Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تسمح طريقة نادرة الاستخدام للتسجيل الكهربي ، التسجيل الأساسي ، بتحليل ميزات ترميز الذوق التي لا يمكن فحصها بواسطة طرق التسجيل التقليدية. يسمح التسجيل الأساسي أيضا بتحليل استجابات الذوق للمنبهات الكارهة للماء التي لا يمكن دراستها باستخدام الطرق الكهربية التقليدية.

Abstract

تتذوق الحشرات العالم الخارجي من خلال شعر التذوق ، أو السنسيلا ، التي تحتوي على مسام في أطرافها. عندما يتلامس السنسيلوم مع مصدر غذائي محتمل ، تدخل المركبات من مصدر الغذاء عبر المسام وتنشط الخلايا العصبية بداخلها. لأكثر من 50 عاما ، تم تسجيل هذه الاستجابات باستخدام تقنية تسمى تسجيل الإكرامية. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة لها قيود كبيرة ، بما في ذلك عدم القدرة على قياس النشاط العصبي قبل أو بعد ملامسة التحفيز ومتطلبات أن تكون المذاق قابلة للذوبان في المحاليل المائية. نصف هنا تقنية نسميها التسجيل الأساسي ، والتي تتغلب على هذه القيود. يسمح التسجيل الأساسي بقياس نشاط الخلايا العصبية الذوقية قبل المثير وأثناءه وبعده. وبالتالي ، فإنه يسمح بتحليل مكثف لاستجابات OFF التي تحدث بعد تحفيز الذوق. يمكن استخدامه لدراسة المركبات الكارهة للماء مثل الفيرومونات طويلة السلسلة التي لها قابلية ذوبان منخفضة جدا في الماء. باختصار ، يوفر التسجيل الأساسي مزايا الفيزيولوجيا الكهربية أحادية الإحساس كوسيلة لقياس النشاط العصبي - دقة مكانية وزمانية عالية ، دون الحاجة إلى أدوات وراثية - ويتغلب على القيود الرئيسية لتقنية تسجيل الطرف التقليدية.

Introduction

تتمتع الحشرات ، بما في ذلك ذباب ذبابة الفاكهة ، بنظام طعم متطور يمكنها من استخراج المعلومات الكيميائية المعقدة من محيطها. يسمح لهم هذا النظام بتمييز التركيب الكيميائي للمواد المختلفة ، والتمييز بين تلك المغذية وتلك الضارة 1,2.

في قلب هذا النظام توجد هياكل متخصصة تعرف باسم شعر الذوق أو السينسيلا ، وتقع في موقع استراتيجي على أجزاء مختلفة من الجسم. في ذبابة الفاكهة ، توجد هذه الحس على labellum ، وهو عضو الذوق الرئيسي لرأس الذبابة1،2،3،4 ، وكذلك على الساقين والأجنحة1،2،5،6. يقع labellum في طرف خرطوم ويحتوي على اثنين من الفصوص4،7،8. كل فص مغطى ب 31 حس طعم مصنفة على أنها قصيرة وطويلة ومتوسطة4،7،8. هذه sensilla كل منزل 2-4 طعم الخلايا العصبية1،2،9،10. تعبر هذه الخلايا العصبية الذوقية عن أعضاء من أربع عائلات جينية مختلفة على الأقل ، وهي المستقبلات الذوقية (Gr) ، ومستقبلات الأيونوتروبيك (Ir) ، والنشل (Ppk) ، وجينات إمكانات المستقبلات العابرة (Trp) 1،2،11،12،13. هذا التنوع في المستقبلات والقنوات يزود الحشرات بالقدرة على التعرف على مجموعة واسعة من المركبات الكيميائية ، بما في ذلك الإشارات غير المتطايرة والمتطايرة1،2،14.

لأكثر من 50 عاما ، قام العلماء بقياس استجابة الخلايا العصبية الذوقية ومستقبلاتها باستخدام تقنية تسمى تسجيلالطرف 3،4،6،8،13،15،16،17،18،19،20،21،22،23،24,25,26,27,28,
29,30,31,32,33,34,35. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة لها قيود كبيرة. أولا ، لا يمكن قياس النشاط العصبي إلا أثناء ملامسة التحفيز ، وليس قبل أو بعد الاتصال. هذا القيد يحول دون قياس نشاط الارتفاع التلقائي ويمنع قياس استجابات OFF. ثانيا ، يمكن اختبار المذاق القابل للذوبان في المحاليل المائية فقط.

