Aplicaciones de la espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida en la investigación de productos naturales: alcaloides tropanos como estudio de caso

Resumen

Presentamos un método para la anotación y clasificación de alcaloides tropanos basada en espectrometría de masas (MS) rápida/espectrometría de masas, útil tanto para la dereplicación preliminar de muestras que contienen tropano como para el descubrimiento de nuevos alcaloides para el aislamiento.

Resumen

Aunque muchos de los fármacos utilizados hoy en día son de origen sintético, los productos naturales siguen siendo una rica fuente de nueva diversidad química y bioactividad, y pueden dar pistas prometedoras para enfermedades resistentes o emergentes. El desafío, sin embargo, es doble: los investigadores no solo deben encontrar productos naturales y dilucidar sus estructuras, sino que también deben identificar lo que vale la pena aislar y analizar (y lo que ya se sabe, un proceso conocido como dereplicación). Con el advenimiento de la instrumentación analítica moderna, el ritmo del descubrimiento y la desreplicación de productos naturales se ha acelerado. La cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) se ha convertido en una técnica especialmente valiosa para identificar y clasificar estructuras químicas. Los alcaloides tropanos (AT) son compuestos derivados de plantas de gran importancia medicinal y toxicológica. En este estudio, desarrollamos un flujo de trabajo de cribado basado en LC-MS/MS utilizando las múltiples configuraciones de MS/MS disponibles en un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (QQQ) para anotar y clasificar las estructuras de TA en función de sus distintos patrones de fragmentación. Mediante el uso de una combinación de escaneos de iones de productos dependientes de datos (DD), escaneos de iones precursores (PrIS) y escaneos de pérdida neutra (NLS), aplicamos este método a extractos ricos en TA de las solanáceas Datura stramonium y Datura metel. Este método es rápido, sensible y se empleó con éxito tanto para la dereplicación preliminar de muestras complejas que contienen TA como para el descubrimiento de un nuevo candidato para el aislamiento, la purificación (y el eventual bioensayo).

Introducción

Aunque las moléculas totalmente sintéticas se han vuelto más prominentes en el descubrimiento de fármacos en las últimas décadas, casi dos tercios de todos los medicamentos aprobados en los últimos 39 años son productos naturales o inspirados en productos ^{naturales,1,2}  lo que subraya la importancia continua de la investigación de productos naturales. Los alcaloides, ciertos productos naturales que contienen nitrógeno, son especialmente apreciados por sus propiedades medicinales. Alcaloides tropanos (AT) que contienen el [3.2.1.]-sistema bicíclico que contiene nitró....

Protocolo

PRECAUCIÓN: Consulte todas las hojas de datos de seguridad de materiales (MSDS) relevantes antes de utilizar los productos químicos enumerados.

1. Preparación de la muestra

PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido puede causar quemaduras criogénicas. Use guantes criogénicos y protección para los ojos en un área bien ventilada. Las muestras de plantas que contienen alcaloides pueden ser irritantes para la piel; Manéptelos siempre con guantes. El metanol es tóxico e inflamable y debe manipularse en una campana extractora lejos de posibles fuentes de ignición.

Discusión

Aunque los parámetros del instrumento proporcionados en el protocolo permiten un rendimiento satisfactorio, el uso exitoso de este método puede requerir una atención cuidadosa o la optimización de varios pasos críticos. Si bien el gradiente de disolventes de HPLC proporcionado en el paso 2.2 es generalmente apropiado para los alcaloides tropanos, puede ser necesario modificarlo en función del perfil de alcaloides tropanos de la muestra o de la especie vegetal que se esté examinand.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile, For UHPLC, suitable for mass spectometry	Sigma-Aldrich	900667	HPLC solvent
Argon gas	AirGas	AR UHP300	CID gas
Formic acid, 99% for analysis	Thermo Scientific	AC270480010	HPLC additive
Guard column holder	Restek	25812
HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D Plus	Shimadzu	228-65802-58	HPLC column
LCMS, Shimdazu LCMS-8045	Shimadzu	225-31800-44	Mass spectrometer; we ran LabSolutions software, which is standard for Shimadzu instruments
Liquid nitrogen	AirGas	NI 180LT22
Methanol, for HPLC/UHPLC/LCMS	VWR	BDH 85800.400	For making extraction solvent
Microcentrifuge	VWR	2400-37
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Mortar	Fisher Scientific	FB961C	For grinding plant tissues
Pestle	Fisher Scientific	FB961M	For grinding plant tissues
Pipette 1000 mL	Gilson	F144059M
Pipette tip 1000 mL	Fisher scientific	02-707-404
Plant tissues	Various sources	N/A	Can be anything wild or cultivated
Polypropylene conical tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-4
Polystyrene cooler	ULINE	S-18312	The type of coolers that reagents for molecular biology are shipped in would be appropriate
Roc C18 3 µm, 100 mm x 4.6 mm	Restek	9534315	HPLC column
Roc C18, 10 mm x 4 mm	Restek	953450210	Guard column
Rocking shaker	Themo Scientific	11-676-680
Screw thread vial convenience kit (9 mm)	Fisher scientific	13-622-190	LCMS autosampler vials
Syringe, 3 mL	Fisher Scientific	03-377-27
Syringe filter 0.45 µm	Avantor/VWR	76479-008
Water, for use in liquid chromatography and mass spectrometry	JT Baker	9831-03	For making extraction solvent
Water solution, contains 0.1% v/v formic acid, For UHPLC, suitable for mass spectometry	Sigma-Aldrich	900687-1L	HPLC solvent