Registro de bases: una técnica para analizar las respuestas de las neuronas gustativas en Drosophila

Resumen

Un método de registro electrofisiológico poco utilizado, el registro de base, permite el análisis de las características de la codificación del gusto que no pueden ser examinadas por los métodos convencionales de registro. El registro de la base también permite el análisis de las respuestas gustativas a estímulos hidrofóbicos que no pueden estudiarse con los métodos electrofisiológicos tradicionales.

Resumen

Los insectos saborean el mundo exterior a través de pelos gustativos, o sensilla, que tienen poros en sus puntas. Cuando un sensillum entra en contacto con una fuente potencial de alimento, los compuestos de la fuente de alimento entran a través del poro y activan las neuronas internas. Durante más de 50 años, estas respuestas se han registrado utilizando una técnica llamada registro de propinas. Sin embargo, este método tiene limitaciones importantes, incluida la incapacidad de medir la actividad neuronal antes o después del contacto con el estímulo y el requisito de que los saborantes sean solubles en soluciones acuosas. Describimos aquí una técnica que denominamos grabación base, que supera estas limitaciones. El registro de bases permite medir la actividad de las neuronas gustativas antes, durante y después del estímulo. Por lo tanto, permite un análisis exhaustivo de las respuestas OFF que ocurren después de un estímulo gustativo. Se puede utilizar para estudiar compuestos hidrofóbicos como las feromonas de cadena larga que tienen una solubilidad muy baja en agua. En resumen, el registro de bases ofrece las ventajas de la electrofisiología de un solo sensillum como medio para medir la actividad neuronal (alta resolución espacial y temporal, sin necesidad de herramientas genéticas) y supera las limitaciones clave de la técnica tradicional de registro de puntas.

Introducción

Los insectos, incluidas las moscas drosófilas, están dotados de un sofisticado sistema de sabor que les permite extraer información química compleja de su entorno. Este sistema les permite discernir la composición química de diversas sustancias, distinguiendo entre las que son nutritivas y las que son dañinas ^1,2.

En el núcleo de este sistema se encuentran estructuras especializadas conocidas como pelos gustativos o sensilla, ubicadas estratégicamente en varias partes del cuerpo. En las moscas drosófilas, estas sensilas se encuentran en el labelo, que es el principal órgano gustativ....

Protocolo

El siguiente protocolo cumple con todas las pautas de cuidado animal de la Universidad de Yale.

1. Moscas

1. Colocar de 10 a 15 moscas recién emergidas en viales de cultivo estándar frescos a 25 °C y 60% de humedad relativa en un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h.
2. Use moscas cuando tenga de 3 a 7 días de edad.

2. Estímulos quimiosensoriales

1. Obtener estímulos quimiosensoriales de la más alta pureza disponible. Guárdelos según lo recomendado por el proveedor hasta su uso.
2. Disuelva los estímulos quimiosensoriales y diluya hasta las concentr....

Discusión

En las grabaciones de algunos tipos de sensilla, puede ser difícil diferenciar los picos de las diferentes neuronas. Por ejemplo, las neuronas de azúcar y las neuronas mecanosensoriales de las sensillas S e I producen picos de amplitudes similares, lo que dificulta su distinción ^4,14. Encontramos que el uso de un electrodo registrador de tungsteno muy afilado reduce la activación de la neurona mecanosensorial, al igual que la colocación juiciosa del electrod.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope	Olympus	BX51WI	equipped with a 50X objective (LMPLFLN 50X, Olympus) and 10X eyepieces.
Antivibration Table	TMC	63-7590E
motorized Micromanipulators	Harvard Apparatus and Märzhäuser Micromanipulators	Micromanipulator PM 10 Piezo Micromanipulator
manual Micromanipulators	Märzhäuser Micromanipulators	MM33 Micromanipulator
Magnetic stands	ENCO	Model #625-0930
Reference  and recording Electrode Holder	Ockenfels Syntech GmbH
Stimulus glass capillary Holder	Ockenfels Syntech GmbH
Universal Single Ended Probe	Ockenfels Syntech GmbH
4-CHANNEL USB ACQUISITION CONTROLLER , IDAC-4	Ockenfels Syntech GmbH
Stimulus Controllers	Ockenfels Syntech GmbH	Stimulus Controller CS 55
Personal Computer	Dell	Vostro	Check for compatibility with digital acquisition system and software
Tungsten Rod	A-M Systems	Cat#716000
Aluminum Foil and/or Faraday Cage			Electromagnetic noise shielding
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-4
Pipette Puller	Sutter Instrument Company	Model P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller
Stereomicroscope	Olympus	VMZ 1x-4x	For fly preparation
p200 Pipette Tips			Generic
Microloader tips	Eppendorf	E5242956003
1 ml Syringe			Generic
Crocodile clips
Power Transformers	STACO ENERGY PRODUCTS	STACO 3PN221B	Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh
Modeling Clay			Generic
Forceps			Generic
Plastic Tubing	Saint Gobain	Tygon S3™ E-3603
Standard culture vials	Archon Scientific		Narrow 1-oz polystyrene vails, each with 10 mL of glucose medium, preloaded with cellulose acetate plugs
Berberine chloride (BER)	Sigma-Aldrich	Cat# Y0001149
Denatonium benzoate (DEN)	Sigma-Aldrich	Cat# D5765
N,N-Diethyl-m- toluamide (DEET)	Sigma-Aldrich	Cat# 36542