), 122,1 y 140,1 (para los AT disustituidos, ventanas de masa que comienzan en 123 y 141 Da, respectivamente) y 156,1 y 138,1 (para TA trisustituidos, ventanas de masa que comienzan en 157 y 139 Da, respectivamente).
   NOTA: Durante el desarrollo del método, los PrIS se dividieron en dos métodos diferentes, uno para los TA mono y disustituidos y otro para los TA trisustituidos, aunque pueden dividirse o combinarse de cualquier manera.
6. Cree un segundo método MS que incluya los parámetros del paso 2.4.
   1. A este método MS/MS hay que añadir un NLS de modo positivo igual a la longitud del método LC, con energías de célula de colisión de -20 V y tiempos de suceso de 0,75 s. Asegúrese de que, en todos los casos, las funciones de exclusión automática de isótopos o desisótopos estén habilitadas.
   2. Asegúrese de que las masas de pérdida neutra de interés para los ésteres en los TA (en Da, véase la Figura 1B) sean 100,05 (para los ésteres derivados del ácido tíglico, ventana de masa de 110-1000 Da), 60,03 (para grupos acetilo, ventana de masa de 100-1000 Da) y 166,06 (ésteres fenillácticos o de ácido tropical, ventana de masa de 170-1000 Da).
7. Descargue el método LC-MS y cree archivos de datos para las muestras de interés. Una vez que la columna de HPLC esté equilibrada a 45 °C, ejecute las muestras de interés en un lote o archivo de proyecto con disolventes de extracción apropiados entre diferentes especies o tipos de tejidos. Un volumen de inyección típico es de 10-20 μL.
   NOTA: A volúmenes especialmente altos, el detector de espectrómetro de masas puede estar saturado. Si se procesan muestras muy concentradas, asegúrese de que la fuente ESI esté limpia y de que el instrumento esté afinado regularmente. El protocolo se puede pausar aquí después de recopilar todos los datos.

3. Análisis de datos

1. Examine el cromatograma iónico total de los escaneos Q1 y Q3 (y el escaneo iónico del producto DD), y observe la masa principal de cualquier ion abundante que tenga características similares a TA: a) masa <500 Da para el ion [M + H]⁺ , generalmente una masa uniforme, b) r.t. típicos entre 2 y 22 min usando el método LC anterior, y c) fragmentos de la siguiente lista: m/z 93, 124, 142, 140, 122, 138, 156, 174, 110 o 128 Da.
2. Examine el cromatograma/canal PrIS para m/z 124 y observe qué picos/iones están en los que los r.t.s (registrados en el paso 3.1) producen este fragmento. Haga clic escaneo por escaneo a través del cromatograma, así como examine los espectros completos de MS/MS obtenidos en el escaneo de iones del producto DD, especialmente para las especies de menor abundancia.
   NOTA: Existirá una especie verdadera que contenga este fragmento para múltiples escaneos y aparecerá tanto en los escaneos Q1 como en los Q3 (si se usa este último). Se adjunta una hoja de cálculo en la información de apoyo (archivo complementario 1) para ayudar con las anotaciones.
3. Repita el paso 3.2 con los otros cromatogramas PrIS. Dado que tanto m/z 122 como 140 son indicativos de TA disustituidos y que tanto m/z 138 como 156 son indicativos de TA trisustituidos, examine estos cromatogramas/canales juntos.
4. Examine el cromatograma/canales NLS para m/z 100, 60 y 166, y observe qué picos/iones en los que r.t.s (registrados en el paso 3.1) producen estas pérdidas neutras. Al igual que con el PrIS, haga clic escaneo por escaneo a través del cromatograma y compárelo con la fragmentación obtenida en el escaneo de iones del producto DD, especialmente para las especies de menor abundancia.
5. Utilizando la combinación de datos de PrIS y NLS, respaldados por los resultados del escaneo de iones del producto DD, haga anotaciones putativas de los alcaloides observados agregando la masa tropana más pequeña (por ejemplo, 124, 122 o 138) y la pérdida neutra y luego contabilizando la masa restante restante.
   NOTA: Los grupos típicos que sustituyen a los TA (y sus masas en Da) son hidroxilo (18), acetilo (60), propionilo (74), isobutililio (88), tigloilo (100), tigloilo/2-metilbutiril saturado (102) o fenillactato/ácido trópico (166).
6. Compare las anotaciones de los alcaloides con las reportadas en la literatura¹⁷ y las bases de datos (por ejemplo, MoNA)²⁶ para determinar qué patrones de sustitución de AT se reportan (y cuáles son potencialmente nuevos). Además, use patrones de algunos alcaloides tropanos comunes (por ejemplo, atropina, littorina, escopolamina) que están disponibles comercialmente para su confirmación.
7. Para obtener información estructural adicional para muestras de baja abundancia (el PrIS y el NLS pueden recoger iones por debajo de los umbrales de eventos dependientes), recoja un escaneo de iones de producto específico (utilizando la masa de interés como ion precursor) en una muestra más concentrada.
   NOTA: Este método se desarrolló en un instrumento QQQ de baja resolución. Para todos los nuevos compuestos putativos, se debe utilizar un instrumento MS de alta resolución para obtener espectros de masas precisos.

