液相色谱串联质谱法在天然产物研究中的应用：以莨菪烷生物碱为例

摘要

我们提出了一种基于快速质谱 （MS）/质谱 （MS） 的莨菪烷生物碱注释和分类方法，可用于含莨菨烷样品的初步去复制和发现用于分离的新型生物碱。

摘要

尽管今天使用的许多药物都是合成来源的，但天然产物仍然提供了丰富的新型化学多样性和生物活性来源，并且可以为耐药性或新出现的疾病产生有希望的线索。然而，挑战是双重的：研究人员不仅必须找到天然产物并阐明其结构，而且还必须确定值得分离和分析的内容（以及已知的内容 - 称为去重复的过程）。随着现代分析仪器的出现，天然产物发现和去重的步伐加快了。液相色谱-串联质谱 （LC-MS/MS） 已成为鉴定和分类化学结构的一种特别有价值的技术。莨菪烷生物碱 （TAs） 是具有重要药用和毒理学意义的植物来源化合物。在这项研究中，我们开发了一种基于 LC-MS/MS 的筛查工作流程，利用三重四极杆 （QQQ） 质谱仪上提供的多种 MS/MS 配置，根据 TA 结构的不同碎裂模式对其进行注释和分类。通过结合使用数据依赖性 （DD） 产物离子扫描、母离子扫描 （PrIS） 和中性损失扫描 （NLS），我们将该方法应用于茄属 曼陀罗 和 曼陀 罗的富含 TA 的提取物。该方法快速、灵敏，并成功用于含复杂 TA 样品的初步重复数据删除和发现用于分离、纯化（和最终生物测定）的新型候选方法。

引言

尽管近几十年来全合成分子在药物发现中变得越来越重要，但在过去 39 年中，近三分之二的获批药物是天然产物或受天然产物启发的药物，^1,2  突显了天然产物研究的持续重要性。生物碱是某些含氮的天然产物，因其药用特性而特别珍贵。含有 [3.2.1.] 的莨菪烷生物碱 （TA）。-双环含氮系统，主要由茄科（茄科）、Erythroxylaceae 和 Convolvulaceae 科的植物产生。例子包括阿托品、东莨菪碱和可卡因;临床上也使用多种半合成或合成托烷³。TA 及其衍生物用于治疗许多疾病 ^3,4，^其中一些药物出现在 WHO 的 2023 年基本药物清单⁵ 中。由于其强大的活性，TA 也被用于娱乐（作为兴奋剂或谵妄剂），摄入含有它们的植物（或制剂）会导致中毒 ^6,7。TA 在人类和动物食物中是不可取的⁸，并且会污染茶、香料、谷物、蜂蜜和草药补充剂 ^....

研究方案

注意： 在使用所列化学品之前，请查阅所有相关的材料安全数据表 （MSDS）。

1. 样品制备

注意：液氮会导致制冷剂灼伤。在通风良好的地方使用制冷剂手套和护目镜。含生物碱的植物样品可能对皮肤有刺激性;始终戴手套处理它们。甲醇有毒且易燃，应在通风橱中处理，远离潜在的火源。

注意：理论上，可以使用栽培或野生植物组织（干燥或新鲜研磨）;以下程序只是在方法开发过程中使用的过程。

1. 如果感兴趣的植物组织是新鲜的，请将其放入聚丙烯锥形管中并浸入液氮中 2-3 分钟以冷冻。
2. 将冷冻的植物组织放入预冷的研钵中（在含液氮的聚苯乙烯冷却器中），并使用预冷的研杵将组织研磨成均匀的粉末。
3. 使用预冷的刮刀将所需量的组织快速称量到去皮重的聚丙烯微量离心管中，并立即添加浓度为 1 mL/100 mg 组织的 20% 甲醇（室温 [RT]）。
   注：甲醇 （20%） 通常用于提取 TA²⁵。偶尔添加 0.1% 的甲酸，尽管在该方法和其他方法的开发过程中没有观察到提取效率的差异。
4. 将带盖的管子放在摇床（中速）上，在 RT 下至少 3 小时。
5. 将试管以 ....

讨论

尽管实验方案中提供的仪器参数可实现令人满意的性能，但成功使用该方法可能需要仔细注意或优化几个关键步骤。虽然步骤 2.2 中提供的 HPLC 溶剂梯度通常适用于莨菪烷生物碱，但可能需要根据被检查样品或植物物种的莨菪烷生物碱谱进行修改。样品进样量也可以根据仪器的灵敏度和方法的使用方式进行更改。“深度”代谢分析或重复数据删除应使用较大的进样体积（?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile, For UHPLC, suitable for mass spectometry	Sigma-Aldrich	900667	HPLC solvent
Argon gas	AirGas	AR UHP300	CID gas
Formic acid, 99% for analysis	Thermo Scientific	AC270480010	HPLC additive
Guard column holder	Restek	25812
HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D Plus	Shimadzu	228-65802-58	HPLC column
LCMS, Shimdazu LCMS-8045	Shimadzu	225-31800-44	Mass spectrometer; we ran LabSolutions software, which is standard for Shimadzu instruments
Liquid nitrogen	AirGas	NI 180LT22
Methanol, for HPLC/UHPLC/LCMS	VWR	BDH 85800.400	For making extraction solvent
Microcentrifuge	VWR	2400-37
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Mortar	Fisher Scientific	FB961C	For grinding plant tissues
Pestle	Fisher Scientific	FB961M	For grinding plant tissues
Pipette 1000 mL	Gilson	F144059M
Pipette tip 1000 mL	Fisher scientific	02-707-404
Plant tissues	Various sources	N/A	Can be anything wild or cultivated
Polypropylene conical tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-4
Polystyrene cooler	ULINE	S-18312	The type of coolers that reagents for molecular biology are shipped in would be appropriate
Roc C18 3 µm, 100 mm x 4.6 mm	Restek	9534315	HPLC column
Roc C18, 10 mm x 4 mm	Restek	953450210	Guard column
Rocking shaker	Themo Scientific	11-676-680
Screw thread vial convenience kit (9 mm)	Fisher scientific	13-622-190	LCMS autosampler vials
Syringe, 3 mL	Fisher Scientific	03-377-27
Syringe filter 0.45 µm	Avantor/VWR	76479-008
Water, for use in liquid chromatography and mass spectrometry	JT Baker	9831-03	For making extraction solvent
Water solution, contains 0.1% v/v formic acid, For UHPLC, suitable for mass spectometry	Sigma-Aldrich	900687-1L	HPLC solvent