液相色谱串联质谱法在天然产物研究中的应用：以莨菪烷生物碱为例

摘要

我们提出了一种基于快速质谱 （MS）/质谱 （MS） 的莨菪烷生物碱注释和分类方法，可用于含莨菨烷样品的初步去复制和发现用于分离的新型生物碱。

摘要

尽管今天使用的许多药物都是合成来源的，但天然产物仍然提供了丰富的新型化学多样性和生物活性来源，并且可以为耐药性或新出现的疾病产生有希望的线索。然而，挑战是双重的：研究人员不仅必须找到天然产物并阐明其结构，而且还必须确定值得分离和分析的内容（以及已知的内容 - 称为去重复的过程）。随着现代分析仪器的出现，天然产物发现和去重的步伐加快了。液相色谱-串联质谱 （LC-MS/MS） 已成为鉴定和分类化学结构的一种特别有价值的技术。莨菪烷生物碱 （TAs） 是具有重要药用和毒理学意义的植物来源化合物。在这项研究中，我们开发了一种基于 LC-MS/MS 的筛查工作流程，利用三重四极杆 （QQQ） 质谱仪上提供的多种 MS/MS 配置，根据 TA 结构的不同碎裂模式对其进行注释和分类。通过结合使用数据依赖性 （DD） 产物离子扫描、母离子扫描 （PrIS） 和中性损失扫描 （NLS），我们将该方法应用于茄属 曼陀罗 和 曼陀 罗的富含 TA 的提取物。该方法快速、灵敏，并成功用于含复杂 TA 样品的初步重复数据删除和发现用于分离、纯化（和最终生物测定）的新型候选方法。

引言

尽管近几十年来全合成分子在药物发现中变得越来越重要，但在过去 39 年中，近三分之二的获批药物是天然产物或受天然产物启发的药物，^1,2  突显了天然产物研究的持续重要性。生物碱是某些含氮的天然产物，因其药用特性而特别珍贵。含有 [3.2.1.] 的莨菪烷生物碱 （TA）。-双环含氮系统，主要由茄科（茄科）、Erythroxylaceae 和 Convolvulaceae 科的植物产生。例子包括阿托品、东莨菪碱和可卡因;临床上也使用多种半合成或合成托烷³。TA 及其衍生物用于治疗许多疾病 ^3,4，^其中一些药物出现在 WHO 的 2023 年基本药物清单⁵ 中。由于其强大的活性，TA 也被用于娱乐（作为兴奋剂或谵妄剂），摄入含有它们的植物（或制剂）会导致中毒 ^6,7。TA 在人类和动物食物中是不可取的⁸，并且会污染茶、香料、谷物、蜂蜜和草药补充剂 ^9,10。由于它们的药用价值和中毒能力，有助于发现新 TA（和鉴定已知 TA）的分析方法非常有用。

在串联质谱 （MS/MS） 中，“质量过滤器”（例如，四极杆、飞行时间管）以物理方式（“在空间中”）耦合在一起，或者仪器采用额外的“时间”反应/分离步骤。空间 MS/MS 使用不同的模式在不同的质量过滤器（例如，三重四极杆或 QQQ 仪器的四极杆）上选择和碎裂不同的离子。这些不同的模式可用于确定给定离子产生哪些特定碎片（子离子扫描），样品中的哪些离子产生某些碎片（母离子扫描或 PrIS）或发生特征质量数损失（中性损失扫描或 NLS），或者哪些特定化合物具有哪些特定碎片（多重反应监测）。因此，MS/MS 提供的片段可用于提出新化合物的结构或确认现有化合物的存在。MS/MS 越来越多地用于药物发现、天然产物化学和代谢组学领域^11,12，并已用于分析含生物碱的物种（用于植物化学表征或化学分类学分析）以及检测和定量食品或药用植物中的特定生物碱 10,13,14,15,16。