Resultados

Para demostrar la efectividad del método, se analizó una mezcla estándar de TA (10 μg/mL de una mezcla de acetiltropina/acetilpseudotropina [monosustituida], 10 μg/mL de cada una mezcla de dos isómeros de anisodamina [disustituidos], junto con hiosciamina [monosustituida], littorina [monosustituida] y escopolamina [trisustituida]) como control positivo (Figura 2). En la Figura 2A se muestra un cromatograma de exploración ...

Discusión

Aunque los parámetros del instrumento proporcionados en el protocolo permiten un rendimiento satisfactorio, el uso exitoso de este método puede requerir una atención cuidadosa o la optimización de varios pasos críticos. Si bien el gradiente de disolventes de HPLC proporcionado en el paso 2.2 es generalmente apropiado para los alcaloides tropanos, puede ser necesario modificarlo en función del perfil de alcaloides tropanos de la muestra o de la especie vegetal que se esté examinand...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile, For UHPLC, suitable for mass spectometry	Sigma-Aldrich	900667	HPLC solvent
Argon gas	AirGas	AR UHP300	CID gas
Formic acid, 99% for analysis	Thermo Scientific	AC270480010	HPLC additive
Guard column holder	Restek	25812
HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D Plus	Shimadzu	228-65802-58	HPLC column
LCMS, Shimdazu LCMS-8045	Shimadzu	225-31800-44	Mass spectrometer; we ran LabSolutions software, which is standard for Shimadzu instruments
Liquid nitrogen	AirGas	NI 180LT22
Methanol, for HPLC/UHPLC/LCMS	VWR	BDH 85800.400	For making extraction solvent
Microcentrifuge	VWR	2400-37
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Mortar	Fisher Scientific	FB961C	For grinding plant tissues
Pestle	Fisher Scientific	FB961M	For grinding plant tissues
Pipette 1000 mL	Gilson	F144059M
Pipette tip 1000 mL	Fisher scientific	02-707-404
Plant tissues	Various sources	N/A	Can be anything wild or cultivated
Polypropylene conical tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-4
Polystyrene cooler	ULINE	S-18312	The type of coolers that reagents for molecular biology are shipped in would be appropriate
Roc C18 3 µm, 100 mm x 4.6 mm	Restek	9534315	HPLC column
Roc C18, 10 mm x 4 mm	Restek	953450210	Guard column
Rocking shaker	Themo Scientific	11-676-680
Screw thread vial convenience kit (9 mm)	Fisher scientific	13-622-190	LCMS autosampler vials
Syringe, 3 mL	Fisher Scientific	03-377-27
Syringe filter 0.45 µm	Avantor/VWR	76479-008
Water, for use in liquid chromatography and mass spectrometry	JT Baker	9831-03	For making extraction solvent
Water solution, contains 0.1% v/v formic acid, For UHPLC, suitable for mass spectometry	Sigma-Aldrich	900687-1L	HPLC solvent