يمكن التغلب على هذه القيود من خلال تقنية فيزيولوجية كهربية بديلة نادرا ما تسمى "التسجيل الأساسي". هنا نصف هذه التقنية ، التي قمنا بتكييفها من طريقة استخدمها Marion-Poll وزملاؤه24 ، ونعرض ميزات ترميز الذوق الحاسمة التي يمكنها الآن قياس14 بسهولة.

Protocol

يتوافق البروتوكول التالي مع جميع إرشادات رعاية بجامعة ييل.

1. الذباب

  1. ضع 10-15 ذبابة ناشئة حديثا في قوارير استزراع قياسية جديدة عند 25 درجة مئوية ورطوبة نسبية 60٪ في دورة 12:12 ساعة من الضوء والظلام.
  2. استخدم الذباب عندما يكون عمره 3-7 أيام.

2. المنبهات الحسية الكيميائية

  1. الحصول على المحفزات الحسية الكيميائية من أعلى نقاء متاح. قم بتخزينها على النحو الموصى به من قبل البائع حتى الاستخدام.
  2. قم بإذابة المنبهات الحسية الكيميائية وخفف إلى التركيزات المطلوبة في الماء أو مذيب آخر مرغوب فيه وغير سام مثل زيت البارافين. حرك المحاليل المعدة لمدة لا تقل عن 1 ساعة في حالة المركبات الصلبة الذائبة.

3. الزجاج التحفيز الشعري

  1. اسحب شعرية زجاجية لتثبيت التحفيز من شعرية زجاجية من البورسليكات (طول 100 مم ، قطر خارجي 1 مم ، قطر داخلي 0.58 مم) باستخدام أداة مجتذبة ماصة. تهدف إلى تحقيق قطر طرف بين 3 ميكرومتر و 10 ميكرومتر.
  2. املأ الشعيرات الدموية الزجاجية بمحلول التحفيز المفضل باستخدام طرف ماصة محمل دقيق. احرص على تجنب الفقاعات التي يمكن إزالتها عن طريق النقر اللطيف.
  3. إذا تبلور التحفيز عند الطرف ، فقم بتنظيف أو استبدال الشعيرات الدموية الزجاجية المحفزة.

4. الأقطاب الكهربائية المرجعية والتسجيل

  1. استخدم قضبان التنغستن (قطرها 127 ميكرومتر وطولها 76.2 مم) لكل من الأقطاب الكهربائية المرجعية والتسجيل. شحذ الأقطاب الكهربائية المرجعية والتسجيل إلى قطر 1 ميكرومتر تقريبا عند الطرف (تم تصوير أشكال هذه الأقطاب الكهربائية في Delventhal et al.36) عن طريق غمسها بشكل متكرر لعدة ثوان إما في محلول 10٪ KNO3 (~ 1 M) أو محلول KOH (1.8 M) بنسبة 10٪.
    ملاحظة: يتطلب هذا الحل تيارا (0.3-3 مللي أمبير) لتسهيل هذه العملية.

5. إعداد الذبابة للتسجيل الأساسي

  1. ارسم ذبابة واحدة من القارورة إلى شفاط. سحب الشافطة وحبس عن طريق وضع إصبع على النهاية.
  2. اطرد الذبابة إلى طرف ماصة بلاستيكي سعة 200 ميكرولتر. مع الحفاظ على نهاية الشافطة في طرف الماصة ، استخدم النهاية لدفع الذبابة للأمام ، رأسا أولا ، نحو الطرف الضيق لطرف الماصة.
  3. قم بقص طرف الماصة في كل طرف (أي الأمامي والخلفي للحيوان) باستخدام شفرة حلاقة.
  4. استخدم إما الطين أو قطعة صغيرة من القطن لدفع الذبابة للأمام أكثر ، حتى يبرز نصف الرأس من نهاية طرف الماصة المشذب. استخدم الملقط للدفع برفق حتى ينكشف الملصق الموجود في مقدمة الرأس.
  5. ثبت طرف الماصة المشذب على شريحة مجهر زجاجية باستخدام الطين (الشكل 1).
  6. تحت المجهر المجسم ، ضع الملصق بشكل جانبي على زلة غطاء بحيث يتعرض فص واحد ، جنبا إلى جنب مع 31 طعم حساس (الشكل 1). تحافظ زلة الغطاء على الملصق في مكانه.