尽管有许多质谱技术可用，但在寻找新的生物碱方面仍然存在挑战。除了寻找要筛选的候选生物体外，生物碱的全面结构确认也是一个艰巨的过程，可能包括许多不同的分析技术。此外，研究人员可以分离出已知的化合物，浪费劳动力、时间和资源。这对于 TA 尤其困难，因为 TA 报告了数百甚至数千个 TA，其中许多是彼此同分异构的。“识别已知并将其与未知区分开来”的过程称为去重复。发布了不同 TA 和其他化合物的保留时间 （r.t.s） 和质量片段数据库，以帮助完成这一过程^17,18。尽管如此，去重很费力;仅注释（即为样品的整个 LC-MS/MS 色谱图分配推定结构）中的生物碱非常耗时。最近，分子网络^{1 9,20} 和手动重复数据删除 18,21,22 都已用于苄基异喹啉、单萜吲哚和莨菪烷生物碱，而 PrIS 已用于光谱的“结构过滤”以鉴定吡咯里西啶和茄碱型生物碱 ^23,24.然而，没有特定的方法或工作流程可用于对含 TA 的样品进行基于 LC-MS/MS 的快速重复数据删除，即使 TA 具有常见且易于识别的片段（图 1）。此处描述的方法使用数据依赖性 （DD） 产物离子扫描、PrIS 和 NLS 的组合，根据单、二取代和三取代托烷的不同碎裂模式（图 1A）和在这些生物碱中发现的常见酯基的损失（图 1B）来注释和分类植物中的 TA 结构。研究生物是曼陀罗属的几个物种。曼陀罗是多种 TA 的丰富来源，在世界历史上一直被用于医学和文化目的¹⁷- 并且由于其数量众多、结构相似的 TA，因此是一种具有挑战性的去复制基质，为我们提供了有吸引力的样本来测试我们的方法。

研究方案

注意： 在使用所列化学品之前，请查阅所有相关的材料安全数据表 （MSDS）。

1. 样品制备

注意：液氮会导致制冷剂灼伤。在通风良好的地方使用制冷剂手套和护目镜。含生物碱的植物样品可能对皮肤有刺激性;始终戴手套处理它们。甲醇有毒且易燃，应在通风橱中处理，远离潜在的火源。

注意：理论上，可以使用栽培或野生植物组织（干燥或新鲜研磨）;以下程序只是在方法开发过程中使用的过程。

1. 如果感兴趣的植物组织是新鲜的，请将其放入聚丙烯锥形管中并浸入液氮中 2-3 分钟以冷冻。
2. 将冷冻的植物组织放入预冷的研钵中（在含液氮的聚苯乙烯冷却器中），并使用预冷的研杵将组织研磨成均匀的粉末。
3. 使用预冷的刮刀将所需量的组织快速称量到去皮重的聚丙烯微量离心管中，并立即添加浓度为 1 mL/100 mg 组织的 20% 甲醇（室温 [RT]）。
   注：甲醇 （20%） 通常用于提取 TA²⁵。偶尔添加 0.1% 的甲酸，尽管在该方法和其他方法的开发过程中没有观察到提取效率的差异。
4. 将带盖的管子放在摇床（中速）上，在 RT 下至少 3 小时。
5. 将试管以 9464 x g 离心 10 分钟。将上清液移液到 LC-MS 自动进样器样品瓶中，或者，如果仍然混浊，请先通过 0.45 μm 针式过滤器过滤。
   注意：该方案可以在此处暂停，尽管处理过的新鲜植物样品和提取物应在分析前储存在 -80 °C 冰箱中，以避免任何潜在的生物碱降解。

