Anwendungen der Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie in der Naturstoffforschung: Tropanalkaloide als Fallstudie

Zusammenfassung

Wir stellen eine Methode zur schnellen Massenspektrometrie (MS)/Massenspektrometrie (MS)-basierten Annotation und Klassifizierung von Tropanalkaloiden vor, die sowohl für die vorläufige Dereplikation von tropanhaltigen Proben als auch für die Entdeckung neuer Alkaloide für die Isolierung nützlich ist.

Zusammenfassung

Obwohl viele der heute verwendeten Medikamente synthetischen Ursprungs sind, bieten Naturstoffe immer noch eine reichhaltige Quelle für neuartige chemische Vielfalt und Bioaktivität und können vielversprechende Hinweise auf resistente oder neu auftretende Krankheiten liefern. Die Herausforderung ist jedoch eine zweifache: Die Forscher müssen nicht nur Naturstoffe finden und ihre Strukturen aufklären, sondern sie müssen auch herausfinden, was es wert ist, isoliert und untersucht zu werden (und was bereits bekannt ist - ein Prozess, der als Dereplikation bekannt ist). Mit dem Aufkommen moderner Analyseinstrumente hat sich das Tempo der Entdeckung und Dereplikation von Naturstoffen beschleunigt. Die Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) hat sich zu einer besonders wertvollen Technik zur Identifizierung und Klassifizierung chemischer Strukturen entwickelt. Tropanalkaloide (TAs) sind pflanzliche Verbindungen von großer medizinischer und toxikologischer Bedeutung. In dieser Studie haben wir einen LC-MS/MS-basierten Screening-Workflow entwickelt, der die verschiedenen MS/MS-Konfigurationen nutzt, die auf einem Triple-Quadrupol (QQQ)-Massenspektrometer verfügbar sind, um TA-Strukturen basierend auf ihren unterschiedlichen Fragmentierungsmustern zu annotieren und zu klassifizieren. Durch die Verwendung einer Kombination aus datenabhängigen (DD) Produktionenscans, Präcursorionenscans (PrIS) und Neutralverlustscans (NLS) haben wir diese Methode auf TA-reiche Extrakte der Nachtschattengewächse Datura stramonium und Datura metel angewendet. Diese Methode ist schnell, sensitiv und wurde erfolgreich sowohl für die vorläufige Dereplikation komplexer TA-haltiger Proben als auch für die Entdeckung eines neuartigen Kandidaten für die Isolierung, Reinigung (und eventuellen Bioassay) eingesetzt.

Einleitung

Obwohl vollsynthetische Moleküle in den letzten Jahrzehnten in der Arzneimittelforschung immer mehr an Bedeutung gewonnen haben, sind fast zwei Drittel aller zugelassenen Arzneimittel der letzten 39 Jahre Naturstoffe oder von Naturstoffen ^{inspiriert1,2}  was die anhaltende Bedeutung der Naturstoffforschung unterstreicht. Alkaloide, bestimmte stickstoffhaltige Naturstoffe, werden besonders wegen ihrer medizinischen Eigenschaften geschätzt. Tropanalkaloide (TAs), die die [3.2.1.]-bizyklische, stickstoffhaltige Systeme werden hauptsächlich von Pflanzen aus den Familien ....

Protokoll

ACHTUNG: Bitte konsultieren Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS), bevor Sie die aufgeführten Chemikalien verwenden.

1. Vorbereitung der Probe

ACHTUNG: Flüssiger Stickstoff kann Kryoverbrennungen verursachen. Verwenden Sie Kryohandschuhe und Augenschutz in einem gut belüfteten Bereich. Alkaloidhaltige Pflanzenproben können die Haut reizen; Fassen Sie sie immer mit Handschuhen an. Methanol ist giftig und brennbar und sollte in einem Abzug fern von potenziellen Zündquellen gehandhabt werden.

HINWEIS: Theoretisch kann Kultur- o....

Diskussion

Obwohl die im Protokoll bereitgestellten Geräteparameter eine zufriedenstellende Leistung ermöglichen, kann die erfolgreiche Anwendung dieses Verfahrens eine sorgfältige Beachtung oder Optimierung mehrerer kritischer Schritte erfordern. Während der in Schritt 2.2 bereitgestellte HPLC-Lösungsmittelgradient im Allgemeinen für Tropanalkaloide geeignet ist, muss er möglicherweise in Abhängigkeit vom Tropanalkaloidprofil der zu untersuchenden Probe oder Pflanzenart modifiziert werden........

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile, For UHPLC, suitable for mass spectometry	Sigma-Aldrich	900667	HPLC solvent
Argon gas	AirGas	AR UHP300	CID gas
Formic acid, 99% for analysis	Thermo Scientific	AC270480010	HPLC additive
Guard column holder	Restek	25812
HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D Plus	Shimadzu	228-65802-58	HPLC column
LCMS, Shimdazu LCMS-8045	Shimadzu	225-31800-44	Mass spectrometer; we ran LabSolutions software, which is standard for Shimadzu instruments
Liquid nitrogen	AirGas	NI 180LT22
Methanol, for HPLC/UHPLC/LCMS	VWR	BDH 85800.400	For making extraction solvent
Microcentrifuge	VWR	2400-37
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Mortar	Fisher Scientific	FB961C	For grinding plant tissues
Pestle	Fisher Scientific	FB961M	For grinding plant tissues
Pipette 1000 mL	Gilson	F144059M
Pipette tip 1000 mL	Fisher scientific	02-707-404
Plant tissues	Various sources	N/A	Can be anything wild or cultivated
Polypropylene conical tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-4
Polystyrene cooler	ULINE	S-18312	The type of coolers that reagents for molecular biology are shipped in would be appropriate
Roc C18 3 µm, 100 mm x 4.6 mm	Restek	9534315	HPLC column
Roc C18, 10 mm x 4 mm	Restek	953450210	Guard column
Rocking shaker	Themo Scientific	11-676-680
Screw thread vial convenience kit (9 mm)	Fisher scientific	13-622-190	LCMS autosampler vials
Syringe, 3 mL	Fisher Scientific	03-377-27
Syringe filter 0.45 µm	Avantor/VWR	76479-008
Water, for use in liquid chromatography and mass spectrometry	JT Baker	9831-03	For making extraction solvent
Water solution, contains 0.1% v/v formic acid, For UHPLC, suitable for mass spectometry	Sigma-Aldrich	900687-1L	HPLC solvent