6. الفيزيولوجيا الكهربية تلاعب

  1. حدد غرفة لإعداد الحفارة ذات درجة حرارة ثابتة ورطوبة نسبية (<70٪) ومعزولة عن مصادر الضوضاء الكهربائية والميكانيكية ، مثل الثلاجات وأجهزة الطرد المركزي.
  2. ضع المجهر في وسط طاولة مضادة للاهتزاز.
  3. قم بتأمين مناور دقيق يدوي على طاولة مضاد للاهتزاز (الشكل 2).
  4. قم بتوصيل عمود من الفولاذ المقاوم للصدأ يحمل القطب المرجعي للتنغستن بالمعالج الدقيق اليدوي (الشكل 2).
  5. قم بتوصيل المتلاعبين الآليين - أحدهما بحامل لمسبار قطب التسجيل والثاني بحامل متصل بعمود من الفولاذ المقاوم للصدأ لشعيرات التحفيز الزجاجية - بنفس الطاولة باستخدام الحوامل (الشكل 2).
  6. قم بتوصيل مسبار قطب التسجيل بنظام وحدة التحكم الذكية في الحصول على البيانات (IDAC) أو نظام مضخم / محول رقمي آخر.
  7. قم بربط نظام IDAC هذا بالكمبيوتر في محطة العمل.
  8. قم بتأريض المتلاعبين اليدويين والمحركات في نفس الموقع داخل الحفارة.
  9. قم بتثبيت برنامج الاستحواذ المناسب لنظام IDAC على الكمبيوتر. تأكد من أن برامج تشغيل الاستحواذ الرقمي متوافقة مع نظام التشغيل (على سبيل المثال، Windows XP-7 أو -8 أو -10) على الكمبيوتر.

7. تسجيل من الذوق سينسيلا

  1. ضع شريحة التحضير على مرحلة المجهر مع تكبير منخفض (على سبيل المثال ، 10x) في الموضع. حرك المسرح حتى يتم التركيز على labellum في مركز مجال الرؤية عند كل من أهداف التكبير المنخفض والتكبير العالي (على سبيل المثال ، 50x).
  2. أدخل القطب المرجعي في العين باستخدام هدف التكبير المنخفض. لإدخال القطب المرجعي، استهدف العين على جانب الذبابة المقابلة للجانب باستخدام قطب التسجيل، على سبيل المثال، إذا كان قطب التسجيل يقترب من اليمين، فضع القطب المرجعي في العين اليسرى. استخدم مناور دقيق يدوي للإدخال الدقيق.
  3. ضع طرف الشعيرات الدموية المحفزة للزجاج في بؤرة التركيز في مركز مجال الرؤية لكل من أهداف التكبير المنخفض والتكبير العالي باستخدام مناور دقيق آلي (الشكل 3).
  4. تحت التكبير المنخفض ، قم بتقريب قطب التسجيل من الملصق باستخدام معالج دقيق آلي ثان.
  5. تحت التكبير العالي ، أدخل قطب التسجيل في قاعدة حساس الذوق باستخدام المحول الدقيق الميكانيكي حتى يسمع صوت نشاط إطلاق الخلايا العصبية من إخراج الصوت لنظام IDAC.
  6. بمجرد إنشاء إشارة مستقرة ، ابدأ في تسجيل الإشارة باستخدام البرنامج الذي يأتي مع نظام IDAC (الشكل 4A-D). لبدء التسجيل ، اضغط على زر بدء التسجيل.
  7. أحضر طرف الشعيرات الدموية الزجاجية المحفزة لتغطية طرف طعم sensillum باستخدام مناور آلي.
  8. لإنهاء التحفيز ، قم بإزالة الشعيرات الدموية للتحفيز الزجاجي من sensillum باستخدام المناور الآلي.
  9. حدد بداية ونهاية التحفيز يدويا باستخدام دواسة. يتم توصيل الدواسة ب IDAC ، ويتم تسهيل اتصالها بالبرنامج من خلال IDAC لتحديد بداية / نهاية التحفيز.