2. LC-MS 仪器配置和数据采集

注意： 乙腈有毒且易燃;远离火源并使用通风橱控制蒸气。甲酸有腐蚀性;避免皮肤和眼睛接触，并佩戴适当的个人防护装备。

1. 使用带有电喷雾电离 （ESI） 源和反相 HPLC 色谱柱（C18,4.6 x 100 mm）的 LC-MS 仪器。
2. 对于 HPLC，使用 0.1% 甲酸的 H₂O 溶液作为溶剂 A，使用 0.1% 甲酸的乙腈溶液作为溶剂 B;用 99% A 和 1% B 平衡色谱柱。在 26 分钟内配置 1%-50% B 的 30 分钟梯度，在 26.01 分钟时返回 1% B，并在 1% B 下保持 4 分钟。柱温箱温度为 45 °C，流速为 0.5 mL/min。
3. 在 LC-MS 方法中，质谱仪使用以下操作参数：界面电压：4.0 kV，雾化气体流量：3 L/min，加热气体流量：10 L/min，DL 温度：250 °C，加热块温度：400 °C，界面温度：300 °C，干燥气体流速：10 L/min，碰撞诱导解离 （CID） 气体（氩气）压力为 17 kPa。
4. 在 ESI 阳性模式下构建一个 MS 方法，包括 Q3 扫描和 Q1 扫描 （100-1000 Da），用作测量事件（设置为 LC 方法的长度），并启用自动同位素排除。包括子离子扫描作为 Q1 扫描（DD 分析）的相关事件，质量窗口为 50-1000 Da，碰撞池能量为 -20 V，事件时间为 <0.2 s。
   注：触发 Q1 的 DD 子离子扫描的计数阈值可以是可变的，但通常使用 7,000-10,000 个计数的级别。在某些仪器上，例如用于开发该方法的仪器，Q3 扫描提供了比 Q1 更高的质量精度和灵敏度，并且用于确认在 Q1 扫描中观察到的离子，尽管它可以在步骤 2.4 中省略而不会出现问题。
5. 在上述 MS 方法中，添加等于 LC 方法长度的正模式 PrIS，碰撞池能量为 -20 V，事件时间为 0.75 s。确保在所有情况下，都启用了 Automatic Isotope Exclude 或 De-isotoping 功能。确保 TA 片段的目标 m/z 值（在 Da 中，参见 图 1A）为 124.1（对于单取代 TA，质量窗口为 125-1000 Da）、122.1 和 140.1（对于二取代 TA，质量窗口分别从 123 和 141 Da 开始）和 156.1 和 138.1（对于三取代 TA，质量窗口从 157 和 139 Da开始， 分别）。
   注：在方法开发过程中，PrIS 分为两种不同的方法，一种用于单取代和双取代 TA，另一种用于三取代 TA，尽管它们可以以任何方式拆分或组合。
6. 构建第二个 MS 方法，其中包含步骤 2.4 中的参数。
   1. 向该 MS/MS 方法中，添加等于 LC 方法长度的正模式 NLS，碰撞池能量为 -20 V，事件时间为 0.75 s。确保在所有情况下，都启用了 自动同位素排除 或 去同位素功能 。
   2. 确保 TA 上酯的目标中性损失质量数（在 Da 中，参见 图 1B）为 100.05（对于源自 tiglic acid 的酯，质量窗口为 110-1000 Da）、60.03（对于乙酰基，质量窗口为 100-1000 Da）和 166.06（苯基或热带酸酯，质量窗口为 170-1000 Da）。
7. 下载 LC-MS 方法并为目标样品创建数据文件。HPLC 色谱柱在 45 °C 下平衡后，在不同物种或组织类型之间使用适当的提取溶剂空白样在批次或项目文件中运行目标样品。典型的进样体积为 10-20 μL。
   注：在特别高的体积下，质谱检测器可能会饱和。如果运行浓度非常高的样品，请确保清洁 ESI 离子源并定期调整仪器。收集完所有数据后，可以在此处暂停协议。

3. 数据分析

1. 检查 Q1 和 Q3 扫描（以及 DD 子离子扫描）的总离子流色谱图，并记下任何具有类似 TA 特征的高丰度离子的母质量数：a） [M+H]⁺ 离子的质量数 <500 Da，通常为偶数质量，b） 使用上述液相色谱方法在 2-22 min 之间的典型 r.t.s，以及 c） 以下列表中的碎片： m/z 93、124、142、140、122、138、156、174、110 或 128 Da。
2. 检查 m/z 124 的 PrIS 色谱图/通道，并注意 r.t.s（在步骤 3.1 中记录）产生该片段的峰/离子。单击色谱图的逐个扫描，并检查在 DD 子离子扫描中获得的完整 MS/MS 谱图，尤其是对于低丰度物质。
   注意：包含此片段的真实物种将存在多次扫描，并同时出现在 Q1 和 Q3 扫描中（如果使用后者）。支持信息（补充文件 1）中附有一个电子表格，以帮助进行注释。
3. 对其他 PrIS 色谱图重复步骤 3.2。由于 m/z 122 和 140 都表示二取代 TA， 而 m/z 138 和 156 都表示三取代 TA，因此请一起检查这些色谱图/通道。
4. 检查 m/z 100、60 和 166 的 NLS 色谱图/通道，并记下 r.t.s（在步骤 3.1 中记录）产生这些中性损失的峰/离子。与 PrIS 一样，单击色谱图的逐个扫描，并与 DD 子离子扫描中获得的碎裂进行比较，尤其是对于低丰度物质。
5. 使用 DD 子离子扫描结果支持的 PrIS 和 NLS 数据的组合，通过添加最小的莨菪烷质量（例如 124、122 或 138）和中性损失，然后考虑剩余的剩余质量，对观察到的生物碱进行推定注释。
   注：取代 TA 的典型组（及其在 Da 中的质量数）是羟基 （18）、乙酰基 （60）、丙酰基 （74）、异丁酰基 （88）、钛酰基 （100）、饱和钛酰基/2-甲基丁酰基 （102） 或苯乳酸酯/热带酸 （166）。
6. 将生物碱的注释与文献¹⁷ 和数据库（例如 MoNA）²⁶ 中报道的注释进行比较，以确定报告了哪些 TA 取代模式（以及哪些可能是新的）。此外，使用一些市售的常见托烷生物碱（例如阿托品、柠檬碱、东莨菪碱）的标准品进行确认。
7. 有关低丰度样品的其他结构信息（PrIS 和 NLS 可能拾取低于相关事件阈值的离子），请在浓度更高的样品上收集特定的子离子扫描（使用目标质量作为母离子）。
   注意：该方法是在低分辨率 QQQ 仪器上开发的。对于所有推定的新化合物，应使用高分辨率 MS 仪器来获得准确的质谱。

结果

为了证明该方法的有效性，分析了 TA 的标准混合物（乙酰托品/乙酰假托品混合物 [单取代] 各 10 μg/mL，两种莨菪碱异构体 [二取代] 的混合物各 10 μg/mL，以及莨菪碱 [单取代]、利托林 [单取代] 和东莨菪碱 [三取代]）作为阳性对照（图 2）。完整的 Q1 扫描色谱图（显示在基峰色谱图视图中）如图 2A 所示，TA 标准结构由相应的峰?...

讨论

尽管实验方案中提供的仪器参数可实现令人满意的性能，但成功使用该方法可能需要仔细注意或优化几个关键步骤。虽然步骤 2.2 中提供的 HPLC 溶剂梯度通常适用于莨菪烷生物碱，但可能需要根据被检查样品或植物物种的莨菪烷生物碱谱进行修改。样品进样量也可以根据仪器的灵敏度和方法的使用方式进行更改。“深度”代谢分析或重复数据删除应使用较大的进样体积（?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile, For UHPLC, suitable for mass spectometry	Sigma-Aldrich	900667	HPLC solvent
Argon gas	AirGas	AR UHP300	CID gas
Formic acid, 99% for analysis	Thermo Scientific	AC270480010	HPLC additive
Guard column holder	Restek	25812
HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D Plus	Shimadzu	228-65802-58	HPLC column
LCMS, Shimdazu LCMS-8045	Shimadzu	225-31800-44	Mass spectrometer; we ran LabSolutions software, which is standard for Shimadzu instruments
Liquid nitrogen	AirGas	NI 180LT22
Methanol, for HPLC/UHPLC/LCMS	VWR	BDH 85800.400	For making extraction solvent
Microcentrifuge	VWR	2400-37
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Mortar	Fisher Scientific	FB961C	For grinding plant tissues
Pestle	Fisher Scientific	FB961M	For grinding plant tissues
Pipette 1000 mL	Gilson	F144059M
Pipette tip 1000 mL	Fisher scientific	02-707-404
Plant tissues	Various sources	N/A	Can be anything wild or cultivated
Polypropylene conical tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-4
Polystyrene cooler	ULINE	S-18312	The type of coolers that reagents for molecular biology are shipped in would be appropriate
Roc C18 3 µm, 100 mm x 4.6 mm	Restek	9534315	HPLC column
Roc C18, 10 mm x 4 mm	Restek	953450210	Guard column
Rocking shaker	Themo Scientific	11-676-680
Screw thread vial convenience kit (9 mm)	Fisher scientific	13-622-190	LCMS autosampler vials
Syringe, 3 mL	Fisher Scientific	03-377-27
Syringe filter 0.45 µm	Avantor/VWR	76479-008
Water, for use in liquid chromatography and mass spectrometry	JT Baker	9831-03	For making extraction solvent
Water solution, contains 0.1% v/v formic acid, For UHPLC, suitable for mass spectometry	Sigma-Aldrich	900687-1L	HPLC solvent