8. التحليل

  1. استخدم الوظائف المختلفة للبرنامج الذي يأتي مع نظام IDAC لفرز مجموعات الارتفاع حسب السعة (عندما يكون ذلك ممكنا) وتحليل ديناميكيات الاستجابة.
    1. لحساب المسامير ، انقر بزر الماوس الأيسر على تسجيل الاهتمام ، وإظهار نافذة للاختيار من بينها. اختر إلى المسامير، وابدأ نافذة أخرى باسم تحويل الموجات إلى مسامير. أدخل اسما في الحقل جديد ، ثم اضغط على الزر موافق ( OK ) .
    2. يؤدي إدخال الاسم في الحقل جديد في الخطوة 8.1.1 إلى طريقة عرض الرسم البياني للسعة . اختر السعة المراد عدها، ثم أغلق طريقة العرض هذه. انقر بزر الماوس الأيسر لإضافة عداد.
    3. افحص المسامير يدويا لتأكيد الاستنتاجات بناء على التحليل باستخدام البرنامج.
      ملاحظة: يسمح البرنامج أيضا بتصدير البيانات بتنسيقات مختلفة لمزيد من التحليل.

النتائج

يوضح الشكل 4 أ طفرات عفوية تنشأ من الحس. وهي تنقسم إلى فئتين بناء على السعة، حيث تستمد المسامير الأكبر من الخلية العصبية الحساسة للمركبات المريرة، والارتفاعات الأصغر من الخلية العصبية التي تستجيب للسكريات. تم تأكيد العلاقة بين سعة السنبلة والخصوصية الوظيفية من خلال التجا?...

Discussion

في التسجيلات من بعض أنواع الحساسية، قد يكون من الصعب التمييز بين طفرات الخلايا العصبية المختلفة. على سبيل المثال ، تنتج الخلايا العصبية السكرية والخلايا العصبية الحسية الميكانيكية في S و I sensilla طفرات ذات سعات مماثلة ، مما يجعل من الصعب تمييزها 4,14. نجد أن است?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

نشكر زينة بيرمان على الدعم ، وليزا بايك على التعليقات على المخطوطة ، وأعضاء آخرين في مختبر كارلسون للمناقشة. تم دعم هذا العمل منحة المعاهد الوطنية للصحة K01 DC020145 إلى H.K.M.D ؛ وتمنح المعاهد الوطنية للصحة R01 DC02174 و R01 DC04729 و R01 DC011697 إلى J.R.C.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
MicroscopeOlympusBX51WIequipped with a 50X objective (LMPLFLN 50X, Olympus) and 10X eyepieces. 
Antivibration TableTMC63-7590E
motorized MicromanipulatorsHarvard Apparatus and Märzhäuser MicromanipulatorsMicromanipulator PM 10 Piezo Micromanipulator
manual MicromanipulatorsMärzhäuser MicromanipulatorsMM33 Micromanipulator
Magnetic standsENCOModel #625-0930
Reference  and recording Electrode HolderOckenfels Syntech GmbH
Stimulus glass capillary HolderOckenfels Syntech GmbH
Universal Single Ended ProbeOckenfels Syntech GmbH
4-CHANNEL USB ACQUISITION CONTROLLER , IDAC-4Ockenfels Syntech GmbH
Stimulus ControllersOckenfels Syntech GmbHStimulus Controller CS 55
Personal ComputerDellVostroCheck for compatibility with digital acquisition system and software
Tungsten RodA-M SystemsCat#716000
Aluminum Foil and/or Faraday CageElectromagnetic noise shielding
Borosilicate Glass CapillariesWorld Precision Instruments1B100F-4
Pipette PullerSutter Instrument CompanyModel P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller
StereomicroscopeOlympusVMZ 1x-4xFor fly preparation
p200 Pipette TipsGeneric
Microloader tips EppendorfE5242956003
1 ml SyringeGeneric
Crocodile clips
Power TransformersSTACO ENERGY PRODUCTSSTACO 3PN221BAssembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh
Modeling ClayGeneric
ForcepsGeneric
Plastic TubingSaint GobainTygon S3™ E-3603
Standard culture vialsArchon ScientificNarrow 1-oz polystyrene vails, each with 10 mL of glucose medium, preloaded with cellulose acetate plugs
Berberine chloride (BER)Sigma-AldrichCat# Y0001149
Denatonium benzoate (DEN)Sigma-AldrichCat# D5765
N,N-Diethyl-m- toluamide (DEET)Sigma-AldrichCat# 36542

References

  1. Joseph, R. M., Carlson, J. R. Drosophila chemoreceptors: a molecular interface between the chemical world and the brain. Trends Genet. 31 (12), 683-695 (2015).
  2. Montell, C. Drosophila sensory receptors-a set of molecular Swiss Army Knives. Genetics. 217 (1), 1-34 (2021).
  3. Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila. Curr Biol. 30 (1), 17-30 (2020).
  4. Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
  5. He, Z., Luo, Y., Shang, X., Sun, J. S., Carlson, J. R. Chemosensory sensilla of the Drosophila wing express a candidate ionotropic pheromone receptor. PLoS Biol. 17 (5), e2006619 (2019).
  6. Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila. J Neurosci. 34 (21), 7148-7164 (2014).
  7. Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. J Morphol. 150 (2), 327-341 (1976).
  8. Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. J Neurobiol. 61 (3), 333-342 (2004).
  9. Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res. 304 (3), 423-437 (2001).
  10. Siddiqi, O., Rodrigues, V. Genetic analysis of a complex chemoreceptor. Basic Life Sci. 16, 347-359 (1980).
  11. Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
  12. Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a clade of ionotropic receptors are candidate taste and pheromone receptors. Neuron. 83 (4), 850-865 (2014).
  13. Sánchez-Alcañiz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nat Commun. 9 (1), 4252 (2018).
  14. Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Diverse mechanisms of taste coding in Drosophila. Sci Adv. 9 (46), (2023).
  15. Chyb, S., Dahanukar, A., Wickens, A., Carlson, J. R. Drosophila Gr5a encodes a taste receptor tuned to trehalose. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 14526-14530 (2003).
  16. Dahanukar, A., Lei, Y. T., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. Two Gr genes underlie sugar reception in Drosophila. Neuron. 56 (3), 503-516 (2007).
  17. Delventhal, R., Carlson, J. R. Bitter taste receptors confer diverse functions to neurons. Elife. 5, e11181 (2016).
  18. Dweck, H. K. M., Talross, G. J. S., Luo, Y., Ebrahim, S. A. M., Carlson, J. R. Ir56b is an atypical ionotropic receptor that underlies appetitive salt response in Drosophila. Curr Biol. 32 (8), 1776-1787 (2022).
  19. Hiroi, M., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Differentiated response to sugars among labellar chemosensilla in Drosophila. Zoolog Sci. 19 (9), 1009-1018 (2002).
  20. Jeong, Y. T., et al. An odorant-binding protein required for suppression of sweet taste by bitter chemicals. Neuron. 79 (4), 725-737 (2013).
  21. Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (35), 14110-14115 (2007).
  22. Jiao, Y., Moon, S. J., Wang, X., Ren, Q., Montell, C. Gr64f is required in combination with other gustatory receptors for sugar detection in Drosophila. Curr Biol. 18 (22), 1797-1801 (2008).
  23. Kim, S. H., et al. Drosophila TRPA1 channel mediates chemical avoidance in gustatory receptor neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8440-8445 (2010).
  24. Lacaille, F., et al. An inhibitory sex pheromone tastes bitter for Drosophila males. PLoS One. 2 (7), e661 (2007).
  25. Lee, Y., et al. Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine. J Neurosci. 32 (4), 1429-1435 (2012).
  26. Lee, Y., Kim, S. H., Montell, C. Avoiding DEET through insect gustatory receptors. Neuron. 67 (4), 555-561 (2010).
  27. Lee, Y., Moon, S. J., Montell, C. Multiple gustatory receptors required for the caffeine response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (11), 4495-4500 (2009).
  28. Lee, Y., Moon, S. J., Wang, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for strychnine sensation. Chem Senses. 40 (7), 525-533 (2015).
  29. Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. J Neurobiol. 56 (2), 139-152 (2003).
  30. Moon, S. J., Köttgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. A taste receptor required for the caffeine response in vivo. Curr Biol. 16 (18), 1812-1817 (2006).
  31. Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship. Current Biology. 19, 1623-1627 (2009).
  32. Rimal, S., et al. Mechanism of acetic acid gustatory repulsion in Drosophila. Cell Rep. 26 (6), 1432-1442 (2019).
  33. Shim, J., et al. The full repertoire of Drosophila gustatory receptors for detecting an aversive compound. Nat Commun. 6, 8867 (2015).
  34. Xiao, S., Baik, L. S., Shang, X., Carlson, J. R. Meeting a threat of the Anthropocene: Taste avoidance of metal ions by Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (25), e2204238119 (2022).
  35. Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
  36. Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J Vis Exp. (84), e51355 (2014).
  37. Marella, S., et al. Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category and behavior. Neuron. 49 (2), 285-295 (2006).
  38. Thorne, N., Amrein, H. Atypical expression of Drosophila gustatory receptor genes in sensory and central neurons. J Comp Neurol. 506 (4), 548-568 (2008).
  39. Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K. Taste representations in the Drosophila brain. Cell. 117 (7), 981-991 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 205

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved